Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

אנו מודים לצוות הליבה לביולוגיה ביו-רפואית של מרכז פנינגטון על טיפול בבעלי חיים. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי U54GM104940 (JPK) ו KL2TR003097 (LAG). כל הניסויים וההליכים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי מרכז המחקר הביו-רפואי פנינגטון הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים.

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+cancer+metabolism.">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).</li><li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells.">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth.">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Saks, V. A., et al., Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. , 81-100 (1998).</li><li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer.">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li><li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently.">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).</li><li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation.">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells,+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria.">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li><li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate.">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li><li>Hlozkov&#225;, K., Starkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells.">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).</li><li>Zhang, J., Zhang, Q., Haznadar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Metabolism: Methods and Protocols. , 353-363 (2019).</li><li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells.">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).</li><li>Sch&#246;pf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells.">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EO771,+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL/6+mice.">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328 (2020).</li><li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).</li><li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers.">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li><li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+radical,+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li><li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide.">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li><li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue:+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers.">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li><li>Gnaiger, E., Heldmaier, G., Klingenspor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+Cold.">Mitochondria in the Cold.</a> Life in the Cold. , 431-442 (2000).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2(high)+breast+cancer.">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).</li><li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain.">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).</li><li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures:+a+comparative+study+using+Drosophila.">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, (2021).</li><li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P/O+ratios.">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).</li></ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים לעבודה זו.

גישות להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בסרטן הוגבלו במידה רבה למודלים במבחנה 13,14,15,16. הצלחה מסוימת הושגה במדידת נשימה מיטוכונדריאלית בגידולים באמצעות פרמביליזציה כימית6,7,17, אבל אין גישה אחידה, תקן זהב שניתן ליישם באופן אוניברסלי ולהשוות בין סוגי גידולים. בנוסף, היעדר ניתוח נתונים עקביים ודיווח מוגבלים על יכולת ההכללה והשחזור של הנתונים. השיטה המתוארת כאן מספקת גישה פשוטה ומהירה יחסית למדידת נשימה מיטוכונדריאלית18 בתכשירים מיטוכונדריאליים מדגימות גידול מוצקות טריות. גידולים גדלו ממורין לומינאל B מושתל אורתוטופית, ERα שלילי EO771 תאי סרטן המאמרי19.
חריצות וטיפול ברקמות ישפרו מאוד את הדיוק והנורמליזציה של שיעורי צריכת החמצן. הרקמה והמיטוכונדריה עלולות להיפגע בקלות אם המדגם אינו נשמר קר, אינו שקוע בעקביות באמצעי השימור, או מטופל יתר על המידה, וכתוצאה מכך שגרה תת-אופטימלית ושיעורי OXPHOS. בנוסף, משקל רטוב מדויק של הרקמה הומוגנית הוא בעל חשיבות קריטית שכן זוהי שיטת הנורמליזציה העיקרית. שיטות נורמליזציה אחרות עשויות להיחשב, כגון סך חלבון או סמנים ספציפיים מיטוכונדריאליים, כגון פעילות סינתאזציטוט 20. בנוסף, הטרוגניות רקמות יהיה צורך לטפל, עם החלטות על אזורי הגידול לכלול בניסויים שנעשו מראש. רקמת נמק, פיברוטית וחיבור לא יכולה להומוגני ו/או להנשים היטב ויש להימנע ממנה אלא אם כן היא מנסחת בכוונה את אזורי הגידול האלה. ראוי לציין, הגידול עשוי להיות דביק מאוד בהתאם לסוג ואת אזור כריתה, מה שהופך את השקילה המדויקת ולהעביר מאתגר יותר. מספר השבץ המשמש הומוגניזציה צריך להיות מותאם כדי להבטיח הכנה מלאה של המיטוכונדריה תוך צמצום נזק לממברנות המיטוכונדריאלי החיצוני.
לשיפור הדיוק וההתרבות, אנו ממליצים לבצע ניסויי אופטימיזציה עבור מספר השבץ להכנת הומוגניות, ריכוז רקמות, ומצע, uncoupler, ריכוז מעכב. מחקרים יכולים להשוות את המספר השונה של שבץ וכיצד הם תואמים את התגובה לתוספת של ציטוכרום c בתוך המחקר, כמו גם את יכולת הנשימה המיטוכונדריאלית המקסימלית 21. למרות שיש קבלה כללית כי פחות תגובה cytochrome c הוא טוב יותר, כמו עלייה בצריכת חמצן לאחר תוספת של cytochrome c יכול להצביע על נזק לממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית, אין תקן זהב לגבי מה סף זה הוא עבור כל רקמה ויש לחקור באופן ניסיוני כדי להבטיח את הרקמה לא להיות overworked או לא מוכן. ברקמת הגידול הזו, נמצא כי תגובת ציטוכרום c מתחת ל- ~ 30% לא פגעה בתפקוד הנשימה. השימוש בציטוכרום c הופך לקריטי לכימות מדויק של יכולת הנשימה אם הבדיקה חיובית. במקרה זה, התוספת מחדשת את הציטוכרום האנדיגני c, אשר, אם מרוקן, יגרום לזלזל בשיעורי הנשימה.
ניסויי טיטריון ריכוז רקמות יכולים להתבצע על פני מגוון של ריכוזים אפשריים, באופן אידיאלי, ייעשה עם SUITs כי ייחקר במהלך המחקר. קיבולת הנשימה תשתנה בהתאם לסוג הגידול והרכבו. לכן, גידולים צפופים עם מיטוכונדריה או יכולת נשימה גבוהה ידרשו ריכוזים נמוכים יותר (0.5-5 מ"ג /מ"ל). גידולים עם מעט מיטוכונדריה או קיבולת נמוכה של הנשימה ידרשו ריכוזים גבוהים יותר (7-12 מ"ג/מ"ל). בנוסף, SUITs ארוכים או שיש להם מצעים נצרכים מאוד עשויים להזדקק לפחות רקמה כדי למנוע reoxygenation של התא או מגבלת ADP. לרקמות מסוימות יהיה קשר ליניארי בצריכת חמצן, בעוד שאחרות יראו רגישות משופרת וחמצון מקסימלי בטווחי ריכוז מסוימים. ריכוז הרקמה שנבחר צריך להיות מותאם כדי למקסם את שטף החמצן תוך הגבלת מספר אירועי reoxygenation. בנוסף, לעתים קרובות עדיף למעלה להיפטר מהצורך או לשאוף לקצה הגבוה יותר של טווח הריכוז. המעכבים, החיוניים לכמות של שטפי נשימה, מדויקים יותר כאשר משתמשים בהם בבריכות גדולות יותר של המיטוכונדריה.
שיקול חיוני נוסף הוא ריכוז התרופות המשמשות במהלך הפרוטוקולים. שינויים בריכוז הומוגני עשויים לשנות את הריכוזים של מצעים, uncouplers, ומעכבים הנדרשים לתגובה מקסימלית. לכן, לאחר בחירת טווח הריכוז האופטימלי, ניסוי הבודק את המינונים הנדרשים לפרוטוקול SUIT צריך להתבצע. ניתן להוסיף ADP נוסף כדי להבטיח שריכוזים אדנילט אינם מגבילים שטפי נשימה. כימיקלים unouplers כגון FCCP או CCCP יעכב נשימה בריכוזים גבוהים יותר22. ככזה, זה חיוני כדי titrate בכמויות קטנות כדי לחשוף את השיעור המרבי שהושג. מעכבים, כגון רוטנון ואנטימיצין A, משמשים בצורה הטובה ביותר כאשר הם רוויים בתוך הזריקה הראשונה. בעוד ריכוזים אופטימליים נקבעו בניסויים ראשוניים, ראינו גם הבדלים הקשורים לטיפול בתגובה מעכבים ולכן לעתים קרובות להוסיף זריקה אחת נוספת של מעכבים כדי להפגין עיכוב מקסימלי כמו שיעורי התוצאה לשמש כבסיס לכימות. עיכוב כימי של אסקורבאט/TPMD חיוני להפחתה אנליטית מדויקת מכיוון ש- TMPD עובר אוטוקסידציה23. שלטנו על חמצון אוטומטי של אסקורבט / TMPD / cytochrome c באמצעות תוספת של נתרן אזיד, מעכב אזרחי מבוסס. עבור מחקרי ק"מ, תוספת של רוטנון בנוכחות תמציתי לבד מונע הצטברות oxaloacetate אשר יכול לעכב פעילות דהידרוגנאז תמציתי בריכוזים נמוכים24. הנפח והריכוז של ADP תלויים מאוד ברגישות המיטוכונדריה לשילוב המצע השורר. תכשירים מיטוכונדריאליים רגישים מאוד ADP ידרשו ריכוזי התחלה נמוכים יותר. בנוסף, כימיקלים מאומתים והכנת תרופות נכונה עם תשומת לב ל- pH, רגישות לאור אם ישים, וטמפרטורת האחסון חיוניים לניסויים מוצלחים.
הגדרת מכשירים וטיפול שגרתי הם בעלי חשיבות קריטית להצלחת ניסויים אלה. ניקוי נאות ונכון של התאים חיוני להתרבות ומניעה של זיהום ביולוגי, חלבון, מעכב או לא משתף. אלקטרודות מסוג קלארק ומערכות O2k משתמשות בתאי תגובה מזכוכית המהווה יתרון עלות משמעותי למערכות מבוססות צלחת הנתמכות על חומרים מתכלים. עם זאת, תאי הזכוכית חייבים להיות מנוקים במרץ והוא יכול להיות מקור של זיהום מעכבות במחקרים הבאים. דגירה עם דגימות עשירות במיטוכונדריה במהלך תהליך הכביסה (מיטוכונדריה מבודדת של לב או כבד, למשל) יכולה להפחית את הסיכון לזיהום ניסיוני ומומלץ בנוסף להליכי דילול ושטיפה על בסיס אלכוהול. אם מחקרים רצופים מנוהלים, ניקוי עם אתנול ומיטוכונדריה ממזער את האפשרות של זיהום מעכבות. כיול חיישן החמצן מומלץ לפני כל ניסוי כדי לקבל מדידות מדויקות של נשימה ביחס ללחץ החלקי השורר של חמצן. אם כיולים מרובים אינם אפשריים, כיול אחד ביום עשוי להספיק אם ריכוז החמצן נשאר יציב ועקבי לאחר הליך הכביסה.
ההליכים המתוארים לעיל ממנפים את מכשיר Oroboros O2k למדידת צריכת חמצן ברקמת הגידול תוך 4 שעות של כריתת גידול באמצעות פתרון שימור תוכנן בעבר ואופטימיזציה ומדייתנשימה 25,26,27. ניתן לשנות פרמטרים מרובים בפרוטוקול זה עבור יישומים הבאים. ההתקנה וכיול המכשיר, homogenizers המשמש להכנת רקמות, וריכוז הומוגני אופטימלי חמצן התא ניתן להתאים את כולם לשימוש על מכשירים אחרים עם פוטנציאל ניטור חמצן. לדוגמה, התאים היו מעט מלאים יתר על המידה בעת הוספת הומוגני, ולכן כאשר התא סגור לחלוטין, נימי החדר נשאר מלא. זה יצרך קצת חמצן בחדר, אבל עם אופטימיזציה של ריכוז מדגם, אנחנו יכולים להסביר את הצריכה הזאת בקביעת מה רמת החמצן להתחיל עם. לחלופין, ניתן לאפשר לדגימה להתוות בחמצן סביבתי לפני סגירת התא, אך לעתים קרובות זה יגדיל את משך הזמן לפני תחילת הניסוי ויעכב את הוספת המצעים. בעוד homogenizers בשימוש בפרוטוקול זה נגישים באופן נרחב, טכניקות הומוגניזציה מסחרית אחרות ניתן להשתמש, כגון מגרסת רקמות או homogenizer אוטומטי28.
בנוסף, הכנת הרקמות ואת הליכי המכשיר ניתן להשתמש עם מספר SUITs שונים כדי ללמוד שליטה נשימתית על ידי מגוון של צימוד ובקרת מסלולים קובע29. פרוטוקולי SUIT אלה פותחו כדי למדוד יכולת תפקודית, ולכן, לתרומה של מצעים אנדוגניים פוטנציאליים אין השפעה על מדידת הקיבולת. אנו מבחינה אנליטית להסביר צריכת חמצן שאינם מיטוכונדריאליים ו /או צריכה שיורית של הומוגנט באמצעות חיסור של אנטיצין A-רוטנון, או נתרן אזיד שיעורי רגישות, לפי הצורך. המיטוכונדריה יכולה להישאר בת קיימא ב- BIOPS או פתרונות שימור שנבנו באופן דומה לתקופות זמן ממושכות (>24 שעות) בהתאם לסוג הרקמה ושלמות30,31. מחקרים יכולים להתבצע מראש כדי לקבוע את מגבלות האחסון הזמני כמו OXPHOS של מצעים מסוימים עשויים להיות מגבלות שונות. זה חיוני אם הניסוי לא יכול להתבצע בתוך כמה שעות של כריתת רקמות / ביופסיה. 37°C היא טמפרטורה אופטימלית ופיזיולוגית להערכת תפקוד הנשימה ברוב מערכות היונקים. עם זאת, אם נראה שטמפרטורת ההסתה מפריעה להערכה32, מחקרים השוואתיים עשויים להתבצע על פני טווח טמפרטורות רחב (25-40 מעלות צלזיוס) כדי להבטיח היענות נאותה. אילוצים אינסטרומנטליים עשויים להגביל את היכולת לנהל מחקרים כאלה.
המגבלות העיקריות של השיטה המתוארת לעיל הן 1) הפוטנציאל לפגיעה במיטוכונדריה באמצעות הומוגניזציה מכנית, 2) נוכחות של ATPases או ביוכימיקלים תת-תאיים אחרים בתכשירים הומוגניים שיכולים להפריע לקביעה סימולטנית של ATP או משתנים אחרים של עניין ועשויים לדרוש שיטות תיקון נוספות או שימוש במעכב33 ו-3) הערכה של דגימות רבות ו/או SUITs מרובים לכל מדגם גוזלת זמן רב מכיוון שמכשיר אחד יכול להכיל שני ניסויים בכל פעם ודורש ניקוי והגדרת ניסויים רצופים., ניסויי אופטימיזציה והכנה עקבית של דגימות יכולים למזער נזק מיטוכונדריאלי משמעותי שיתרום לנתונים לא עקביים.
המשמעות של השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות היא היתכנות משופרת בהשוואה לכמות החומר ההתחלתי, אתגר בידוד המיטוכונדריה, או אתגר טכני ברקמות מחלחלות. הכנת הומוגנטים מהירה יותר, חמצן אינו מגביל כמעט, והוא פחות רגיש לשונות בין כוח אדם לעומת רקמה מחלחלת. חשוב לציין, כמעט כל סוגי המדגם מתאימים להכנה הומוגנית המאפשרת ניתוח השוואתי על פני רקמות. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה היא המדידה בתקן הזהב של OXPHOS מיטוכונדריאלי ו- ET. היישום של שיטה זו במחקר סרטן פרה קליני וקליני יש את היכולת להרחיב את חקירות במבחנה הנוכחית מחקרים ex vivo. יתר על כן, הוא מציע יישומים פוטנציאליים בהגדרות קליניות ואבחון.

כל התאים מקושרים קשר הדוק על ידי הצורך שלהם לייצר ולצרוך אדנוסין טריפוספט (ATP), מטבע האנרגיה המולקולרית. כמו מוטציות הסלולר להוליד היווצרות של גידולים, המיטוכונדריה להבטיח הישרדות באמצעות גיוון של ייצור אנרגיה כי הוא לעתים קרובות פנוטיפי להבחין בין רקמות לא סרטניות1,2,3. ככזה, קיים צורך קריטי בפרופיל מהיר ועמוק של תפקוד הנשימה המיטוכונדריאלי על מנת להקל על סיווג סוג הגידול, חניכת הסרטן, התקדמות ותגובת הטיפול.
פונקציות נשימה של דגימות רקמה excised לא ניתן להעריך ללא פגע כמו המצעים העיקריים עבור OXPHOS אינם חדורים לתא. כדי להתגבר על מגבלה זו, המיטוכונדריה יכולה להיות מוכנה על ידי בידוד, פרמביליזציה כימית, או הומוגניזציה מכנית. בידוד מיטוכונדריאלי נחשב זה מכבר לסטנדרט זהב להערכת תפקוד הנשימה. עם זאת, זה דורש כמויות גדולות של רקמה, הוא זמן רב, והוא מניב נמוך עם הטיית בחירה אפשרית עבור שברים מסוימים של המיטוכונדריה4. Permeabilization מורכב הפרדה מכנית וחשיפה של קטעי רקמות או חבילות סיבים דטרגנט קל כי באופן סלקטיבי משפיל את קרום הפלזמה5. Permeabilization משמש לעתים קרובות ברקמות מפוספס כגון שריר השלד והלב כמו חבילות סיבים בודדים ניתן להקניט בנפרד. בהשוואה לבידוד, permeabilization מניב יותר מיטוכונדריה בסביבה התאית הטבעית שלהם ואת הצורה הפיזית5. פרמזביליזציה יושמה בהצלחה ברקמות אחרות כגון גידול6,7 ושליה8; עם זאת, רבייה של תכשירי סיבים מחלחלים יכול להיות קשה בשל עקביות של דרישות ביתור וחמצן כדי להתגבר על מגבלות דיפוזיה9. בנוסף, סיבים מחלחלים עשויים להיות לא מתאימים בסוגי גידולים מסוימים שהם תאיים צפופים וסיברוטיים מאוד. הומוגנטים רקמות נוצרים באמצעות הפרעה מכנית של קרום הפלזמה והם דומים סיבים permeabilized במונחים של תשואה מיטוכונדריאלית ושלמות10. הומוגנטים רקמות גם למזער את המגבלות של דיפוזיה חמצן והוא יכול להיות מועסק בקלות על פני סוגי רקמות באמצעות אופטימיזציה של כוח מכני11,12.
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה לכימות שיעורי זרחן חמצוני (OXPHOS) וקיבולת העברת אלקטרונים (ET) בהומוגנטים של גידול מוצק טרי. הפרוטוקול מתוכנן בצורה אופטימלית להערכת רקמה טרייה באמצעות נשימה ברזולוציה גבוהה של Oxygraph-2k (O2k), הדורש ידע מוקדם של התקנה וכיול אינסטרומנטליים אך ניתן להתאים אותו באופן דומה באמצעות כל אלקטרודה מסוג קלארק, מנתח סוסון ים או קורא לוחות. הפרוטוקול יכול להיות מיושם באופן רב על פני מינים וסוגי גידולים, כמו גם מותאם כדי להעריך מגוון של מסלולי ET מיטוכונדריאלי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

המיטוכונדריה חיוניים להתפרצות ולהתקדמות הסרטן באמצעות ייצור אנרגיה, ויסות מיני חמצן תגובתי וסינתזה מקרומולקולית. התאמות גנטיות ותפקודיות של המיטוכונדריה לסביבת הגידול מניעות פוטנציאל רב ונדעי. הופעתם של DNA ורצף RNA הסיר חסמים קריטיים להערכה של מתווכים גנטיים של tumorigenesis. עם זאת, עד כה, גישות מתודולוגיות להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי הגידול נשארות חמקמקות ודורשות מיומנות טכנית המגבילה את ההיתכנות, ובסופו של דבר מפחיתה את הערך האבחוני והפרוצדורלי הן בהגדרות ניסיוניות והן בסביבה קלינית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה לכימות שיעורי זרחן חמצוני (OXPHOS) וקיבולת העברת אלקטרונים (ET) בהומוגנטים של גידול מוצק טרי באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול יכול להיות מיושם באופן רב על פני מינים וסוגי גידולים, כמו גם מותאם כדי להעריך מגוון של מסלולי ET מיטוכונדריאלי. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מדגימים כי עכברים הנושאים סרטן ממארי B זוהרים מציגים נשימה פגומה של ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד והסתמכות על תמציתי כדי ליצור אדנוסין טריפוספט באמצעות OXPHOS.

מחקרים ראשוניים גילו כי גידולי EO771 היו חמצוניים נמוכים ולכן נדרש ריכוזים הומוגניים גבוהים להערכת שטף O2 נאותה. ניסויי אופטימיזציה נערכו כדי לקבוע את טווח הריכוז הומוגני רקמות אופטימלי עבור המחקר. גידול הומוגנטים הוכנו בתחילה ב 40 מ"ג / מ"ל ולאחר מכן מדולל ליניארית. השטף O2 מנורמל מסת רקמה היה עקבי על פני ריכוזים (איורים 1A-D). נצפתה כי 40 מ"ג/מ"ל גרמו לדלדול חמצן מהיר ולא היו מתאימים לניסויים(איור 1A). צריכת החמצן הואטה באופן משמעותי עם 30 מ"ג/מ"ל ו-20 מ"ג/מ"ל, אך עדיין ירדה במהירות תוך זמן קצר בהיעדר מצעים או ADP (איור 1B,C). ריכוז 10 מ"ג/מ"ל הביא לקצב צריכת החמצן האופטימלי(איור 1D)שיתמוך בפרוטוקול SUIT ארוך יותר של 90 דקות.
פרוטוקול SUIT שימש להערכת OXPHOS ו- ET הקשורים ל- NADH, כמו גם לפעילות CIV (איור 2A). Pyruvate ו malate נוספו לרקמה הומוגנית בהיעדר ADP לנהוג דליפה (L) באמצעות NADH. לאחר מכן נוספה ADP רוויה כדי להניע OXPHOS (P) מרבי הקשור ל-NADH, ואחריו תוספת של גלוטמט. ציטוכרום c נוסף אז כדי להבטיח שלמות הממברנה החיצונית; העלייה בשיעור הנשימה הייתה פחות מ-20% בכל הדגימות(איור 2B). בהתחשב בתגובה הנמוכה מאוד למצעים הקשורים ל-NADH, שחרור ציטוכרום c הוערך גם בנוכחות תמציתי ורוטנון ונצפה גירוי מינימלי של ציטכרום c (איור 2B). מעניין, OXPHOS הקשור NADH היה זניח בגידולים EO771(איור 2C). לאחר מכן נוספה תמציתי בנוכחות פירובט, מלאט וגלוטמט כדי לעורר את זרימת האלקטרונים דרך דהידרוגנאז תמציתי. לאחר מכן, FCCP זכה לתמיכת זרימת אלקטרונים מקסימלית (E), שגילתה כי בגידולי EO771, זרחן ולא חמצון מגביל לנשימה (איור 2C). רוטנון ואנטימיצין A היו לאחר מכן titrated לעכב מורכב I מורכב III, בהתאמה. אסקורבאט ו- TMPD נוספו אז כדי להניע זרימת אלקטרונים מקסימלית דרך CIV, אשר מעוכבת לאחר מכן על ידי נתרן אזיד. טבלה 1 מדגימה משוואות הפחתה אנליטיות של הנתונים הגולמיים (טבלה 2) כדי לכמות את הפרמטרים הנשימתיים המותווים באיור 2C. בסך הכל, פרופילי הנשימה ההומוגניים של הגידול (איור 2C) דומים לאלה של תאי EO771 שאינם מושתלים - מחלחלים לדיג'נין (איור 2D) למעט העברת אלקטרונים מקסימלית מופחתת הנתמכת על ידי מצעים המקושרים ל- N ו- S בגידול.
מאז הנשימה הקשורה NADH היה זניח, הקינטיקה הנשימתית של תמציתי הוערכו עוד יותר על ידי titrations צעדים של ADP תת רווי עד השיעור המקסימלי (VMAX)הושג (איור 3A,3B). הריכוז החצי מקסימלי (KM)של ADP בנוכחות תמציתי + רוטנון היה 37.5 מיקרומטר, ואילו VMAX היה ~ 10.5 pmol / s / mg (איור 3C). לכן, למרות שיעורי חמצון ירודים יחסית, גידולי EO771 היו רגישים מאוד ADP וסינתזת ATP מתמשכת בריכוזים ADP נמוכים יחסית.
בחירת אזורים מתאימים של הנתונים הגולמיים לחילוץ היא קריטית לשחזור ניסויים וכימות מדויק. עבור ציטוכרום c,יש לבחור סימן במצב היציב מיד לפני ההזרקה(איור 4A, סימן 1). לעתים קרובות יש חפץ הזרקה ראשונית שניתן לעקוב אחר פרק זמן (כ 5-10 דקות) שבו השטף O2 אינו יציב. הערכה של יעילות cytochrome c נעשית על ידי ביצוע בחירה נוספת לאחר שטף O2 התייצב (איור 4A, סימן 2). בחירות לאחר הוספת מצעים, ADP, או רוב המעכבים נעשות גם לאחר חפץ ההזרקה וברגע שטף O2 התייצב (איור 4B). הבחירה המשמשת לקביעת נשימה מקסימלית לא מרוסנת נעשית בשיא העלייה שהושגה במהלך טיטורציה של FCCP, שהיא לעתים קרובות לא הזריקה האחרונה שנעשתה (איור 4C). הבחירה עבור TMPD נעשית לאחר הוספת אסקורבאט ו- TMPD ובשיא העלייה בנשימה (איור 4D, סימן 1). רק לאחר שיא זה, המעכב, נתרן אזיד, מתווסף, אשר מקטין במהירות את הנשימה אבל גם לעתים קרובות יש חפץ הזרקה נמוך יותר מאשר שיעור הנשימה המעכבת (איור 4D). סימן המדכא נעשה מיד לאחר חפץ ההזרקה(איור 4D, סימן 2). שטף O2 בדרך כלל לא יתייצב וימשיך לרדת.
טבלה 1: תיוון נשימתי וגזרה אנליטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: מאפיינים מדגמיים ונשימה של גידול ממארי B זוהר הומוגנטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> איור 1: אופטימיזציה של ריכוז הומוגניאט גידול. O2 שטף (אדום) ו O2 ריכוז (כחול) הומוגנטים גידול mammary מוכן ב (A) 40 מ"ג / מ"ל, (B) 30 מ"ג / מ"ל, (C) 20 מ"ג / מ"ל, ו (D) 10 מ"ג / מ"ל. תום: נשימה הומוגנית של רקמות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> איור 2: הערכת OXPHOS וקיבולת ET על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה בהומוגנטים של גידולים שנקטעו זה עתה. (A)חלקה מייצגת של צריכת חמצן (אדום) וריכוזים (כחול) במהלך פרוטוקול מצע, מעכב, לא משתף פעולה. PM: Pyruvate + Malate, D: ADP, G: גלוטמט, c: ציטכרום c, S: תמציתי, F: FCCP, רוט: רוטנון, אמא: אנטימיצין A, Asc / TMPD: אסקורבט / טטראמתיל-p-פנילנדיאמין. (B)עלייה באחוזים בשטף O2 עם תוספת של ציטוכרום c. (C-D) נשימה הנתמכת על ידי מלאט, פירובט, גלוטמט ותמצית בנוכחות ADP, FCCP, ו ascorbate / TMPD ב (C) הומוגנטים גידול שמקורם EO771 ו -( D)תאים שאינם מושתלים EO771 דיגיטונין permeabilized. טום: נשימה הומוגנית של רקמות; PM: פירובט + מלאט; PMG: פירובט + מלאט + גלוטמט; PMGS: פירובט + מלאט + גלוטמט + תמציתי; אזרחי: מורכב 4; -L: מצב דליפה; -P: מצב זרחן חמצוני, -E: מצב העברת אלקטרונים; N מקושר: O2 שטף נתמך על ידי שילובי מצע מוגדרים NADH יצירת; NS מקושר: O2 שטף נתמך על ידי התכנסות של שילובי מצע מוגדרים NADH ליצור תמציתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> איור 3: גידולי EO771 ממכר הציגו רגישות גבוהה ל-ADP (אדנוסין 5′-דיפוספט). (A)חלקה מייצגת של צריכת חמצן (אדום) וריכוזים (כחולים) לאורך פרוטוקול טיטריון ADP מקושר S. טום: נשימה הומוגנית של רקמות; ש/רוט: תמציתי/רוטנון; ד: א.ד. (B)נשימה הנתמכת על ידי תמציתי בנוכחות רוטנון וריכוזים גוברים של ADP (0 μM ADP = S / Rot-L). (C)שיעור מקסימלי (VMAX)וריכוז חצי מקסימלי (KM)של ADP בנוכחות תמציתי + רוטנון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> איור 4: מעקב ייצוגי הממחיש את בחירת הסימנים של שטפי O2 גולמיים להפקת נתונים. (A)בחירת Cytochrome c: בחירה מספר 1 לפני הזרקת Cytochrome c ובחירה מספר 2 לאחר ההזרקה כאשר שטף O2 התייצב. c ציטכרום ג. (B)מצע, ADP, ובחירת מעכב: בחירה מספר 1 לאחר הזריקה (תמציתי בעלילה מייצגת זו) שבו שטף O2 התייצב. ס:תמציתי. (C)בחירת ביטול קירור: בחירה מספר 1 בשיא העלייה בנשימה במהלך titration uncoupler. בעלילת טיטריון FCCP מייצגת זו, הזריקה השלישית מקטינה מעט את הנשימה ולכן אינה משמשת לבחירה. פ: ACCP. (D)בחירת TMPD: בחירה מספר 1 בשיא העלייה של הנשימה לאחר זריקות אסקורבאט ו- TMPD. בחירת נתרן אזיד: בחירה מספר 2 לאחר חפץ הזרקה חריפה כאשר הנשימה בתחילה פוחתת. As/Tm: אסקורבאט/TMPD; אזיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

פיתחנו פרוטוקול מעשי וגישה אנליטית להערכת זרחן חמצוני מיטוכונדריאלי ויכולת העברת אלקטרונים בהומוגנטים של גידול טרי. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לסקור פונקציות מיטוכונדריאליות שונות התורמות ייזום סרטן, התקדמות, תגובה לטיפול.

קביעה אנליטית של תפקוד מיטוכונדריאלי של הומוגנטים של גידול מוצק מובחר

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ומהירה למדידת תפקוד מיטוכונדריאלי של הגידול. הפרוטוקול חל באופן נרחב על אונקולוגיה תרגומית קלינית, ויסייע בשיפור הפרשנות האבחונית והמכניסטית של תפקיד המיטוכונדריה בהתפרצות ובהתקדמות הסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היישום של הומוגניזציה רקמות כדי לפשט את ההכנה ולמקסם את התשואה של המיטוכונדריה תוך צמצום מגבלות הדיפוזיה.טכניקה זו מציעה יישומים פוטנציאליים בהגדרות קליניות ואבחון עם הערכה כמותית של תפקוד מיטוכונדריאלי הגידול באמצעות רקמת גידול ביופסיה או מובאת. התחל על ידי הצבת homogenizer זכוכית המכיל מיליליטר אחד של מדיום נשימה מיטוכונדריאלי, או MiR05, עלה זכוכית מתאים היטב על קרח רטוב. מניחים את הרקמה במיליליטר אחד של פתרון שימור ביופסיה, או BIOPS, בצלחת פטרי קרה כקרח.חותכים את הגידול לחתיכות קטנות של כ 5 עד 10 מיליגרם כל אחד, ומניחים את חתיכות הגידול הנותרות בחזרה ל 10 מיליליטר של BIOPS נשמר על קרח. לאחר ניפוח חלקי הרקמה בזהירות על נייר סינון, מניחים אותם על סירת שקילה קטנה עם זפת פלסטיק ומתעדים את המשקל הרטוב הראשוני. מניחים את החלקים שאינם בשימוש בחזרה לתוך הצינור החרוט 10 מיליליטר של BIOPS להמשך שימור.שקועים בקטעי הרקמה בהומוגניזר קר כקרח המכיל MiR05 ומתעדים את המשקל הנותר על סירת השקילה. באמצעות עלה זכוכית עם טווח פינוי של 0.09 עד 0.16 מילימטרים, בעדינות לשבש את רקמת הגידול על ידי השלמת חמש עד שבע משיכות למטה ולמעלה. עבור כל משיכה, סובב את העלי בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון שלוש פעמים תוך דחיפת העלי כלפי מטה, ושלוש פעמים נוספות תוך משיכת העלי בחזרה למעלה.אפשר לרקמה להתיישב לתחתית ההומוגניזר בין משיכות, אך הימנע מהבאת העלי במלואו מעל נפח הנוזלים כדי למנוע הקצפה. יוצקים את ההומוגנאט לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ומניחים אותו על קרח. פיפטה 1 עד 3 מיליליטר של MiR05 טרי מעל עלה לתוך homogenizer לשטוף כל רקמה הומוגנית שנותרה.יוצקים את שטיפת MiR05 לתוך הצינור החרוט המכיל הומוגנטי. חזור על שלב זה פעמיים עד שלוש פעמים כדי להבטיח העברה מלאה של הומוגני. כדי לחשב במדויק את ריכוז הרקמה הומוגנית, בדוק בקפידה את homogenizer ואת הומוגנט עבור חומר לא הומוגני הנותרים, הכולל רקמת חיבור.כדי להסיר את החומר הלא הומוגני מן homogenizer כי לא ניתן להגיע עם פינצטה, לאחר הוספת MiR05 הומוגניזר, לשאוף את הנפח, כולל הרקמה, עם pipette ולהעביר את התוכן לצלחת פטרי. הסר את החומר הלא הומוגני התיישב בחתיכות גדולות בתחתית הצינור חרוטי מן הומוגנט על ידי שאיפה אותם עם פיפטה, ומניחים אותם על מכסה הצינור חרוטי. הסר את הרקמה מצלחת פטרי או כובע צינור חרוטי עם פינצטה, ולהכתים אותו על נייר מסנן.מוסיפים את ההומוגנית הנותרת מכובע הצינור החרוט בחזרה לצינור החרוט. כובע הצינור, ואז הפוך לערבב. לבחון מחדש את homogenizers הומוגניסט עבור כל חומר נוסף לא הומוגני, ולחזור על השלבים כדי להסיר חומר לא הומוגני במידת הצורך.שקול ומתעד את המסה של החומר הלא הומוגני התאושש מן homogenizer. בדוק את ההכנה הומוגנית עבור כל רקמה שלם ברוטו הועבר, והסיר את החלקים שאינם הומוגניים ולשקול לפי הצורך. הפחת את משקל הרקמה התאושש מסירת השקילה, homogenizer, הומוגניאט מן המשקל הרטוב הראשוני כדי לחשב את משקל המדגם הסופי.באמצעות משקל המדגם הסופי, להוסיף MiR05 נוסף כדי להביא הומוגנט לריכוז הרצוי. ברגע שההומוגנטים נשקלים ומוכנים, המשיכו לבצע את ההסתה בהקדם האפשרי. שמור את המדגם מאוחסן על קרח רטוב עד שהוא מועבר למכשיר.לאחר המכשיר מכויל ואת המדגם מוכן, להסיר את פקקים עם תנועה מפותלת ולשאף MiR05 מן התאים, הימנעות הממברנה חשופה בתוך התא. מערבבים את הבאר הומוגנית, ומוסיפים 2.25 מיליליטר של הומוגנט לתא. נניח הומוגנט אחד מתווסף לתאים מרובים, pipette אחד מיליליטר של הומוגנט בכל פעם לתוך כל תא תוך ערבוב הומוגני כדי להבטיח התפלגות רקמות שווה.לחץ על F4 כדי לתת שם וחותמת זמן של האירוע, ולאחר מכן לחץ על אוקיי. מלא מזרק 50 מיליליטר עם חמצן ממיכל חמצן עם וסת צינורות גז באמצעות מחט קהה 18 מד. הזריקו את החמצן ישירות לתאים כדי להגזים אותם לכ-500 חמצן מיקרומולרי.הכנס באופן רופף את פקקים ולחכות לסגור עד החמצן מגיע כ 480 מיקרומולר. עם תנועה מפותלת, לסגור לאט את התא ולאפשר את הנשימה כדי שיווי משקל במשך כ 15 עד 20 דקות. מלאו את נימיו המרכזיים של הבלם ב-MiR05 במידת הצורך.השתמש מיקרו מזרקים ייעודיים כדי להזריק מצעים, uncouplers, מעכבים לתוך תאים סגורים לחלוטין שם חותמת זמן האירועים עבור כל תא בזמן אמת. בחר F6 כדי להתאים את ריכוז החמצן ואת קשקשים שליליים שיפוע חמצן לפי הצורך. לאחר כל זריקה, לשטוף את המזרק שלוש פעמים במים עבור תרכובות מסיסות במים, ו 70% אתנול עבור תרכובות מומס אתנול.מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של 0.8-טוחנת malate ולהמשיך מיד לזריקה הבאה. לשטוף את מזרק הזריקה שלוש פעמים במים. מוסיפים מיד חמישה מיקרוליטרים של פירובט 1-טוחן, ומחכים שהנשימה תתייצב.לאחר שטיפת המזרק, להוסיף 10 microliters של 0.5-טוחנת ADP ולחכות תגובת ADP להתייצב. לשטוף את המזרק ולהוסיף חמישה microliters של גלוטמט 2-טוחנת ולחכות הנשימה להתייצב. לשטוף את המזרק, ולאחר מכן להוסיף חמישה microliters של 4 מילימולר cytochrome-C, ולחכות הנשימה להתייצב.לאחר שטיפת המזרק, מוסיפים 20 מיקרוליטרים של תמציתי 1-טוחנת ומחכים להתייצבות הנשימה. טיטרט 0.5-1-microliter תוספות של FCCP 1 מילימולר ולחכות הנשימה להתייצב לאחר כל זריקה. המשך עד שלא תהיה עלייה נוספת בנשימה.לשטוף את מזרק הזריקה שלוש פעמים ב 70%אתנול. הוסף שני מיקרוליטרים של רוטנון 150 מיקרומולר ולחכות הנשימה להתייצב. הוסף עוד מיקרוליטר אחד של רוטנון כדי להבטיח שאין עיכוב נוסף.אם יש ירידה בנשימה, להמשיך עם זריקות נוספות עד שאין ירידה בנשימה, ולאחר מכן לשטוף את מזרק הזרקה שלוש פעמים ב 70%אתנול. הוסף שני מיקרוליטרים של אנטימיצין 125 מיקרומולרי A ולחכות להנשימה להתייצב. הוסף עוד מיקרוליטר אחד של אנטימצין A כדי להבטיח שאין עיכוב נוסף.אם יש ירידה בנשימה, להמשיך עם זריקות נוספות עד שאין ירידה בנשימה. לשטוף את המזרק שלוש פעמים עם 70% אתנול. בדוק את ריכוז החמצן של התא.אם הריכוז הוא מתחת 125-micromolar, reoxygenate לאוויר החדר, או hyperoxygenate קלות כדי להבטיח כי חמצן אינו מגביל את שטף הנשימה. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של אסקורבאט 0.8-טוחן. לשטוף את המזרק שלוש פעמים ב 70% אתנול.הוסיפו מיד 10 מיקרוליטרים של TMPD 0.2-טוחנת, והמתינו לעלייה בנשימה. לאחר שטיפת המזרק עם אתנול, להוסיף 25 microliters של 4-טוחנת נתרן אזיד מיד כאשר שטף הנשימה של הרמות TMPD אסקורבט. סיים את על-ידי לחיצה על קובץ, שמור והתנתק.זה נצפתה כי 40 מיליגרם למיליליטר של הומוגניאט רקמה הביא דלדול חמצן מהיר. צריכת החמצן הואטה באופן משמעותי עם 30 ו 20 מיליגרם למיליליטר של הומוגנייט רקמות, אבל עדיין ירד במהירות תוך זמן קצר בהיעדר מצעים או ADP. ריכוז 10 מיליגרם למיליליטר של הומוגנט רקמות הביא שיעור צריכת חמצן אופטימלי.פרוטוקול SUIT שימש להערכת זרחן חמצוני הקשור ל- NADH ותמצית והעברת אלקטרונים, כמו גם פעילות מורכבת של IV. שחרור Cytochrome C הוערך בנוכחות פירובט ומלאטה, או תמציתי ורוטנון, שניהם גילו כי ההכנה הומוגנית לא פגעה במיטוכונדריה. נמצא גם כי זרחן חמצוני הקשור NADH היה זניח בגידולים EO771.טיטורציה של FCCP כדי להניע זרימת אלקטרונים מקסימלית גילתה כי בגידולים EO771, זרחן, ולא חמצון, היה מוגבל לנשימה. פרופילי הנשימה ההומוגניים של הגידול היו דומים לאלה של תאי EO771 שאינם מושתלים, חד-מיניים, למעט העברת אלקטרונים מקסימלית מופחתת הנתמכת על ידי מצעים המקושרים ל- N ו- S בגידול. הקינטיקה הנשימתית של תמציתי הוערכו עוד יותר על ידי titrations צעדים של ADP תת רווי עד השיעור המקסימלי הושג.הריכוז החצי מקסימלי של ADP בנוכחות תמציתי ורוטנון היה 37.5 מיקרומולר, בעוד השיעור המקסימלי היה כ 10.5 פיקומולים לשנייה, למיליגרם. מכשירים שהוקמו בטיפול שגרתי, כמו גם טיפול ברקמות, הם בעלי חשיבות קריטית להצלחת ניסויים אלה. בעקבות נהלים אלה, ניתן ליישם גישות אחרות ספציפיות להמוניה או לסמן כדי לדרג נורמליזציה על בסיס שאלת העניין.האמצעים הנפוצים כוללים כימות חלבונים כולל ופעילות אנזימטית של סינתאז סיטראט, אך משתנים בהתאם למערכת המודלים, העיצוב הסטטיסטי ושאלת המחקר.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

ניתוח אוכלוסיית הצד בקווי תאים סרטניים מלאים

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

תסיסה אוטומטית של כתמים גרעיניים דיפרנציאליים לקביעה מדויקת של ציטוקוקסיות מיטוקאן

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

מידול גידולי עצם ראשוניים וגרורות עצם עם השתלת גידול מוצק השתלת עצם לעצם

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

חקר חילוף החומרים של אנרגיה מיטוכונדריאלית של כדוריות מיקרוטיסו תלת-ממדיות בודדות באמצעות ניתוח שטף חוץ-תאי

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...