Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Wir danken den Mitarbeitern des Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core für die Tierpflege. Diese Forschung wurde zum Teil durch die Zuschüsse des National Institute of Health U54GM104940 (JPK) und KL2TR003097 (LAG) unterstützt. Alle Experimente und Verfahren mit Tieren wurden vom Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+cancer+metabolism.">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).</li><li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells.">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth.">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Saks, V. A., et al., Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. , 81-100 (1998).</li><li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer.">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li><li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently.">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).</li><li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation.">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells,+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria.">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li><li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate.">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li><li>Hlozkov&#225;, K., Starkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells.">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).</li><li>Zhang, J., Zhang, Q., Haznadar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Metabolism: Methods and Protocols. , 353-363 (2019).</li><li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells.">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).</li><li>Sch&#246;pf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells.">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EO771,+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL/6+mice.">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328 (2020).</li><li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).</li><li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers.">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li><li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+radical,+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li><li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide.">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li><li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue:+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers.">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li><li>Gnaiger, E., Heldmaier, G., Klingenspor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+Cold.">Mitochondria in the Cold.</a> Life in the Cold. , 431-442 (2000).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2(high)+breast+cancer.">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).</li><li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain.">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).</li><li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures:+a+comparative+study+using+Drosophila.">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, (2021).</li><li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P/O+ratios.">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Atmung bei Krebs waren weitgehend auf die In-vitro-Modelle 13,14,15,16beschränkt. Einige Erfolge wurden bei der Messung der mitochondrialen Atmung in Tumoren mittels chemischer Permeabilisierung6,7,17erzielt, aber es gibt keinen einheitlichen Goldstandardansatz, der universell angewendet und über Tumorarten hinweg verglichen werden kann. Darüber hinaus hat das Fehlen einer konsistenten Datenanalyse und Berichterstattung die Generalisierbarkeit und Reproduzierbarkeit der Daten eingeschränkt. Die hier beschriebene Methode bietet einen einfachen, relativ schnellen Ansatz zur Messung der mitochondrialen Atmung18 in mitochondrialen Präparaten aus frisch ausgeschnittenen soliden Tumorproben. Tumore wurden aus orthotopisch implantierten murinen Luminal B, ERα-negativen EO771 Brustkrebszellengezüchtet 19.
Sorgfalt und Sorgfalt bei der Gewebehandhabung werden die Genauigkeit und Normalisierung der Sauerstoffverbrauchsraten erheblich verbessern. Das Gewebe und die Mitochondrien können leicht beschädigt werden, wenn die Probe nicht kalt gehalten wird, nicht konsequent in Konservierungsmedien eingetaucht wird oder übermäßig gehandhabt wird, was zu suboptimalen Routine- und OXPHOS-Raten führt. Darüber hinaus ist das genaue Nassgewicht des homogenisierten Gewebes von entscheidender Bedeutung, da dies die primäre Normalisierungsmethode ist. Andere Normalisierungsmethoden können in Betracht gezogen werden, wie z.B. Gesamtprotein oder mitochondriale spezifische Marker, wie die Citratsynthase-Aktivität20. Darüber hinaus muss die Heterogenität des Gewebes angegangen werden, wobei Entscheidungen über Tumorregionen in Experimente einbezogen werden sollen, die a priori getroffen werden. Nekrotisches, fibrotisches und Bindegewebe homogenisiert und / oder atmet nicht gut und sollte vermieden werden, es sei denn, diese Tumorregionen werden absichtlich untersucht. Insbesondere kann der Tumor je nach Art und Exzisionsregion sehr klebrig sein, was das genaue Wiegen und Übertragen schwieriger macht. Die Anzahl der Schläge, die für Homogenisierungen verwendet werden, sollte optimiert werden, um eine vollständige Vorbereitung der Mitochondrien zu gewährleisten und gleichzeitig die Schädigung der äußeren mitochondrialen Membranen zu mildern.
Für eine verbesserte Genauigkeit und Reproduzierbarkeit empfehlen wir die Durchführung von Optimierungsexperimenten für die Anzahl der Schläge für die Homogenatpräparation, die Gewebekonzentration und die Konzentrationen von Substrat, Entkoppler und Inhibitoren. Studien können die unterschiedliche Anzahl von Schlaganfällen vergleichen und wie sie mit der Reaktion auf die Zugabe von Cytochrom c innerhalb der Studie sowie der maximalen mitochondrialen Atmungskapazität korrespondieren 21. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass eine geringere Cytochrom-c-Reaktion besser ist, da eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs nach Zugabe von Cytochrom c auf eine Schädigung der äußeren mitochondrialen Membran hinweisen kann, gibt es keinen Goldstandard, was dieser Schwellenwert für jedes Gewebe ist, und sollte experimentell untersucht werden, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht überarbeitet oder untervorbereitet wird. In diesem Tumorgewebe wurde festgestellt, dass eine Cytochrom-c-Reaktion unter ~ 30% die Atmungsfunktion nicht beeinträchtigte. Die Verwendung von Cytochrom c wird entscheidend für die genaue Quantifizierung der Atmungskapazität, wenn der Test positiv ist. In diesem Fall füllt die Zugabe das endogene Cytochrom c auf, das, wenn es erschöpft ist, eine Unterschätzung der Atemfrequenzen verursacht.
Gewebekonzentrationstitrationsexperimente können über eine Reihe von machbaren Konzentrationen durchgeführt werden und würden idealerweise mit SUITs durchgeführt, die während der Studie untersucht werden. Die Atmungskapazität variiert je nach Tumortyp und -zusammensetzung. Daher erfordern Tumore, die mit Mitochondrien oder hoher Atmungskapazität dicht sind, niedrigere Konzentrationen (0,5-5 mg / ml). Tumore mit wenigen Mitochondrien oder geringer Atmungskapazität erfordern höhere Konzentrationen (7-12 mg / ml). Darüber hinaus benötigen SUITs, die lang sind oder stark verbrauchte Substrate aufweisen, möglicherweise weniger Gewebe, um eine Reoxygenierung der Kammer oder eine ADP-Begrenzung zu verhindern. Einige Gewebe haben eine lineare Beziehung im Sauerstoffverbrauch, während andere in bestimmten Konzentrationsbereichen eine verbesserte Empfindlichkeit und maximale Oxidation aufweisen. Die gewählte Gewebekonzentration sollte optimiert werden, um den Sauerstofffluss zu maximieren und gleichzeitig die Anzahl der Reoxygenierungsereignisse zu begrenzen. Darüber hinaus ist es oft besser, den Bedarf zu überschätzen oder das obere Ende des Konzentrationsbereichs anzustreben. Die Inhibitoren, die für die Quantifizierung von Atemwegen unerlässlich sind, sind präziser, wenn sie in größeren Mitochondrienpools eingesetzt werden.
Eine weitere wesentliche Überlegung ist die Konzentration der Medikamente, die während der Protokolle verwendet werden. Änderungen der Homogenatkonzentration können die Konzentrationen von Substraten, Entkopplern und Inhibitoren verändern, die für ein maximales Ansprechen erforderlich sind. Sobald also der optimale Konzentrationsbereich ausgewählt ist, sollte ein Experiment durchgeführt werden, in dem die für das SUIT-Protokoll erforderlichen Dosen getestet werden. Zusätzliches ADP kann hinzugefügt werden, um sicherzustellen, dass die Adenylatkonzentrationen nicht auf Atemflüsse beschränkt sind. Chemische Entkoppler wie FCCP oder CCCP hemmen die Atmung bei höheren Konzentrationen22. Daher ist es wichtig, in kleinen Mengen zu titrieren, um die maximal erreichte Rate aufzudecken. Inhibitoren wie Rotenon und Antimycin A werden am besten verwendet, wenn sie innerhalb der ersten Injektion gesättigt werden. Während in Vorversuchen optimale Konzentrationen bestimmt wurden, haben wir auch behandlungsbedingte Unterschiede in der Reaktion auf Inhibitoren beobachtet und fügen daher oft eine zusätzliche Injektion von Inhibitoren hinzu, um eine maximale Hemmung nachzuweisen, da die resultierenden Raten als Grundlage für die Quantifizierung dienen. Die chemische Hemmung von Ascorbat/TPMD ist für eine genaue analytische Reduktion unerlässlich, da TMPD einer Autooxidation unterzogen wird23. Wir kontrollierten die Autooxidation von Ascorbat / TMPD / Cytochrom c durch die Zugabe von Natriumazid, einem etablierten CIV-Inhibitor. Für die Km-Studien verhindert die Zugabe von Rotenon in Gegenwart von Succinat allein die Oxalacetatakkumulation, die die Succinatdehydrogenase-Aktivität bei niedrigen Konzentrationen hemmen kann24. Das Volumen und die Konzentration von ADP hängen stark von der Empfindlichkeit der Mitochondrien gegenüber der vorherrschenden Substratkombination ab. Mitochondriale Präparate, die sehr empfindlich auf ADP reagieren, erfordern niedrigere Ausgangskonzentrationen. Darüber hinaus sind validierte Chemikalien und die richtige Arzneimittelaufbereitung unter Berücksichtigung des pH-Wertes, der Lichtempfindlichkeit (falls zutreffend) und der Lagertemperatur für erfolgreiche Experimente unerlässlich.
Instrumentenaufbau und Routinepflege sind für den Erfolg dieser Experimente von entscheidender Bedeutung. Eine angemessene und ordnungsgemäße Reinigung der Kammern ist für die Reproduzierbarkeit und Vorbeugung von biologischen, Protein-, Inhibitor- oder Unkopplikatorenkontaminationen unerlässlich. Clark-Elektroden und O2k-Systeme verwenden Glasreaktionskammern, was einen erheblichen Kostenvorteil gegenüber plattenbasierten Systemen darstellt, die auf Verbrauchsmaterialien angewiesen sind. Die Glaskammern müssen jedoch kräftig gereinigt werden und können in späteren Studien eine Quelle der Inhibitorkontamination sein. Die Inkubation mit mitochondrienreichen Proben während des Waschprozesses (z. B. isolierte Herz- oder Lebermitochondrien) kann das Risiko einer experimentellen Kontamination verringern und wird zusätzlich zu Verdünnungs- und alkoholbasierten Waschverfahren empfohlen. Wenn konsekutive Studien durchgeführt werden, minimiert die Reinigung mit Ethanol und Mitochondrien die Möglichkeit einer Inhibitorkontamination. Die Kalibrierung des Sauerstoffsensors wird vor jedem Experiment empfohlen, um genaue Messungen der Atmung relativ zum vorherrschenden Sauerstoffpartialdruck zu erhalten. Wenn mehrere Kalibrierungen nicht durchführbar sind, kann eine Kalibrierung pro Tag ausreichen, wenn die Sauerstoffkonzentration nach dem Waschvorgang stabil und konstant bleibt.
Die oben beschriebenen Verfahren nutzen das Oroboros O2k-Instrument zur Messung des Sauerstoffverbrauchs im Tumorgewebe innerhalb von 4 Stunden nach der Tumorexzision unter Verwendung einer zuvor entwickelten und optimierten Konservierungslösung und der Beatmungsmedien25,26,27. Mehrere Parameter in diesem Protokoll können für nachfolgende Anwendungen geändert werden. Der Geräteaufbau und die Kalibrierung, die homogenisatoren, die für die Gewebevorbereitung verwendet werden, und die optimale Homogenat- und Kammersauerstoffkonzentration können alle für den Einsatz auf anderen Instrumenten mit Sauerstoffüberwachungspotenzial angepasst werden. Zum Beispiel wurden die Kammern beim Hinzufügen von Homogenat leicht überfüllt, und wenn die Kammer vollständig geschlossen ist, bleibt die Kammerkapillar voll. Dies verbraucht etwas Sauerstoff in der Kammer, aber mit der Optimierung der Probenkonzentration können wir diesen Verbrauch bei der Bestimmung des Sauerstoffgehalts berücksichtigen, mit dem wir beginnen sollen. Alternativ kann die Probe bei Umgebungssauerstoff ausgeglichen werden, bevor die Kammer geschlossen wird, aber dies erhöht oft die Zeitspanne vor Beginn des Experiments und verzögert die Zugabe von Substraten. Während die in diesem Protokoll verwendeten Homogenisatoren allgemein zugänglich sind, könnten andere kommerzielle Homogenisierungstechniken eingesetzt werden, wie z.B. ein Gewebezerkleinerer oder ein automatisierter Homogenisator28.
Darüber hinaus können die Gewebevorbereitungs- und Instrumentenverfahren mit einer Reihe verschiedener SUITs verwendet werden, um die Atemkontrolle durch eine Vielzahl von Kopplungs- und Signalwegkontrollzuständen zu untersuchen29. Diese SUIT-Protokolle wurden entwickelt, um die Funktionsfähigkeit zu messen, und somit hat der Beitrag potenzieller endogener Substrate keinen Einfluss auf die Kapazitätsmessung. Wir berücksichtigen analytisch den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und/oder den Restverbrauch des Homogenats durch Subtraktion des Antimycin-A-Rotenons bzw. natriumazidunempfindlicher Raten. Mitochondrien können in BIOPS oder ähnlich aufgebauten Konservierungslösungen für längere Zeit (>24 h) lebensfähig bleiben, abhängig von Gewebetyp und Unversehrtheit30,31. Studien können im Voraus durchgeführt werden, um die zeitlichen Lagergrenzen zu bestimmen, da OXPHOS bestimmter Substrate unterschiedliche Einschränkungen haben kann. Dies ist unerlässlich, wenn das Experiment nicht innerhalb weniger Stunden nach der Gewebeexzision / Biopsie durchgeführt werden kann. 37°C ist eine optimale und physiologische Temperatur zur Beurteilung der Atmungsfunktion in den meisten Säugetiersystemen. Wenn jedoch die Assay-Temperatur die Bewertung32zu stören scheint, können Vergleichsstudien über einen weiten Temperaturbereich (25-40 °C) durchgeführt werden, um eine angemessene Reaktionsfähigkeit zu gewährleisten. Instrumentelle Einschränkungen können die Fähigkeit zur Durchführung solcher Studien einschränken.
Haupteinschränkungen der oben beschriebenen Methode sind 1) das Potenzial für eine Schädigung der Mitochondrien durch mechanische Homogenisierung, 2) das Vorhandensein von ATPasen oder anderen subzellulären Biochemikalien in Homogenatpräparaten, die die gleichzeitige Bestimmung von ATP oder anderen Variablen von Interesse stören können und zusätzliche Korrekturmethoden erfordern oder Inhibitoren verwenden33 , und 3) die Auswertung vieler Proben und/oder mehrerer SUITs pro Probe ist zeitaufwendig, da ein Instrument zwei Experimente gleichzeitig aufnehmen kann und zwischen aufeinanderfolgenden Experimenten gereinigt und eingerichtet werden muss. Optimierungsexperimente und die konsistente Aufbereitung von Proben können erhebliche mitochondriale Schäden minimieren, die zu inkonsistenten Daten beitragen würden.
Die Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden ist eine verbesserte Machbarkeit im Vergleich zur Menge an Ausgangsmaterial, die Herausforderung der Isolierung von Mitochondrien oder die technische Herausforderung bei der Permeabilisierung von Gewebe. Die Herstellung von Homogenaten ist schneller, Sauerstoff ist nicht annähernd so limitierend und ist im Vergleich zu permeabilisiertem Gewebe weniger anfällig für Variabilität zwischen dem Personal. Wichtig ist, dass fast alle Probentypen für die Homogenatvorbereitung geeignet sind, was eine vergleichende Analyse über Gewebe hinweg ermöglicht. Die hochauflösende Respirometrie ist die Goldstandardmessung von mitochondrialen OXPHOS und ET. Die Anwendung dieser Methode in der präklinischen und klinischen Krebsforschung hat die Fähigkeit, aktuelle In-vitro-Untersuchungen auf Ex-vivo-Studien auszuweiten. Darüber hinaus bietet es potenzielle Anwendungen im klinischen und diagnostischen Umfeld.

Alle Zellen sind eng miteinander verbunden durch ihre Notwendigkeit, Adenosintriphosphat (ATP), die molekulare Energiewährung, zu produzieren und zu konsumieren. Da zelluläre Mutationen zur Bildung von Tumoren führen, sichern Mitochondrien das Überleben durch Diversifizierung der Energieproduktion, die oft phänotypisch von nicht-krebsartigem Gewebe unterscheidbar ist1,2,3. Daher besteht ein kritischer Bedarf an einer schnellen und tiefen Profilierung der mitochondrialen Atmungsfunktion, um die Klassifizierung von Tumortyp, Krebsbeginn, Progression und Behandlungsreaktion zu erleichtern.
Die Atmungsfunktionen von exzidierten Gewebeproben können nicht intakt bewertet werden, da die primären Substrate für OXPHOS nicht zelldurchlässig sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Mitochondrien entweder durch Isolierung, chemische Permeabilisierung oder mechanische Homogenisierung hergestellt werden. Die mitochondriale Isolierung gilt seit langem als Goldstandard für die Beurteilung der Atmungsfunktion. Es erfordert jedoch große Mengen an Gewebe, ist zeitaufwendig und ist gering ertragreich mit möglicher Selektionsverzerrung für bestimmte Fraktionen der Mitochondrien4. Die Permeabilisierung besteht aus der mechanischen Trennung und Der Exposition von Gewebeschnitten oder Faserbündeln gegenüber einem milden Reinigungsmittel, das die Plasmamembran selektiv abbaut5. Die Permeabilisierung wird häufig in quergestreiften Geweben wie Skelett- und Herzmuskel eingesetzt, da einzelne Faserbündel auseinander gezogen werden können. Im Vergleich zur Isolation ergibt die Permeabilisierung mehr Mitochondrien in ihrer nativen zellulären Umgebung und physischen Form5. Die Permeabilisierung wurde erfolgreich in anderen Geweben wie Tumor6,7 und Plazenta8angewendet ; Die Reproduzierbarkeit von permeabilisierten Faserpräparaten kann jedoch aufgrund der Konsistenz der Dissektion und des Sauerstoffbedarfs zur Überwindung von Diffusionsbeschränkungen schwierig sein9. Darüber hinaus können permeabilisierte Fasern bei bestimmten Tumorarten, die dichtzellig und stark fibrotisch sind, ungeeignet sein. Gewebehomogenate entstehen durch mechanische Störung der Plasmamembran und ähneln permeabilisierten Fasern in Bezug auf mitochondriale Ausbeute und Integrität10. Gewebehomogenate minimieren auch die Einschränkungen der Sauerstoffdiffusion und können durch Optimierung der mechanischen Kraft11,12leicht gewebeübergreifend eingesetzt werden.
Hier skizzieren wir eine einfache und schnelle Methode zur Quantifizierung der Raten der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und Elektronentransferkapazität (ET) in frisch ausgeschnittenen soliden Tumorhomogenaten. Das Protokoll ist optimal für die Bewertung von frischem Gewebe mit dem hochauflösenden Oxygraph-2k (O2k)-Respirometer ausgelegt, das Vorkenntnisse in der instrumentellen Einrichtung und Kalibrierung erfordert, aber in ähnlicher Weise mit jeder Clark-Elektrode, jedem Seepferdchen-Analysator oder Plattenleser angepasst werden kann. Das Protokoll kann reproduzierbar über Spezies und Tumorarten hinweg angewendet sowie angepasst werden, um eine Vielzahl von mitochondrialen ET-Signalwegen zu bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

Mitochondrien sind essentiell für den Ausbruch und das Fortschreiten von Krebs durch Energieproduktion, reaktive Sauerstoffspeziesregulation und Makromolekülsynthese. Genetische und funktionelle Anpassungen der Mitochondrien an die Tumorumgebung treiben das proliferative und metastatische Potenzial voran. Das Aufkommen der DNA- und RNA-Sequenzierung beseitigte kritische Barrieren für die Bewertung genetischer Mediatoren der Tumorgenese. Bis heute sind methodische Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Funktion von Tumoren jedoch schwer fassbar und erfordern technische Fähigkeiten, die die Machbarkeit einschränken und letztendlich den diagnostischen und prognostischen Wert sowohl im experimentellen als auch im klinischen Umfeld verringern. Hier skizzieren wir eine einfache und schnelle Methode zur Quantifizierung der Raten der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und Elektronentransferkapazität (ET) in frisch ausgeschnittenen soliden Tumorhomogenaten mittels hochauflösender Respirometrie. Das Protokoll kann reproduzierbar über Spezies und Tumorarten hinweg angewendet sowie angepasst werden, um eine Vielzahl von mitochondrialen ET-Signalwegen zu bewerten. Mit diesem Protokoll zeigen wir, dass Mäuse, die einen luminalen B-Brustkrebs tragen, eine defekte Nicotinamidadenindinukleotid-gebundene Atmung aufweisen und auf Succinat angewiesen sind, um Adenosintriphosphat über OXPHOS zu erzeugen.

Erste Studien zeigten, dass EO771-Tumoren niedrig oxidativ waren und daher hohe Homogenatkonzentrationen für eine adäquateO2-Flussbestimmung erforderten. Es wurden Optimierungsexperimente durchgeführt, um den optimalen Konzentrationsbereich des Gewebehomogenats für die Studie zu bestimmen. Tumorhomogenate wurden zunächst bei 40 mg/ml hergestellt und dann linear verdünnt. Der auf die Gewebemasse normierteO2-Fluss war über die Konzentrationen hinweg konsistent (Abbildungen 1A-D). Es wurde beobachtet, dass 40 mg/ml zu einem schnellen Sauerstoffmangel führten und nicht für Experimente geeignet waren (Abbildung 1A). Der Sauerstoffverbrauch verlangsamte sich mit 30 mg/ml und 20 mg/ml erheblich, nahm aber in Abwesenheit von Substraten oder ADP in kurzer Zeit rapide ab (Abbildung 1B,C). Die Konzentration von 10 mg/ml führte zu der optimalen Sauerstoffverbrauchsrate (Abbildung 1D), die ein längeres 90-minütiges SUIT-Protokoll unterstützen würde.
Ein SUIT-Protokoll wurde verwendet, um NADH- und Succinat-verknüpfte OXPHOS- und ET-Aktivitäten sowie die CIV-Aktivität zu bewerten (Abbildung 2A). Pyruvat und Malat wurden dem Gewebehomogenat in Abwesenheit von ADP zugesetzt, um Leckagen (L) durch NADH zu treiben. Sättigungs-ADP wurde dann hinzugefügt, um maximale NADH-verknüpfte OXPHOS (P) zu fahren, gefolgt von der Zugabe von Glutamat. Cytochrom c wurde dann hinzugefügt, um die Integrität der äußeren Membran zu gewährleisten; der Anstieg der Atmungsrate betrug in allen Proben weniger als 20 % (Abbildung 2B). Angesichts der sehr geringen Reaktion auf NADH-gebundene Substrate wurde die Cytochrom-c-Freisetzung auch in Gegenwart von Succinat und Rotenon bewertet und eine minimale Cytochrom-c-Stimulation beobachtet (Abbildung 2B). Interessanterweise war NADH-chromosomales OXPHOS bei EO771-Tumoren vernachlässigbar (Abbildung 2C). Succinat wurde dann in Gegenwart von Pyruvat, Malat und Glutamat hinzugefügt, um den Elektronenfluss durch Succinatdehydrogenase zu stimulieren. FCCP wurde dann titriert, um den maximalen Elektronenfluss (E) anzutreiben, was zeigte, dass bei EO771-Tumoren die Phosphorylierung und nicht die Oxidation auf die Atmung beschränkt war (Abbildung 2C). Rotenon und Antimycin A wurden anschließend titriert, um Komplex I bzw. Komplex III zu hemmen. Ascorbat und TMPD wurden dann hinzugefügt, um den maximalen Elektronenfluss durch CIV zu steuern, der dann durch Natriumazid gehemmt wird. Tabelle 1 veranschaulicht analytische Reduktionsgleichungen der Rohdaten (Tabelle 2), um die in Abbildung 2Cdargestellten Respiratorischen Parameter zu quantifizieren. Insgesamt ähneln die Tumorhomogenat-Atemprofile (Abbildung 2C) denen von nicht implantierten digitoninpermeabilisierten EO771-Zellen (Abbildung 2D) mit Ausnahme eines verminderten maximalen Elektronentransfers, der durch N- und S-verknüpfte Substrate im Tumor unterstützt wird.
Da die NADH-gebundene Atmung vernachlässigbar war, wurde die respiratorische Kinetik von Succinat durch schrittweise Titrationen von subsättigen ADP weiter bewertet, bis die maximale Rate (VMAX)erreicht war (Abbildung 3A, 3B). Die halbmaximale Konzentration (KM)von ADP in Gegenwart von Succinat + Rotenon betrug 37,5 μM, während die VMAX ~10,5 pmol/s/mg betrug (Abbildung 3C). So waren EO771-Tumoren trotz relativ schlechter Oxidationsraten hochempfindlich gegenüber ADP und hielten die ATP-Synthese bei relativ niedrigen ADP-Konzentrationen aufrecht.
Die Auswahl geeigneter Bereiche der Rohdaten für die Extraktion ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit von Experimenten und die genaue Quantifizierung. Für Cytochrom cmuss unmittelbar vor der Injektion eine Markierung im Steady-State ausgewählt werden(Abbildung 4A,Markierung 1). Es gibt oft ein anfängliches Injektionsartefakt, dem eine Zeitspanne (ca. 5-10 min) folgen kann, in der derO2-Fluss nicht konstant ist. Die Bewertung der Cytochrom-c-Effizienz erfolgt durch eine zusätzliche Auswahl, sobald sich derO2-Fluss stabilisiert hat(Abbildung 4A,Markierung 2). Selektionen nach zugesetzten Substraten, ADP oder den meisten Inhibitoren erfolgen ebenfalls nach dem Injektionsartefakt und sobald sich derO2-Fluss stabilisiert hat (Abbildung 4B). Die Auswahl, die zur Bestimmung der maximalen entkoppelten Atmung verwendet wird, erfolgt bei der Spitzenerhöhung, die während der Titration von FCCP erreicht wird, was oft nicht die letzte Injektion ist (Abbildung 4C). Die Auswahl für TMPD erfolgt nach Zugabe von Ascorbat und TMPD und auf dem Höhepunkt der Atmungszunahme(Abbildung 4D,Markierung 1). Kurz nach diesem Peak wird der Inhibitor, Natriumazid, zugegeben, der die Atmung schnell verringert, aber auch oft ein Injektionsartefakt aufweist, das niedriger ist als die gehemmte Atmungsrate (Abbildung 4D). Die Inhibitormarkierung wird unmittelbar nach dem Injektionsartefakt gebildet(Abbildung 4D,Markierung 2). DerO2-Fluss stabilisiert sich typischerweise nicht und nimmt weiter ab.
Tabelle 1: Respiratorische Notation und analytische Ableitung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Proben- und Atmungseigenschaften von luminalen B-Brusttumorhomogenaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Abbildung 1: Optimierung der Tumorhomogenatkonzentration. O2 Flussmittel (rot) undO2 Konzentration (blau) in Mammatumorhomogenaten, hergestellt bei (A) 40 mg/ml, (B) 30 mg/ml, (C) 20 mg/ml und (D) 10 mg/ml. Thom: Gewebehomogenat-Atmung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Abbildung 2: Bewertung der OXPHOS- und ET-Kapazität durch hochauflösende Respirometrie in frisch ausgeschnittenen Tumorhomogenaten. (A) Repräsentative Darstellung des Sauerstoffverbrauchs (rot) und der Konzentrationen (blau) im Verlauf eines Substrat-, Inhibitor- und Entkopplerprotokolls. PM: Pyruvat + Malat, D: ADP, G: Glutamat, c: Cytochrom c, S: Succinat, F: FCCP, Rot: Rotenon, Ama: Antimycin A, Asc/TMPD: Ascorbat/Tetramethyl-p-phenylendiamin. (B) Prozentualer Anstieg desO2-Flusses bei Zugabe von Cytochrom c. (C-D) Die Atmung unterstützt durch Malat, Pyruvat, Glutamat und Succinat in Gegenwart von ADP, FCCP und Ascorbat/TMPD in (C) EO771-abgeleiteten Tumorhomogenaten und (D) nicht implantierten EO771-Digitonin-permeabilisierten Zellen. Thom: Gewebehomogenat-Atmung; PM: Pyruvat + Malat; PMG: Pyruvat + Malat + Glutamat; PMGS: Pyruvat + Malat + Glutamat + Succinat; CIV: Komplex IV; -L: Leckzustand; -P: Oxidativer Phosphorylierungszustand, -E: Elektronentransferzustand; N-verknüpft:O2-Fluss, unterstützt durch definierte NADH-erzeugende Substratkombinationen; NS-gebunden:O2-Fluss unterstützt durch die Konvergenz von definierten NADH-erzeugten Substratkombinationen und Succinat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Abbildung 3: EO771-Brusttumoren zeigten eine hohe ADP-Sensitivität (Adenosin-5′-Diphosphat). (A) Repräsentative Darstellung des Sauerstoffverbrauchs (rot) und der Konzentrationen (blau) in einem S-gebundenen ADP-Titrationsprotokoll. Thom: Gewebehomogenat-Atmung; S/Rot: Succinat/Rotenone; D: ADP. (B) Atmung unterstützt durch Succinat in Gegenwart von Rotenon und steigende Konzentrationen von ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Maximale Rate (VMAX) und halbe maximale Konzentration (KM) von ADP in Gegenwart von Succinat + Rotenon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Rückverfolgung zur Veranschaulichung der Markierungsauswahl vonO2-Rohflüssen für die Datenextraktion. (A) Cytochrom-c-Auswahl: Auswahl Nummer 1 vor der Cytochrom-c-Injektion und Auswahlnummer 2 nach der Injektion, wenn sich derO2-Fluss stabilisiert hat. c Cytochrom c. (B) Substrat-, ADP- und Inhibitorauswahl: Auswahl Nummer 1 nach der Injektion (Succinat in diesem repräsentativen Diagramm), bei der sich derO2-Fluss stabilisiert hat. S: Succinat. (C) Entkoppeltelektion: Auswahl Nummer 1 bei der maximalen Zunahme der Atmung während der Entkoppeltitration. In diesem repräsentativen FCCP-Titrationsdiagramm verringert die dritte Injektion die Atmung leicht und wird daher nicht zur Selektion verwendet. F: ACCP. (D) TMPD-Auswahl: Auswahl Nummer 1 bei der maximalen Zunahme der Atmung nach den Ascorbat- und TMPD-Injektionen. Natriumazidauswahl: Auswahl Nummer 2 nach dem akuten Injektionsartefakt, wenn die Atmung anfänglich abnimmt. As/Tm: Ascorbat/TMPD; Azd: Azid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Wir entwickelten ein praktisches Protokoll und einen analytischen Ansatz zur Bewertung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung und Der Elektronentransferkapazität in frischen Tumorhomogenaten. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Funktionen zu überwachen, die zur Entstehung, Progression und Ansprechen auf die Behandlung von Krebs beitragen.

Analytische Bestimmung der mitochondrialen Funktion von exzidierten soliden Tumorhomogenaten

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Methode zur Messung der mitochondrialen Funktion des Tumors. Das Protokoll ist weitgehend auf die klinische translationale Onkologie anwendbar und wird dazu beitragen, die diagnostische und mechanistische Interpretation der Rolle der Mitochondrien bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anwendung der Gewebehomogenisierung, um die Vorbereitung zu vereinfachen und die Ausbeute der Mitochondrien zu maximieren und gleichzeitig die Einschränkungen der Diffusion zu mildern.Diese Technik bietet potenzielle Anwendungen in klinischen und diagnostischen Umgebungen mit einer quantitativen Bewertung der mitochondrialen Funktion des Tumors unter Verwendung von frisch biopsiertem oder ausgeschnittenem Tumorgewebe. Beginnen Sie damit, einen Glashomogenisator, der einen Milliliter mitochondriales Atmungsmedium oder MiR05 enthält, in einen eng anliegenden Glasstößel auf Nasseis zu legen. Legen Sie das Gewebe in einen Milliliter Biopsiekonservierungslösung (BIOPS) in eine eiskalte Petrischale.Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke von jeweils etwa 5 bis 10 Milligramm und legen Sie die verbleibenden Tumorstücke wieder in 10 Milliliter BIOPS, die auf Eis aufbewahrt werden. Nachdem Sie die Gewebeabschnitte vorsichtig auf ein Filterpapier getupft haben, legen Sie sie auf ein kleines, mit Kunststoff geteertes Wiegeboot und notieren Sie das anfängliche Nassgewicht. Legen Sie die unbenutzten Stücke zur weiteren Konservierung wieder in das konische 10-Milliliter-Röhrchen von BIOPS.Tauchen Sie die Gewebeabschnitte in einen eiskalten Homogenisator, der MiR05 enthält, und notieren Sie das verbleibende Gewicht auf dem Wiegeboot. Mit einem Glasstößel mit einem Freiraumbereich von 0,09 bis 0,16 Millimetern wird das Tumorgewebe vorsichtig gestört, indem fünf bis sieben Schläge nach unten und oben durchgeführt werden. Drehen Sie den Stößel für jeden Schlag dreimal im Uhrzeigersinn / gegen den Uhrzeigersinn, während Sie den Stößel nach unten drücken, und drei weitere Male, während Sie den Stößel wieder nach oben ziehen.Lassen Sie das Gewebe sich zwischen den Schlägen am Boden des Homogenisators absetzen, aber vermeiden Sie es, den Stößel vollständig über das Flüssigkeitsvolumen zu bringen, um ein Aufschäumen zu verhindern. Gießen Sie das Homogenat in ein konisches 15-Milliliter-Rohr und legen Sie es auf Eis. Ein bis drei Milliliter frisches MiR05 über den Stößel und in den Homogenisator pipettieren, um das verbleibende Gewebehomogenat zu waschen.Gießen Sie die MiR05-Wäsche in das konische Röhrchen, das das Homogenat enthält. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei- bis dreimal, um eine vollständige Übertragung des Homogenats sicherzustellen. Um die Gewebehomogenatkonzentration genau zu berechnen, untersuchen Sie den Homogenisator und das Homogenat sorgfältig auf verbleibendes nicht homogenisiertes Material, zu dem auch Bindegewebe gehört.Um das nicht homogenisierte Material aus dem Homogenisator zu entfernen, das mit einer Pinzette nicht erreicht werden kann, saugen Sie nach Zugabe von MiR05 zum Homogenisator das Volumen, einschließlich des Gewebes, mit einer Pipette ab und bewegen Sie den Inhalt in eine Petrischale. Entfernen Sie das nicht homogenisierte Material, das sich in großen Stücken am Boden des konischen Rohres abgesetzt hat, aus dem Homogenat, indem Sie es mit einer Pipette ansaugen, und legen Sie es auf die Kappe des konischen Rohrs. Entfernen Sie das Gewebe mit einer Pinzette aus der Petrischale oder der konischen Röhrchenkappe und tupfen Sie es auf Filterpapier.Das restliche Homogenat aus der konischen Rohrkappe wieder in das konische Rohr geben. Kappen Sie das Röhrchen und kehren Sie es dann um, um es zu mischen. Überprüfen Sie die Homogenisatoren erneut und homogenisieren Sie auf zusätzliches nicht homogenisiertes Material, und wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte zum Entfernen von nicht homogenisiertem Material.Wiegen und notieren Sie die Masse des aus dem Homogenisator gewonnenen nicht homogenisierten Materials. Untersuchen Sie die Homogenataufbereitung auf grob intaktes Übertragenes Gewebe, entfernen Sie die nicht homogenisierten Stücke und wiegen Sie sie bei Bedarf. Subtrahieren Sie das Gewebegewicht, das vom Wiegeboot, homogenisator und homogenisiert wird, vom anfänglichen Nassgewicht, um das endgültige Probengewicht zu berechnen.Fügen Sie unter Verwendung des endgültigen Probengewichts zusätzliches MiR05 hinzu, um homogenat auf die gewünschte Konzentration zu bringen. Sobald das Homogenat gewogen und vorbereitet ist, fahren Sie so schnell wie möglich mit der Untersuchung fort. Bewahren Sie die Probe auf Nassemis auf, bis sie auf das Instrument übertragen wird.Sobald das Instrument kalibriert und die Probe vorbereitet ist, entfernen Sie die Stopfen mit einer Drehbewegung und aspirieren Sie den MiR05 aus den Kammern, wobei Die Membran in der Kammer freigelegt wird. Mischen Sie das Homogenat gut und geben Sie 2,25 Milliliter des Homogenats in die Kammer. Angenommen, ein Homogenat wird mehreren Kammern zugesetzt, pipettieren Sie jeweils einen Milliliter des Homogenats in jede Kammer, während Sie das Homogenat mischen, um eine gleichmäßige Gewebeverteilung zu gewährleisten.Klicken Sie auf F4, um das Ereignis zu benennen und mit einem Zeitstempel zu versehen, und klicken Sie dann auf OK. Füllen Sie eine 50-Milliliter-Spritze mit Sauerstoff aus einem Sauerstofftank mit einem Regler und einem Gasschlauch mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel. Injizieren Sie den Sauerstoff direkt in die Kammern, um sie zu etwa 500 mikromolarem Sauerstoff zu hyperoxygenisieren.Führen Sie die Stopfen locker ein und warten Sie, bis der Sauerstoff etwa 480 Mikromolar erreicht. Schließen Sie die Kammer mit einer Drehbewegung langsam und lassen Sie die Atmung für etwa 15 bis 20 Minuten ausgleichen. Füllen Sie bei Bedarf die zentrale Kapillare des Stopfens mit MiR05.Verwenden Sie spezielle Mikrospritzen, um Substrate, Entkoppler und Inhibitoren in vollständig geschlossene Kammern zu injizieren, um die Ereignisse für jede Kammer in Echtzeit zu benennen und mit einem Zeitstempel zu versehen. Wählen Sie F6, um die negativen Skalen für die Sauerstoffkonzentration und die Sauerstoffsteigung nach Bedarf anzupassen. Nach jeder Injektion waschen Sie die Spritze dreimal in Wasser für wasserlösliche Verbindungen und 70% Ethanol für ethanolgelöse Verbindungen.Fügen Sie fünf Mikroliter 0,8-molares Malat hinzu und fahren Sie sofort mit der nächsten Injektion fort. Waschen Sie die Injektionsspritze dreimal in Wasser. Fügen Sie sofort fünf Mikroliter 1-molaren Pyruvat hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat.Nach dem Waschen der Spritze 10 Mikroliter 0,5-molares ADP hinzufügen und warten, bis sich die ADP-Reaktion stabilisiert hat. Waschen Sie die Spritze und fügen Sie fünf Mikroliter 2-molares Glutamat hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Waschen Sie die Spritze, fügen Sie dann fünf Mikroliter 4-Millimolar Cytochrom-C hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat.Nach dem Waschen der Spritze 20 Mikroliter 1-Backensuccinat hinzufügen und warten, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Titrieren Sie 0,5- bis 1-Mikroliter-Schritte von 1 Millimolar FCCP und warten Sie, bis sich die Atmung nach jeder Injektion stabilisiert hat. Fahren Sie fort, bis es keine zusätzliche Zunahme der Atmung gibt.Waschen Sie die Injektionsspritze dreimal in 70% Ethanol. Fügen Sie zwei Mikroliter 150-mikromolaren Rotenon hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Fügen Sie einen weiteren Mikroliter Rotenon hinzu, um sicherzustellen, dass es keine weitere Hemmung gibt.Wenn die Atmung abnimmt, fahren Sie mit zusätzlichen Injektionen fort, bis die Atmung nicht abnimmt, und waschen Sie dann die Injektionsspritze dreimal in 70% Ethanol. Fügen Sie zwei Mikroliter 125-mikromolares Antimycin A hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Fügen Sie einen weiteren Mikroliter Antimycin A hinzu, um sicherzustellen, dass es keine weitere Hemmung gibt.Wenn die Atmung abnimmt, fahren Sie mit zusätzlichen Injektionen fort, bis die Atmung nicht abnimmt. Waschen Sie die Spritze dreimal mit 70% Ethanol. Überprüfen Sie die Sauerstoffkonzentration der Kammer.Wenn die Konzentration unter 125-Mikromolar liegt, reoxygenieren Sie in die Raumluft oder leicht hyperoxygenat, um sicherzustellen, dass Sauerstoff den Atemfluss nicht einschränkt. Fügen Sie fünf Mikroliter 0,8-molares Ascorbat hinzu. Waschen Sie die Spritze dreimal in 70% Ethanol.Fügen Sie sofort 10 Mikroliter 0,2-molare TMPD hinzu und warten Sie auf eine Zunahme der Atmung. Nach dem Waschen der Spritze mit Ethanol sofort 25 Mikroliter 4-molares Natriumazid hinzufügen, wenn der Atemfluss von Ascorbat TMPD plateaut. Beenden Sie die, indem Sie auf Datei, Speichern und trennen klicken.Es wurde beobachtet, dass 40 Milligramm pro Milliliter Gewebehomogenat zu einem schnellen Sauerstoffmangel führten. Der Sauerstoffverbrauch verlangsamte sich mit 30 und 20 Milligramm pro Milliliter Gewebehomogenat erheblich, nahm aber in Abwesenheit von Substraten oder ADP in kurzer Zeit rapide ab. Die Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter gewebehomogenat führte zu einer optimalen Sauerstoffverbrauchsrate.Ein SUIT-Protokoll wurde verwendet, um NADH- und Succinat-verknüpfte oxidative Phosphorylierung und Elektronentransfer sowie die Komplex-IV-Aktivität zu bewerten. Die Cytochrom-C-Freisetzung wurde in Gegenwart von Pyruvat und Malat oder Succinat und Rotenon beurteilt, die beide zeigten, dass das Homogenatpräparat die Mitochondrien nicht schädigte. Es wurde auch festgestellt, dass die NADH-gebundene oxidative Phosphorylierung bei EO771-Tumoren vernachlässigbar war.Die Titration von FCCP zur Förderung des maximalen Elektronenflusses zeigte, dass bei EO771-Tumoren die Phosphorylierung und nicht die Oxidation auf die Atmung beschränkt war. Die homogenaten Atemprofile des Tumors ähnelten denen von nicht implantierten, digitoninpermeabilisierten EO771-Zellen, mit Ausnahme eines verminderten maximalen Elektronentransfers, der durch N- und S-chromosomale Substrate im Tumor unterstützt wurde. Die Respiratorische Kinetik von Succinat wurde durch schrittweise Titrationen von untersättigtem ADP weiter bewertet, bis die maximale Rate erreicht war.Die halbmaximale Konzentration von ADP in Gegenwart von Succinat und Rotenon betrug 37,5 Mikromol, während die maximale Rate etwa 10,5 Picomol pro Sekunde pro Milligramm betrug. Instrumente, die in der Routineversorgung aufgestellt werden, sowie die Handhabung von Gewebe sind für den Erfolg dieser Experimente von entscheidender Bedeutung. Im Anschluss an diese Verfahren können je nach Fragestellung weitere masse- oder markerspezifische Ansätze zur Ratennormalisierung angewendet werden.Gemeinsame Maßnahmen umfassen die Gesamtproteinquantifizierung und die enzymatische Aktivität der Citratsynthase, variieren jedoch je nach Modellsystem, statistischem Design und Forschungsfrage.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Forschung

Krebsforschung

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Dreidimensionale extrazelluläre Matrix Knochenmodell für Osteosarkom

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modellierung von primären Knochentumoren und Knochenmetastasen mit Implantation eines soliden Tumortransplantats in den Knochen

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...