Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
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Nous remercions le personnel de base du Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology pour les soins aux animaux. Cette recherche a été soutenue en partie par les subventions U54GM104940 (JPK) et KL2TR003097 (LAG) de l’Institut national de la santé. Toutes les expériences et procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.

Les approches d’évaluation de la respiration mitochondriale dans le cancer ont été largement limitées aux modèles in vitro 13,14,15,16. Un certain succès a été obtenu dans la mesure de la respiration mitochondriale dans les tumeurs en utilisant la perméabilisation chimique6,7,17, mais il n’existe pas d’approche uniforme et de référence qui puisse être universellement appliquée et comparée à tous les types de tumeurs. De plus, le manque d’analyse et de rapports cohérents des données limite la généralisabilité et la reproductibilité des données. La méthode décrite ici fournit une approche simple et relativement rapide pour mesurer la respiration mitochondriale18 dans les préparations mitochondriales à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîchement excisées. Les tumeurs ont été cultivées à partir de cellules cancéreuses mammaires murines Luminal B, ERα-négatives EO771 implantées orthotopiquement19.
La diligence et le soin apportés à la manipulation des tissus amélioreront considérablement la précision et la normalisation des taux de consommation d’oxygène. Les tissus et les mitochondries peuvent être facilement endommagés si l’échantillon n’est pas conservé au froid, n’est pas systématiquement immergé dans un milieu de conservation ou est trop manipulé, ce qui entraîne une routine sous-optimale et des taux OXPHOS. De plus, le poids humide précis du tissu homogénéisé est d’une importance cruciale car il s’agit de la principale méthode de normalisation. D’autres méthodes de normalisation peuvent être envisagées, telles que les protéines totales ou les marqueurs spécifiques mitochondriaux, tels que l’activité de la citrate synthase20. De plus, l’hétérogénéité tissulaire devra être abordée, avec des décisions sur les régions tumorales à inclure dans les expériences faites a priori. Le tissu nécrotique, fibrotique et conjonctif peut ne pas s’homogénéiser et / ou bien respirer et doit être évité à moins de tester intentionnellement ces régions tumorales. Notamment, la tumeur peut être très collante en fonction du type et de la région d’excision, ce qui rend le pesage et le transfert précis plus difficiles. Le nombre d’AVC utilisés pour les homogénéisations doit être optimisé pour assurer une préparation complète des mitochondries tout en atténuant les dommages aux membranes mitochondriales externes.
Pour améliorer la précision et la reproductibilité, nous recommandons d’effectuer des expériences d’optimisation pour le nombre de coups pour la préparation de l’homogénat, la concentration tissulaire et les concentrations de substrat, de découpleur et d’inhibiteur. Les études peuvent comparer le nombre différent d’accidents vasculaires cérébraux et comment ils correspondent à la réponse à l’ajout de cytochrome c dans l’étude ainsi que la capacité respiratoire mitochondriale maximale 21. Bien qu’il y ait une acceptation générale que moins de réponse au cytochrome c est meilleure, car une augmentation de la consommation d’oxygène après l’ajout du cytochrome c peut indiquer des dommages à la membrane mitochondriale externe, il n’y a pas de norme d’or quant à ce que ce seuil est pour chaque tissu et devrait être étudié expérimentalement pour s’assurer que le tissu n’est pas surchargé ou sous-préparé. Dans ce tissu tumoral, il a été constaté qu’une réponse au cytochrome c inférieure à ~ 30% n’altérait pas la fonction respiratoire. L’utilisation du cytochrome c devient essentielle pour une quantification précise de la capacité respiratoire si le test est positif. Dans ce cas, l’addition reconstitue le cytochrome endogène c, qui, s’il est épuisé, provoquera une sous-estimation de la fréquence respiratoire.
Les expériences de titrage de concentration tissulaire peuvent être effectuées sur une gamme de concentrations réalisables et, idéalement, seraient effectuées avec des SUIT qui seront étudiées au cours de l’étude. La capacité respiratoire varie selon le type de tumeur et la composition. Ainsi, les tumeurs denses avec des mitochondries ou une capacité respiratoire élevée nécessiteront des concentrations plus faibles (0,5-5 mg / mL). Les tumeurs avec peu de mitochondries ou une faible capacité respiratoire nécessiteront des concentrations plus élevées (7-12 mg / mL). De plus, les SUIC qui sont longs ou qui ont des substrats très consommés peuvent nécessiter moins de tissu pour empêcher la réoxygénation de la chambre ou la limitation de l’ADP. Certains tissus auront une relation linéaire dans la consommation d’oxygène, tandis que d’autres montreront une sensibilité améliorée et une oxydation maximale à certaines plages de concentration. La concentration tissulaire choisie doit être optimisée pour maximiser le flux d’oxygène tout en limitant le nombre d’événements de réoxygénation. De plus, il est souvent préférable de surestimer le besoin ou de viser l’extrémité supérieure de la plage de concentration. Les inhibiteurs, qui sont essentiels à la quantification des flux respiratoires, sont plus précis lorsqu’ils sont utilisés dans de plus grands bassins de mitochondries.
Une autre considération essentielle est la concentration des médicaments utilisés pendant les protocoles. Les changements dans la concentration d’homogénat peuvent modifier les concentrations de substrats, de découpleurs et d’inhibiteurs nécessaires à la réponse maximale. Ainsi, une fois la plage de concentration optimale choisie, une expérience testant les doses requises pour le protocole SUIT doit être effectuée. D’autres ADP peuvent être ajoutés pour s’assurer que les concentrations d’adénylate ne se limitent pas aux flux respiratoires. Les découpleurs chimiques tels que le FCCP ou le CCCP inhiberont la respiration à des concentrations plus élevées22. En tant que tel, il est essentiel de titrer en petites quantités pour révéler le taux maximal atteint. Les inhibiteurs, tels que la roténone et l’antimycine A, sont mieux utilisés lorsqu’ils sont saturés lors de la première injection. Bien que les concentrations optimales aient été déterminées dans des expériences préliminaires, nous avons également observé des différences liées au traitement dans la réponse aux inhibiteurs et ajoutons donc souvent une injection supplémentaire d’inhibiteurs pour démontrer une inhibition maximale, car les taux résultants servent de base à la quantification. L’inhibition chimique de l’ascorbate/TPMD est essentielle pour une réduction analytique précise car le TMPD subit une autooxydation23. Nous avons contrôlé l’auto-oxydation de l’ascorbate/TMPD/cytochrome c par l’ajout d’azoture de sodium, un inhibiteur établi du CIV. Pour les études Km, l’ajout de roténone en présence de succinate seul empêche l’accumulation d’oxaloacétate qui peut inhiber l’activité de la succinate déshydrogénase à de faibles concentrations24. Le volume et la concentration d’ADP dépendent fortement de la sensibilité des mitochondries à la combinaison de substrats dominante. Les préparations mitochondriales qui sont très sensibles à l’ADP nécessiteront des concentrations de départ plus faibles. De plus, des produits chimiques validés et une préparation appropriée des médicaments avec une attention particulière au pH, à la sensibilité à la lumière, le cas échéant, et à la température de stockage sont essentiels pour des expériences réussies.
La mise en place des instruments et les soins de routine sont d’une importance cruciale pour le succès de ces expériences. Un nettoyage adéquat et approprié des chambres est essentiel pour la reproductibilité et la prévention de la contamination biologique, protéique, inhibitrice ou découpleuse. Les électrodes de type Clark et les systèmes O2k utilisent des chambres de réaction en verre, ce qui représente un avantage de coût significatif par rapport aux systèmes à base de plaques qui reposent sur des consommables. Cependant, les chambres de verre doivent être vigoureusement nettoyées et peuvent être une source de contamination par les inhibiteurs dans les études ultérieures. L’incubation avec des échantillons riches en mitochondries pendant le processus de lavage (mitochondries isolées du cœur ou du foie, par exemple) peut réduire le risque de contamination expérimentale et est recommandée en plus des procédures de dilution et de lavage à base d’alcool. Si des études consécutives sont menées, le nettoyage à l’éthanol et aux mitochondries minimise la possibilité de contamination par les inhibiteurs. L’étalonnage du capteur d’oxygène est recommandé avant chaque expérience afin d’obtenir des mesures précises de la respiration par rapport à la pression partielle d’oxygène dominante. Si plusieurs étalonnages ne sont pas possibles, un étalonnage par jour peut suffire si la concentration d’oxygène reste stable et constante après la procédure de lavage.
Les procédures décrites ci-dessus utilisent l’instrument Oroboros O2k pour mesurer la consommation d’oxygène dans le tissu tumoral dans les 4 heures suivant l’excision tumorale en utilisant une solution de préservation et un milieu respiratoire préalablement conçus et optimisés25,26,27. Plusieurs paramètres de ce protocole peuvent être modifiés pour des applications ultérieures. La configuration et l’étalonnage de l’instrument, les homogénéisateurs utilisés pour la préparation des tissus et la concentration optimale d’oxygène de l’homogénat et de la chambre peuvent tous être adaptés pour une utilisation sur d’autres instruments présentant un potentiel de surveillance de l’oxygène. Par exemple, les chambres étaient légèrement surchargées lors de l’ajout d’homogénat, et donc lorsque la chambre est complètement fermée, le capillaire de la chambre reste plein. Cela consommera un peu d’oxygène dans la chambre, mais avec l’optimisation de la concentration de l’échantillon, nous pouvons tenir compte de cette consommation pour déterminer le niveau d’oxygène par le départ. Alternativement, l’échantillon peut être autorisé à s’équilibrer à l’oxygène ambiant avant la fermeture de la chambre, mais cela augmentera souvent le temps avant le début de l’expérience et retardera l’ajout de substrats. Alors que les homogénéisateurs utilisés dans ce protocole sont largement accessibles, d’autres techniques d’homogénéisation commerciales pourraient être utilisées, comme un broyeur de tissus ou un homogénéisateur automatisé28.
En outre, la préparation des tissus et les procédures d’instruments peuvent être utilisées avec un certain nombre de SUIT différents pour étudier le contrôle respiratoire par une diversité d’états de couplage et de contrôle des voies29. Ces protocoles SUIT ont été développés pour mesurer la capacité fonctionnelle, et par conséquent, la contribution des substrats endogènes potentiels n’a aucun impact sur la mesure de la capacité. Nous rendons compte analytiquement de la consommation d’oxygène non mitochondrial et/ou de la consommation résiduelle de l’homogénat par soustraction de l’antimycine A-roténone, ou des taux insensibles à l’azoture de sodium, selon le cas. Les mitochondries peuvent rester viables dans BIOPS ou des solutions de préservation construites de manière similaire pendant de longues périodes de temps (>24 h) en fonction du type de tissu et de l’intégrité30,31. Des études peuvent être effectuées à l’avance pour déterminer les limites de stockage temporelles, car OXPHOS de certains substrats peut avoir des limitations différentes. Ceci est essentiel si l’expérience ne peut pas être effectuée dans les heures suivant l’excision / biopsie tissulaire. 37°C est une température optimale et physiologique pour l’évaluation de la fonction respiratoire dans la plupart des systèmes mammifères. Toutefois, si la température d’essai semble interférer avec l’évaluation32,des études comparatives peuvent être menées sur une large plage de températures (25-40 °C) pour assurer une réactivité adéquate. Des contraintes instrumentales peuvent limiter la capacité de mener de telles études.
Les principales limites de la méthode décrite ci-dessus sont 1) le potentiel de dommages aux mitochondries par homogénéisation mécanique, 2) la présence d’ATPases ou d’autres produits biochimiques subcellulaires dans les préparations d’homogénéate qui peuvent interférer avec la détermination simultanée de l’ATP ou d’autres variables d’intérêt et peuvent nécessiter des méthodes de correction supplémentaires ou l’utilisation d’inhibiteurs33 , et 3) l’évaluation de nombreux échantillons et/ou de plusieurs SUIT par échantillon prend beaucoup de temps, car un instrument peut accueillir deux expériences à la fois et nécessite un nettoyage et une mise en place entre les expériences successives. Des expériences d’optimisation et une préparation cohérente des échantillons peuvent minimiser les dommages mitochondriaux importants qui contribueraient à des données incohérentes.
L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes / alternatives est l’amélioration de la faisabilité par rapport à la quantité de matière première, le défi d’isoler les mitochondries ou le défi technique de la perméabilisation des tissus. La préparation des homogénats est plus rapide, l’oxygène n’est pas aussi limitant et est moins sensible à la variabilité entre le personnel que les tissus perméabilisés. Il est important de noter que presque tous les types d’échantillons conviennent à la préparation d’homogénats, ce qui permet une analyse comparative des tissus. La respirométrie à haute résolution est la mesure de référence des OXPHOS et et ET mitochondriaux mitochondriaux. L’application de cette méthode dans la recherche préclinique et clinique sur le cancer a la capacité d’étendre les investigations in vitro actuelles aux études ex vivo. En outre, il offre des applications potentielles dans les milieux cliniques et diagnostiques.

Toutes les cellules sont intimement liées par leur besoin de produire et de consommer de l’adénosine triphosphate (ATP), la monnaie d’énergie moléculaire. Comme les mutations cellulaires donnent lieu à la formation de tumeurs, les mitochondries assurent la survie grâce à la diversification de la production d’énergie qui se distingue souvent phénotypiquement des tissus non cancéreux1,2,3. En tant que tel, il existe un besoin critique de profilage rapide et profond de la fonction respiratoire mitochondriale afin de faciliter la classification du type de tumeur, de l’initiation du cancer, de la progression et de la réponse au traitement.
Les fonctions respiratoires des échantillons de tissus excisés ne peuvent pas être évaluées intactes car les substrats primaires d’OXPHOS ne sont pas perméables aux cellules. Pour surmonter cette limitation, les mitochondries peuvent être préparées soit par isolement, perméabilisation chimique, soit par homogénéisation mécanique. L’isolement mitochondrial est longtemps considéré comme une référence pour l’évaluation de la fonction respiratoire. Cependant, il nécessite de grandes quantités de tissu, prend du temps et est à faible rendement avec un biais de sélection possible pour certaines fractions de mitochondries4. La perméabilisation consiste en une séparation mécanique et l’exposition de coupes de tissus ou de faisceaux de fibres à un détergent doux qui dégrade sélectivement la membraneplasmique 5. La perméabilisation est fréquemment utilisée dans les tissus striés tels que le muscle squelettique et cardiaque, car les faisceaux de fibres individuels peuvent être séparés. Par rapport à l’isolement, la perméabilisation donne plus de mitochondries dans leur environnement cellulaire natif et leur forme physique5. La perméabilisation a été appliquée avec succès dans d’autres tissus tels que la tumeur6,7 et le placenta8; cependant, la reproductibilité des préparations de fibres perméabilisées peut être difficile en raison de la consistance de la dissection et des besoins en oxygène pour surmonter les limitations de diffusion9. De plus, les fibres perméabilisées peuvent ne pas convenir à certains types de tumeurs densément cellulaires et hautement fibrotiques. Les homogénats tissulaires sont générés par perturbation mécanique de la membrane plasmique et sont similaires aux fibres perméabilisées en termes de rendement mitochondrial et d’intégrité10. Les homogénats tissulaires minimisent également les limites de la diffusion de l’oxygène et peuvent être facilement utilisés dans tous les types de tissus grâce à l’optimisation de la force mécanique11,12.
Ici, nous décrivons une méthode simple et rapide pour quantifier les taux de phosphorylation oxydative (OXPHOS) et la capacité de transfert d’électrons (ET) dans les homogénats de tumeurs solides fraîchement excisés. Le protocole est conçu de manière optimale pour évaluer les tissus frais à l’aide du respiromètre haute résolution Oxygraph-2k (O2k), qui nécessite une connaissance préalable de la configuration instrumentale et de l’étalonnage, mais peut être adapté de la même manière à l’aide de n’importe quelle électrode de type Clark, analyseur Seahorse ou lecteur de plaques. Le protocole peut être appliqué de manière reproductible à travers les espèces et les types de tumeurs, ainsi que adapté pour évaluer une diversité de voies ET mitochondriales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

Les mitochondries sont essentielles à l’apparition et à la progression du cancer par la production d’énergie, la régulation réactive des espèces de l’oxygène et la synthèse des macromolécules. Les adaptations génétiques et fonctionnelles des mitochondries à l’environnement tumoral entraînent un potentiel prolifératif et métastatique. L’avènement du séquençage de l’ADN et de l’ARN a éliminé les obstacles critiques à l’évaluation des médiateurs génétiques de la tumorigenèse. Cependant, à ce jour, les approches méthodologiques pour évaluer la fonction mitochondriale tumorale restent insaisissables et nécessitent des compétences techniques limitant la faisabilité, diminuant finalement la valeur diagnostique et pronostique dans les contextes expérimentaux et cliniques. Ici, nous décrivons une méthode simple et rapide pour quantifier les taux de phosphorylation oxydative (OXPHOS) et la capacité de transfert d’électrons (ET) dans les homogénats tumoraux solides fraîchement excisés en utilisant la respirométrie à haute résolution. Le protocole peut être appliqué de manière reproductible à travers les espèces et les types de tumeurs, ainsi que adapté pour évaluer une diversité de voies ET mitochondriales. En utilisant ce protocole, nous démontrons que les souris porteuses d’un cancer mammaire luminal B présentent une respiration défectueuse liée au nicotinamide adénine dinucléotide et une dépendance au succinate pour générer de l’adénosine triphosphate via OXPHOS.

Les études initiales ont révélé que les tumeurs à EO771 étaient faiblement oxydatives et nécessitaient donc des concentrations élevées d’homogénat pour une évaluation adéquate du flux d’O2. Des expériences d’optimisation ont été menées pour déterminer la plage de concentration optimale d’homogénat tissulaire pour l’étude. Les homogénats tumoraux ont d’abord été préparés à 40 mg/mL, puis dilués linéairement. Le flux d’O2 normalisé à la masse tissulaire était cohérent entre les concentrations(figures 1A-D). Il a été observé que 40 mg/mL entraînaient un épuisement rapide de l’oxygène et ne convenaient pas à l’expérimentation(figure 1A). La consommation d’oxygène a considérablement ralenti avec 30 mg/mL et 20 mg/mL mais a tout de même diminué rapidement en peu de temps en l’absence de substrats ou d’ADP(Figure 1B,C). La concentration de 10 mg/mL a donné lieu au taux optimal de consommation d’oxygène(figure 1D)qui permettrait de prendre en charge un protocole SUIT plus long de 90 minutes.
Un protocole SUIT a été utilisé pour évaluer l’OXPHOS et l’ET liés au NADH et au succinate, ainsi que l’activité CIV (Figure 2A). Le pyruvate et le malate ont été ajoutés à l’homogénat tissulaire en l’absence d’ADP pour entraîner une fuite (L) à travers le NADH. L’ADP saturé a ensuite été ajouté pour entraîner un maximum d’OXPHOS (P) lié au NADH, suivi de l’ajout de glutamate. Le cytochrome c a ensuite été ajouté pour assurer l’intégrité de la membrane externe; l’augmentation de la fréquence respiratoire était inférieure à 20 % dans tous les échantillons(figure 2B). Compte tenu de la très faible réponse aux substrats liés au NADH, la libération de cytochrome c a également été évaluée en présence de succinate et de roténone et a observé une stimulation minimale du cytochrome c (Figure 2B). Fait intéressant, OXPHOS lié au NADH était négligeable dans les tumeurs à EO771(Figure 2C). Le succinate a ensuite été ajouté en présence de pyruvate, de malate et de glutamate pour stimuler le flux d’électrons à travers la succinate déshydrogénase. Le FCCP a ensuite été titré pour entraîner le flux maximal d’électrons (E), ce qui a révélé que dans les tumeurs EO771, la phosphorylation plutôt que l’oxydation limitait la respiration(Figure 2C). La roténone et l’antimycine A ont ensuite été titrées pour inhiber les complexes I et III, respectivement. L’ascorbate et le TMPD ont ensuite été ajoutés pour entraîner un flux maximal d’électrons à travers le CIV, qui est ensuite inhibé par l’azoture de sodium. Le tableau 1 illustre les équations analytiques de réduction des données brutes (tableau 2) pour quantifier les paramètres respiratoires tracés à la figure 2C. Dans l’ensemble, les profils respiratoires homogénéisés de la tumeur(Figure 2C)sont similaires à ceux des cellules EO771 perméabilisées par la digitonine non implantées (Figure 2D), à l’exception du transfert maximal d’électrons diminué soutenu par des substrats liés à la N et au S dans la tumeur.
Étant donné que la respiration liée au NADH était négligeable, la cinétique respiratoire du succinate a été évaluée par des titrages progressifs de l’ADP sous-saturé jusqu’à ce que le taux maximal (VMAX)soit atteint(Figure 3A,3B). La concentration demi-maximale (KM)d’ADP en présence de succinate + roténone était de 37,5 μM, tandis que le VMAX était d’environ 10,5 pmol/s/mg(Figure 3C). Ainsi, malgré des taux d’oxydation relativement faibles, les tumeurs EO771 étaient très sensibles à l’ADP et maintenaient la synthèse de l’ATP à des concentrations d’ADP relativement faibles.
La sélection des régions appropriées des données brutes pour l’extraction est essentielle à la reproductibilité des expériences et à la quantification précise. Pour le cytochrome c, une marque doit être sélectionnée à l’état d’équilibre immédiatement avant l’injection(Figure 4A, marque 1). Il y a souvent un artefact d’injection initiale qui peut être suivi d’une période de temps (environ 5-10 min) où le flux O2 n’est pas stable. L’évaluation de l’efficacité du cytochrome c se fait en faisant une sélection supplémentaire une fois que le fluxO2 s’est stabilisé(Figure 4A,marque 2). Les sélections après l’ajout de substrats, d’ADP ou de la plupart des inhibiteurs sont également effectuées après l’artefact d’injection et une fois que le flux d’O2 s’est stabilisé(Figure 4B). La sélection utilisée pour déterminer la respiration maximale non couplée se fait au pic d’augmentation obtenu lors du titrage du FCCP, qui n’est souvent pas la dernière injection faite (Figure 4C). La sélection pour le TMPD est faite après l’ajout de l’ascorbate et du TMPD et au pic de l’augmentation de la respiration (Figure 4D, marque 1). Juste après ce pic, l’inhibiteur, l’azoture de sodium, est ajouté, ce qui diminue rapidement la respiration mais a aussi souvent un artefact d’injection inférieur à la fréquence respiratoire inhibée(Figure 4D). La marque de l’inhibiteur est faite immédiatement après l’artefact d’injection (Figure 4D, marque 2). Le flux o2 ne se stabilisera généralement pas et continuera à diminuer.
Tableau 1 : Notation respiratoire et dérivation analytique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Caractéristiques de l’échantillon et des voies respiratoires des homogénats de tumeurs mammaires luminales B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Figure 1: Optimisation de la concentration en homogénat tumoral. FluxO2 (rouge) etO2 Concentration (bleu) dans les homogénats tumoraux mammaires préparés à (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL, et (D) 10 mg/mL. Thom : Respiration de l’homogénat tissulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Figure 2: Évaluation de la capacité OXPHOS et ET par respirométrie à haute résolution dans des homogénats tumoraux fraîchement excisés. (A) Graphique représentatif de la consommation d’oxygène (rouge) et des concentrations (bleu) au cours d’un substrat, inhibiteur, protocole de découpleur. PM: Pyruvate + Malate, D: ADP, G: Glutamate, c: Cytochrome c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Roténone, Ama: Antimycine A, Asc / TMPD: Ascorbate / Tétraméthyl-p-phénylènediamine. (B) Pourcentage d’augmentation du fluxo2 lors de l’ajout du cytochrome c. (C-D) Respiration soutenue par le malate, le pyruvate, le glutamate et le succinate en présence d’ADP, de FCCP et d’ascorbate/TMPD dans les homogénats tumoraux dérivés de l’EO771(C)et(D)les cellules perméabilisées à la digitonine EO771 non implantées. Thom: Respiration homogénéisée tissulaire; PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamate; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamate + Succinate; CIV: Complexe IV; -L : État de fuite ; -P : État de phosphorylation oxydative, -E : État de transfert d’électrons ; Lié à l’azote : fluxo2 soutenu par des combinaisons de substrats génératrices de NADH définies; Lié au NS : flux d’O2 soutenu par la convergence de combinaisons de substrats générés par le NADH et le succinate définis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Figure 3: Tumeurs mammaires EO771 présentant une sensibilité élevée à l’ADP (adénosine 5′-diphosphate). (A) Graphique représentatif de la consommation d’oxygène (rouge) et des concentrations (bleu) tout au long d’un protocole de titrage ADP lié à S. Thom: Respiration homogénéisée tissulaire; S/Pourriture : Succinate/Roténone ; D : ADP. (B) Respiration soutenue par le succinate en présence de roténone et des concentrations croissantes d’ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Taux maximal (VMAX)et demi-concentration maximale (KM)d’ADP en présence de succinate + roténone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Figure 4: Traçage représentatif illustrant la sélection de marques des flux d’O2 bruts pour l’extraction des données. (A) Cytochrome c sélection : sélection numéro 1 avant l’injection de Cytochrome c et sélection numéro 2 après l’injection lorsque le flux d’O2 s’est stabilisé. c Cytochrome c. (B) Sélection du substrat, de l’ADP et de l’inhibiteur : sélection numéro 1 après l’injection (succinate dans ce diagramme représentatif) où le fluxO2 s’est stabilisé. S : Succinate. (C) Sélection du découpleur: sélection numéro 1 au pic d’augmentation de la respiration pendant le titrage du découpleur. Dans ce diagramme de titrage FCCP représentatif, la troisième injection diminue légèrement la respiration et n’est donc pas utilisée pour la sélection. F : ACCP. (D) Sélection TMPD: sélection numéro 1 au pic d’augmentation de la respiration après les injections d’ascorbate et de TMPD. Sélection de l’azoture de sodium: sélection numéro 2 après l’artefact d’injection aiguë lorsque la respiration diminue initialement. As/Tm : Ascorbate/TMPD; Azd : Azide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Nous avons développé un protocole pratique et une approche analytique pour évaluer la phosphorylation oxydative mitochondriale et la capacité de transfert d’électrons dans les homogénats tumoraux frais. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier diverses fonctions mitochondriales qui contribuent à l’initiation, à la progression et à la réponse au traitement du cancer.

Détermination analytique de la fonction mitochondriale des homogénats tumoraux solides excisés

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Ce protocole décrit une méthode simple et rapide pour mesurer la fonction mitochondriale tumorale. Le protocole est largement applicable à l’oncologie translationnelle clinique et aidera à améliorer l’interprétation diagnostique et mécaniste du rôle des mitochondries dans l’apparition et la progression du cancer. Le principal avantage de cette technique est l’application de l’homogénéisation tissulaire pour simplifier la préparation et maximiser le rendement des mitochondries tout en atténuant les limites de la diffusion.Cette technique offre des applications potentielles dans les contextes cliniques et diagnostiques avec une évaluation quantitative de la fonction mitochondriale tumorale à l’aide de tissu tumoral fraîchement biopsié ou excisé. Commencez par placer un homogénéisateur en verre contenant un millilitre de milieu respiratoire mitochondrial, ou MiR05, dans un pilon en verre bien ajusté sur de la glace humide. Placez le tissu dans un millilitre de solution de préservation de biopsie, ou BIOPS, dans une boîte de Petri glacée.Coupez la tumeur en petits morceaux d’environ 5 à 10 milligrammes chacun et replacez les morceaux de tumeur restants dans 10 millilitres de BIOPS conservés sur la glace. Après avoir soigneusement tamponné les sections de tissu sur un papier filtre, placez-les sur un petit bateau de pesage goudronné en plastique et enregistrez le poids humide initial. Replacez les pièces inutilisées dans le tube conique de 10 millilitres de BIOPS pour une conservation continue.Immergez les sections de tissus dans un homogénéisateur glacé contenant du MiR05 et enregistrez le poids restant sur le bateau de pesée. À l’aide d’un pilon en verre avec une plage de clairance de 0,09 à 0,16 millimètre, perturbez doucement le tissu tumoral en effectuant cinq à sept coups vers le bas et vers le haut. Pour chaque coup, faites pivoter le pilon dans le sens des aiguilles d’une montre / dans le sens inverse des aiguilles d’une montre trois fois tout en poussant le pilon vers le bas, et trois fois supplémentaires tout en tirant le pilon vers le haut.Laissez le tissu se déposer au fond de l’homogénéisateur entre les coups, mais évitez d’amener le pilon complètement au-dessus du volume de liquide pour éviter la formation de mousse. Versez l’homogénat dans un tube conique de 15 millilitres et placez-le sur de la glace. Pipette un à trois millilitres de MiR05 frais sur le pilon et dans l’homogénéisateur pour laver tout homogénat de tissu restant.Versez le lavage MiR05 dans le tube conique contenant l’homogénat. Répétez cette étape deux à trois fois pour assurer le transfert complet de l’homogénat. Pour calculer avec précision la concentration d’homogénat tissulaire, inspectez soigneusement l’homogénéisateur et l’homogénat pour le reste de matériel non homogénéisé, qui comprend le tissu conjonctif.Pour retirer le matériau non homogénéisé de l’homogénéisateur qui ne peut pas être atteint avec une pince à épiler, après avoir ajouté MiR05 à l’homogénéisateur, aspirer le volume, y compris le tissu, avec une pipette et déplacer le contenu dans une boîte de Pétri. Retirez le matériau non homogénéisé déposé en gros morceaux au fond du tube conique de l’homogénat en les aspirant avec une pipette et placez-les sur le capuchon du tube conique. Retirez le tissu de la boîte de Petri ou du bouchon du tube conique avec une pince à épiler et épongez-le sur du papier filtre.Ajouter l’homogénat restant du capuchon du tube conique dans le tube conique. Boucher le tube, puis inverser pour mélanger. Réinspectez les homogénéisateurs et l’homogénéat pour tout matériau non homogénéisé supplémentaire, et répétez les étapes pour éliminer le matériau non homogénéisé si nécessaire.Peser et enregistrer la masse du matériau non homogénéisé récupéré de l’homogénéisateur. Inspectez la préparation de l’homogénat pour tout tissu grossièrement intact transféré, retirez les pièces non homogénéisées et pesez-les au besoin. Soustrayez le poids tissulaire récupéré du bateau de pesée, de l’homogénéisateur et de l’homogénat du poids humide initial pour calculer le poids final de l’échantillon.En utilisant le poids final de l’échantillon, ajoutez du MiR05 supplémentaire pour amener l’homogénat à la concentration souhaitée. Une fois l’homogénat pesé et préparé, procédez au dosage dès que possible. Conservez l’échantillon sur de la glace humide jusqu’à ce qu’il soit transféré à l’instrument.Une fois l’instrument étalonné et l’échantillon préparé, retirez les bouchons avec un mouvement de torsion et aspirez le MiR05 des chambres, en évitant la membrane exposée à l’intérieur de la chambre. Mélangez bien l’homogénat et ajoutez 2,25 millilitres de l’homogénat à la chambre. Supposons qu’un homogénat soit ajouté à plusieurs chambres, pipette un millilitre de l’homogénat à la fois dans chaque chambre tout en mélangeant l’homogénat pour assurer une distribution tissulaire égale.Cliquez sur F4 pour nommer et horodater l’événement, puis cliquez sur OK. Remplissez une seringue de 50 millilitres avec de l’oxygène provenant d’un réservoir d’oxygène avec un régulateur et un tube à gaz à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 18. Injectez l’oxygène directement dans les chambres pour les hyperoxygéner en environ 500 micromolaires d’oxygène.Insérez lâchement les bouchons et attendez de fermer jusqu’à ce que l’oxygène atteigne environ 480 micromolaires. Avec un mouvement de torsion, fermez lentement la chambre et laissez la respiration s’équilibrer pendant environ 15 à 20 minutes. Remplissez le capillaire central du bouchon avec MiR05 si nécessaire.Utilisez des microsyringes dédiées pour injecter des substrats, des découpleurs et des inhibiteurs dans des chambres entièrement fermées afin de nommer et d’horodater les événements pour chaque chambre en temps réel. Sélectionnez F6 pour ajuster la concentration en oxygène et les échelles négatives de pente d’oxygène au besoin. Après chaque injection, lavez la seringue trois fois dans de l’eau pour les composés solubles dans l’eau et à 70% d’éthanol pour les composés dissous à l’éthanol.Ajouter cinq microlitres de malate 0,8 molaire et procéder immédiatement à l’injection suivante. Lavez la seringue d’injection trois fois dans de l’eau. Ajoutez immédiatement cinq microlitres de pyruvate 1 molaire et attendez que la respiration se stabilise.Après avoir lavé la seringue, ajoutez 10 microlitres d’ADP à 0,5 molaire et attendez que la réponse aDP se stabilise. Lavez la seringue et ajoutez cinq microlitres de glutamate 2 molaires et attendez que la respiration se stabilise. Lavez la seringue, puis ajoutez cinq microlitres de cytochrome-C de 4 millimolaires et attendez que la respiration se stabilise.Après avoir lavé la seringue, ajoutez 20 microlitres de succinate 1 molaire et attendez que la respiration se stabilise. Titrer des incréments de 0,5 à 1 microlitre de FCCP de 1 millimolaire et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection. Continuez jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.Lavez la seringue d’injection trois fois dans de l’éthanol à 70 %. Ajouter deux microlitres de roténone 150 micromolaires et attendre que la respiration se stabilise. Ajoutez un autre microlitre de roténone pour vous assurer qu’il n’y a plus d’inhibition.S’il y a une diminution de la respiration, continuez avec des injections supplémentaires jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de la respiration, puis lavez la seringue d’injection trois fois dans de l’éthanol à 70%. Ajouter deux microlitres d’antimycine A de 125 micromolaires et attendre que la respiration se stabilise. Ajouter un autre microlitre d’antimycine A pour s’assurer qu’il n’y a plus d’inhibition.S’il y a une diminution de la respiration, continuez avec des injections supplémentaires jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de la respiration. Lavez la seringue trois fois avec de l’éthanol à 70%. Vérifiez la concentration en oxygène de la chambre.Si la concentration est inférieure à 125 micromolaires, réoxygéner dans l’air ambiant ou hyperoxygéner légèrement pour s’assurer que l’oxygène ne limite pas le flux respiratoire. Ajouter cinq microlitres d’ascorbate 0,8 molaire. Lavez la seringue trois fois dans de l’éthanol à 70 %.Ajoutez immédiatement 10 microlitres de TMPD 0,2 molaire et attendez une augmentation de la respiration. Après avoir lavé la seringue avec de l’éthanol, ajoutez 25 microlitres d’azoture de sodium à 4 molaires immédiatement lorsque le flux respiratoire de l’ascorbate TMPD plafonne. Terminez le en cliquant sur Fichier, Enregistrer et déconnecter.Il a été observé que 40 milligrammes par millilitre d’homogénat tissulaire entraînaient un épuisement rapide de l’oxygène. La consommation d’oxygène a considérablement ralenti avec 30 et 20 milligrammes par millilitre d’homogénat tissulaire, mais a tout de même diminué rapidement en peu de temps en l’absence de substrats ou d’ADP. La concentration de 10 milligrammes par millilitre d’homogénat tissulaire a entraîné un taux de consommation d’oxygène optimal.Un protocole SUIT a été utilisé pour évaluer la phosphorylation oxydative liée au NADH et au succinate et le transfert d’électrons, ainsi que l’activité du complexe IV. La libération de cytochrome C a été évaluée en présence de pyruvate et de malate, ou de succinate et de roténone, qui ont tous deux révélé que la préparation de l’homogénat n’endommageait pas les mitochondries. Il a également été constaté que la phosphorylation oxydative liée au NADH était négligeable dans les tumeurs EO771.Le titrage du FCCP pour conduire le flux maximal d’électrons a révélé que dans les tumeurs EO771, la phosphorylation, plutôt que l’oxydation, se limitait à la respiration. Les profils respiratoires homogénés de la tumeur étaient similaires à ceux des cellules EO771 non implantées et perméabilisées par la digitonine, à l’exception d’un transfert d’électrons maximal diminué soutenu par des substrats liés à N et S dans la tumeur. La cinétique respiratoire du succinate a ensuite été évaluée par des titrages progressifs de l’ADP sous-saturé jusqu’à ce que le taux maximal soit atteint.La concentration demi-maximale d’ADP en présence de succinate et de roténone était de 37,5 micromolaires, tandis que le taux maximal était d’environ 10,5 picomoles par seconde, par milligramme. Les instruments mis en place dans les soins de routine, ainsi que la manipulation des tissus, sont d’une importance cruciale pour le succès de ces expériences. En suivant ces procédures, d’autres approches spécifiques à la masse ou aux marqueurs de normalisation des taux peuvent être appliquées en fonction de la question de l’intérêt.Les mesures courantes comprennent la quantification des protéines totales et l’activité enzymatique de la citrate synthase, mais varient en fonction du système de modèle, de la conception statistique et de la question de recherche.

Research

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Recherche

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