Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
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Ringraziamo lo staff del Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core per la cura degli animali. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalle sovvenzioni del National Institute of Health U54GM104940 (JPK) e KL2TR003097 (GAL). Tutti gli esperimenti e le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo lavoro.

Gli approcci per valutare la respirazione mitocondriale nel cancro sono stati in gran parte limitati ai modelli in vitro 13,14,15,16. Un certo successo è stato raggiunto nella misurazione della respirazione mitocondriale nei tumori utilizzando la permeabilizzazione chimica6,7,17,ma non esiste un approccio uniforme e gold standard che possa essere universalmente applicato e confrontato tra i tipi di tumore. Inoltre, la mancanza di analisi e report dei dati coerenti ha limitato la generalizzabilità e la riproducibilità dei dati. Il metodo qui delineato fornisce un approccio semplice e relativamente rapido per misurare la respirazione mitocondriale18 in preparati mitocondriali da campioni di tumore solido appena asportati. I tumori sono stati coltivati da cellule tumorali mammarie murine Luminal B impiantate ortotopicamente, ERα-negative EO77119.
La diligenza e la cura con la manipolazione dei tessuti miglioreranno notevolmente l'accuratezza e la normalizzazione dei tassi di consumo di ossigeno. Il tessuto e i mitocondri possono essere facilmente danneggiati se il campione non viene mantenuto freddo, non è costantemente immerso nei mezzi di conservazione o viene eccessivamente maneggiato, con conseguente routine non ottimale e tassi di OXPHOS. Inoltre, il peso umido accurato del tessuto omogeneizzato è di fondamentale importanza in quanto questo è il metodo di normalizzazione primario. Possono essere presi in considerazione altri metodi di normalizzazione, come la proteina totale o i marcatori specifici mitocondriali, come l'attività della citrato sintasi20. Inoltre, l'eterogeneità dei tessuti dovrà essere affrontata, con decisioni sulle regioni tumorali da includere negli esperimenti fatti a priori. Necrotico, fibrotico e tessuto connettivo potrebbero non omogeneizzare e / o respirare bene e dovrebbero essere evitati a meno che non si analizzi intenzionalmente queste regioni tumorali. In particolare, il tumore può essere molto appiccicoso a seconda del tipo e della regione di escissione, rendendo più difficile la pesatura e il trasferimento accurati. Il numero di colpi utilizzati per le omogeneizzazioni deve essere ottimizzato per garantire la completa preparazione dei mitocondri mitigando i danni alle membrane mitocondriali esterne.
Per migliorare l'accuratezza e la riproducibilità, si consiglia di eseguire esperimenti di ottimizzazione per il numero di colpi per la preparazione omogenea, la concentrazione dei tessuti e le concentrazioni di substrato, disaccoppiatore, inibitore. Gli studi possono confrontare il diverso numero di ictus e come corrispondono alla risposta all'aggiunta di citocromo c all'interno dello studio, nonché la capacità respiratoria mitocondriale massima 21. Sebbene vi sia un'accettazione generale che una minore risposta al citocromo c sia migliore, poiché un aumento del consumo di ossigeno dopo l'aggiunta del citocromo c può indicare danni alla membrana mitocondriale esterna, non esiste un gold standard su quale sia questa soglia per ogni tessuto e dovrebbe essere studiato sperimentalmente per garantire che il tessuto non sia sovraccarico o poco preparato. In questo tessuto tumorale, è stato riscontrato che una risposta al citocromo c inferiore a ~ 30% non compromette la funzione respiratoria. L'uso del citocromo c diventa fondamentale per una quantificazione accurata della capacità respiratoria se il test è positivo. In questo caso, l'aggiunta reintegra il citocromo c endogeno, che, se esaurito, causerà una sottostima delle frequenze respiratorie.
Gli esperimenti di titolazione della concentrazione tissutale possono essere eseguiti su una gamma di concentrazioni fattibili e, idealmente, sarebbero fatti con SUIT che saranno studiati durante lo studio. La capacità respiratoria varia in base al tipo di tumore e alla composizione. Pertanto, i tumori densi di mitocondri o alta capacità respiratoria richiederanno concentrazioni più basse (0,5-5 mg / ml). I tumori con pochi mitocondri o bassa capacità respiratoria richiedono concentrazioni più elevate (7-12 mg / ml). Inoltre, i SUIT lunghi o con substrati altamente consumati potrebbero aver bisogno di meno tessuto per prevenire la riossigenazione della camera o la limitazione dell'ADP. Alcuni tessuti avranno una relazione lineare nel consumo di ossigeno, mentre altri mostreranno una migliore sensibilità e la massima ossidazione a determinati intervalli di concentrazione. La concentrazione tissutale scelta deve essere ottimizzata per massimizzare il flusso di ossigeno limitando il numero di eventi di riossigenazione. Inoltre, è spesso meglio sopravvalutare la necessità o mirare alla fascia più alta dell'intervallo di concentrazione. Gli inibitori, che sono essenziali per la quantificazione dei flussi respiratori, sono più precisi se utilizzati in pool più grandi di mitocondri.
Un'altra considerazione essenziale è la concentrazione dei farmaci che vengono utilizzati durante i protocolli. I cambiamenti nella concentrazione di omogeneizzati possono alterare le concentrazioni di substrati, disaccoppiatori e inibitori necessari per la risposta massima. Pertanto, una volta scelto l'intervallo di concentrazione ottimale, deve essere eseguito un esperimento che testa le dosi richieste per il protocollo SUIT. È possibile aggiungere ulteriore ADP per garantire che le concentrazioni di adenilato non siano limitanti ai flussi respiratori. Gli sganciatori chimici come FCCP o CCCP inibiscono la respirazione a concentrazioni più elevate22. Pertanto, è essenziale titolare in piccole quantità per rivelare il tasso massimo raggiunto. Gli inibitori, come il rotenone e l'antimicina A, sono meglio utilizzati quando saturi entro la prima iniezione. Mentre le concentrazioni ottimali sono state determinate in esperimenti preliminari, abbiamo anche osservato differenze correlate al trattamento nella risposta agli inibitori e quindi spesso aggiungiamo un'ulteriore iniezione di inibitori per dimostrare la massima inibizione poiché i tassi risultanti servono come base per la quantificazione. L'inibizione chimica dell'ascorbato/TPMD è essenziale per un'accurata riduzione analitica in quanto il TMPD subisce l'autoossidazione23. Abbiamo controllato l'auto-ossidazione di ascorbato / TMPD / citocromo c attraverso l'aggiunta di azide di sodio, un inibitore CIV stabilito. Per gli studi Km, l'aggiunta di rotenone in presenza di succinato da solo previene l'accumulo di ossalacetato che può inibire l'attività della succinato deidrogenasi a basse concentrazioni24. Il volume e la concentrazione di ADP dipendono fortemente dalla sensibilità dei mitocondri alla combinazione prevalente di substrato. I preparati mitocondriali altamente sensibili all'ADP richiederanno concentrazioni iniziali più basse. Inoltre, le sostanze chimiche convalidate e la corretta preparazione del farmaco con attenzione al pH, alla sensibilità alla luce, se applicabile, e alla temperatura di conservazione sono essenziali per esperimenti di successo.
La configurazione degli strumenti e la cura di routine sono di fondamentale importanza per il successo di questi esperimenti. Un'adeguata e corretta pulizia delle camere è essenziale per la riproducibilità e la prevenzione della contaminazione biologica, proteica, inibitore o disaccoppiatore. Gli elettrodi di tipo Clark e i sistemi O2k utilizzano camere di reazione in vetro, il che rappresenta un vantaggio significativo in termini di costi per i sistemi basati su piastre che si basano su materiali di consumo. Tuttavia, le camere di vetro devono essere pulite vigorosamente e possono essere una fonte di contaminazione inibitore in studi successivi. L'incubazione con campioni ricchi di mitocondri durante il processo di lavaggio (mitocondri isolati a cuore o fegato, ad esempio) può ridurre il rischio di contaminazione sperimentale ed è raccomandata in aggiunta alle procedure di diluizione e lavaggio a base alcolica. Se vengono eseguiti studi consecutivi, la pulizia con etanolo e mitocondri riduce al minimo la possibilità di contaminazione da inibitori. Si raccomanda la calibrazione del sensore di ossigeno prima di ogni esperimento per ottenere misurazioni accurate della respirazione rispetto alla pressione parziale prevalente dell'ossigeno. Se non sono possibili calibrazioni multiple, una calibrazione al giorno può essere sufficiente se la concentrazione di ossigeno rimane stabile e costante dopo la procedura di lavaggio.
Le procedure sopra descritte sfruttano lo strumento Oroboros O2k per misurare il consumo di ossigeno nel tessuto tumorale entro 4 ore dall'escissione del tumore utilizzando una soluzione di conservazione e mezzi respiratori precedentemente progettati e ottimizzati25,26,27. Più parametri in questo protocollo possono essere modificati per le applicazioni successive. La configurazione e la calibrazione dello strumento, gli omogeneizzatori utilizzati per la preparazione dei tessuti e la concentrazione ottimale di ossigeno omogeneizzato e camera possono essere adattati per l'uso su altri strumenti con potenziale di monitoraggio dell'ossigeno. Ad esempio, le camere erano leggermente sovrariempite quando si aggiungeva l'omogeneizzato, e quindi quando la camera è completamente chiusa, il capillare della camera rimane pieno. Questo consumerà un po 'di ossigeno nella camera, ma con l'ottimizzazione della concentrazione del campione, possiamo spiegare questo consumo nel determinare con quale livello di ossigeno iniziare. In alternativa, il campione può essere lasciato equilibrare all'ossigeno ambiente prima che la camera sia chiusa, ma questo spesso aumenta la quantità di tempo prima dell'inizio dell'esperimento e ritarda l'aggiunta di substrati. Mentre gli omogeneizzatori utilizzati in questo protocollo sono ampiamente accessibili, potrebbero essere impiegate altre tecniche di omogeneizzazione commerciale, come un trituratore di tessuti o un omogeneizzatore automatizzato28.
Inoltre, la preparazione dei tessuti e le procedure strumentali possono essere utilizzate con una serie di diversi SUIT per studiare il controllo respiratorio attraverso una varietà di stati di accoppiamento e controllo del percorso29. Questi protocolli SUIT sono stati sviluppati per misurare la capacità funzionale e, quindi, il contributo di potenziali substrati endogeni non ha alcun impatto sulla misurazione della capacità. Teniamo conto analiticamente del consumo di ossigeno non mitocondriale e / o del consumo residuo dell'omogeneizzato attraverso la sottrazione dell'antimicina A-rotenone, o tassi insensibili all'azide di sodio, a seconda dei casi. I mitocondri possono rimanere vitali in BIOPS o soluzioni di conservazione costruite in modo simile per lunghi periodi di tempo (>24 h) a seconda del tipo di tessuto e dell'integrità30,31. Gli studi possono essere effettuati in anticipo per determinare i limiti di conservazione temporale in quanto OXPHOS di alcuni substrati può avere limitazioni diverse. Questo è essenziale se l'esperimento non può essere eseguito entro diverse ore dall'escissione tissutale / biopsia. 37°C è una temperatura ottimale e fisiologica per la valutazione della funzione respiratoria nella maggior parte dei sistemi di mammiferi. Tuttavia, se la temperatura del saggio sembra interferire con la valutazione32, possono essere condotti studi comparativi in un ampio intervallo di temperatura (25-40 °C) per garantire un'adeguata reattività. I vincoli strumentali possono limitare la capacità di condurre tali studi.
I principali limiti del metodo sopra descritto sono 1) il potenziale danno ai mitocondri attraverso l'omogeneizzazione meccanica, 2) la presenza di ATPasi o di altri biochimici subcellulari in preparati omogeneizzati che possono interferire con la determinazione simultanea di ATP o altre variabili di interesse e possono richiedere ulteriori metodi di correzione o l'uso di inibitori33 , e 3) la valutazione di molti campioni e/o di più SUIT per campione richiede molto tempo in quanto uno strumento può ospitare due esperimenti alla volta e richiede la pulizia e l'impostazione tra esperimenti successivi. Esperimenti di ottimizzazione e preparazione coerente dei campioni possono ridurre al minimo i danni mitocondriali sostanziali che contribuirebbero a dati incoerenti.
L'importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti / alternativi è una migliore fattibilità rispetto alla quantità di materiale di partenza, alla sfida di isolare i mitocondri o alla sfida tecnica nella permeabilizzazione del tessuto. La preparazione degli omogeneizzati è più veloce, l'ossigeno non è così limitante ed è meno suscettibile alla variabilità tra il personale rispetto al tessuto permeabilizzato. È importante sottolineare che quasi tutti i tipi di campione sono adatti per la preparazione di omogeneizzati che consente l'analisi comparativa tra i tessuti. La respirometria ad alta risoluzione è la misura gold standard di OXPHOS e ET mitocondriale. L'applicazione di questo metodo nella ricerca pre-clinica e clinica sul cancro ha la capacità di espandere le attuali indagini in vitro agli studi ex vivo. Inoltre, offre potenziali applicazioni in contesti clinici e diagnostici.

Tutte le cellule sono intimamente legate dalla loro necessità di produrre e consumare adenosina trifosfato (ATP), la valuta dell'energia molecolare. Poiché le mutazioni cellulari danno origine alla formazione di tumori, i mitocondri assicurano la sopravvivenza attraverso la diversificazione della produzione di energia che è spesso fenotipicamente distinguibile dal tessuto non canceroso1,2,3. Pertanto, vi è un bisogno critico di profilazione rapida e profonda della funzione respiratoria mitocondriale al fine di facilitare la classificazione del tipo di tumore, l'inizio del cancro, la progressione e la risposta al trattamento.
Le funzioni respiratorie dei campioni di tessuto asportato non possono essere valutate intatte in quanto i substrati primari per OXPHOS non sono permeabili alle cellule. Per superare questa limitazione, i mitocondri possono essere preparati mediante isolamento, permeabilizzazione chimica o omogeneizzazione meccanica. L'isolamento mitocondriale è a lungo considerato un gold standard per la valutazione della funzione respiratoria. Tuttavia, richiede grandi quantità di tessuto, richiede molto tempo ed è a basso rendimento con possibili bias di selezione per alcune frazioni di mitocondri4. La permeabilizzazione consiste nella separazione meccanica e nell'esposizione di sezioni di tessuto o fasci di fibre a un detergente delicato che degrada selettivamente la membranaplasmatica 5. La permeabilizzazione è spesso impiegata nei tessuti striati come il muscolo scheletrico e cardiaco poiché i singoli fasci di fibre possono essere presi in giro. Rispetto all'isolamento, la permeabilizzazione produce più mitocondri nel loro ambiente cellulare nativo e forma fisica5. La permeabilizzazione è stata applicata con successo in altri tessuti come il tumore6,7 e la placenta8; tuttavia, la riproducibilità dei preparati di fibre permeabilizzate può essere difficile a causa della consistenza della dissezione e dei requisiti di ossigeno per superare i limiti di diffusione9. Inoltre, le fibre permeabilizzate possono essere inadatte in alcuni tipi di tumore che sono densamente cellulari e altamente fibrotici. Gli omogeneizzati tissutali sono generati attraverso la distruzione meccanica della membrana plasmatica e sono simili alle fibre permeabilizzate in termini di resa e integrità mitocondriale10. Gli omogeneizzati tissutali minimizzano anche i limiti della diffusione dell'ossigeno e possono essere facilmente impiegati tra i tipi di tessuto attraverso l'ottimizzazione della forza meccanica11,12.
Qui, delineiamo un metodo semplice e rapido per quantificare i tassi di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e la capacità di trasferimento di elettroni (ET) negli omogeneizzati tumorali solidi appena asportati. Il protocollo è progettato in modo ottimale per valutare il tessuto fresco utilizzando il respirometro ad alta risoluzione Oxygraph-2k (O2k), che richiede una conoscenza preliminare della configurazione e della calibrazione strumentale, ma può essere adattato in modo simile utilizzando qualsiasi elettrodo di tipo Clark, analizzatore Seahorse o lettore di piastre. Il protocollo può essere applicato in modo riproducibile tra specie e tipi di tumore, nonché adattato per valutare una diversità di percorsi ET mitocondriali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

I mitocondri sono essenziali per l'insorgenza e la progressione del cancro attraverso la produzione di energia, la regolazione delle specie reattive dell'ossigeno e la sintesi delle macromolecole. Gli adattamenti genetici e funzionali dei mitocondri all'ambiente tumorale guidano il potenziale proliferativo e metastatico. L'avvento del sequenziamento del DNA e dell'RNA ha rimosso le barriere critiche alla valutazione dei mediatori genetici della tumorigenesi. Tuttavia, ad oggi, gli approcci metodologici per valutare la funzione mitocondriale tumorale rimangono elusivi e richiedono competenze tecniche che limitano la fattibilità, diminuendo in definitiva il valore diagnostico e prognostico sia in ambito sperimentale che clinico. Qui, delineiamo un metodo semplice e rapido per quantificare i tassi di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e la capacità di trasferimento di elettroni (ET) negli omogeneizzati tumorali solidi appena asportati utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. Il protocollo può essere applicato in modo riproducibile tra specie e tipi di tumore, nonché adattato per valutare una diversità di percorsi ET mitocondriali. Usando questo protocollo, dimostriamo che i topi portatori di un cancro mammario B luminale presentano una respirazione difettosa legata alla nicotinamide adenina dinucleotide e si affidano al succinato per generare adenosina trifosfato tramite OXPHOS.

Gli studi iniziali hanno rivelato che i tumori EO771 erano scarsamente ossidativi e quindi richiedevano alte concentrazioni di omogeneizzati per un'adeguata valutazione del flusso di O2. Sono stati condotti esperimenti di ottimizzazione per determinare l'intervallo di concentrazione ottimale di omogeneizzati tissutali per lo studio. Gli omogeneizzati tumorali sono stati inizialmente preparati a 40 mg/ml e poi diluiti linearmente. Il flusso di O2 normalizzato alla massa tissutale era coerente tra le concentrazioni (Figure 1A-D). È stato osservato che 40 mg/mL hanno provocato un rapido esaurimento di ossigeno e non erano adatti alla sperimentazione (Figura 1A). Il consumo di ossigeno è rallentato sostanzialmente con 30 mg/mL e 20 mg/mL ma è comunque diminuito rapidamente in breve tempo in assenza di substrati o ADP (Figura 1B,C). La concentrazione di 10 mg/ml ha portato al tasso di consumo ottimale di ossigeno (Figura 1D) che supporterebbe un protocollo SUIT più lungo di 90 minuti.
Un protocollo SUIT è stato utilizzato per valutare OXPHOS ed ET legati a NADH e succinato, nonché l'attività CIV (Figura 2A). Piruvato e malato sono stati aggiunti all'omogeneizzato tissutale in assenza di ADP per guidare la perdita (L) attraverso il NADH. L'ADP saturante è stato quindi aggiunto per guidare l'OXPHOS (P) legato al NADH massimo, seguito dall'aggiunta di glutammato. Il citocromo c è stato quindi aggiunto per garantire l'integrità della membrana esterna; l'aumento del tasso respiratorio è stato inferiore al 20% in tutti i campioni (Figura 2B). Data la risposta molto bassa ai substrati legati al NADH, il rilascio di citocromo c è stato valutato anche in presenza di succinato e rotenone e ha osservato una stimolazione minima del citocromo c (Figura 2B). È interessante notare che l'OXPHOS legato al NADH era trascurabile nei tumori EO771 (Figura 2C). Il succinato è stato quindi aggiunto in presenza di piruvato, malato e glutammato per stimolare il flusso di elettroni attraverso la succinato deidrogenasi. FCCP è stato quindi titolato per guidare il flusso massimo di elettroni (E), il che ha rivelato che nei tumori EO771, la fosforilazione piuttosto che l'ossidazione era limitante alla respirazione (Figura 2C). Rotenone e antimicina A sono stati successivamente titolati per inibire rispettivamente il complesso I e il complesso III. Ascorbato e TMPD sono stati quindi aggiunti per guidare il flusso massimo di elettroni attraverso CIV, che viene poi inibito dall'azide di sodio. La Tabella 1 illustra le equazioni analitiche di riduzione dei dati grezzi (Tabella 2) per quantificare i parametri respiratori tracciati nella Figura 2C. Nel complesso, i profili respiratori omogeneizzati tumorali (Figura 2C) sono simili a quelli delle cellule EO771 non impiantate permeabilizzate alla digitonina (Figura 2D) ad eccezione del diminuito trasferimento massimo di elettroni supportato da substrati legati a N e S nel tumore.
Poiché la respirazione legata al NADH era trascurabile, la cinetica respiratoria del succinato è stata ulteriormente valutata mediante titolazioni graduali di ADP sub-saturazione fino a raggiungere la velocità massima (VMAX)(Figura 3A,3B). La concentrazione semi-massimale (KM) di ADP in presenza di succinato + rotenone era di 37,5 μM, mentre il VMAX era di ~10,5 pmol/s/mg (Figura 3C). Pertanto, nonostante i tassi di ossidazione relativamente scarsi, i tumori EO771 erano altamente sensibili all'ADP e sostenevano la sintesi di ATP a concentrazioni di ADP relativamente basse.
La selezione di regioni appropriate dei dati grezzi per l'estrazione è fondamentale per la riproducibilità degli esperimenti e la quantificazione accurata. Per il citocromo c, è necessario selezionare un segno allo stato stazionario immediatamente prima dell'iniezione (Figura 4A, segno 1). C'è spesso un artefatto di iniezione iniziale che può essere seguito da un periodo di tempo (circa 5-10 minuti) in cui il flusso di O2 non è costante. La valutazione dell'efficienza del citocromo c viene effettuata effettuando una selezione aggiuntiva una volta che il flusso di O2 si è stabilizzato (Figura 4A, segno 2). Le selezioni dopo l'aggiunta di substrati, ADP o la maggior parte degli inibitori vengono effettuate anche dopo l'artefatto di iniezione e una volta che il flusso di O2 si è stabilizzato (Figura 4B). La selezione utilizzata per determinare la respirazione massima disaccoppiata viene effettuata al picco di aumento ottenuto durante la titolazione di FCCP, che spesso non è l'ultima iniezione effettuata (Figura 4C). La selezione per TMPD viene effettuata dopo l'aggiunta di ascorbato e TMPD e al picco di aumento della respirazione (Figura 4D, segno 1). Subito dopo questo picco, viene aggiunto l'inibitore, l'azide di sodio, che diminuisce rapidamente la respirazione ma spesso ha anche un artefatto di iniezione inferiore alla frequenza respiratoria inibita (Figura 4D). Il segno inibitore viene effettuato immediatamente dopo l'artefatto di iniezione (Figura 4D, segno 2). Il flusso di O2 in genere non si stabilizza e continua a diminuire.
Tabella 1: Notazione respiratoria e derivazione analitica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Campione e caratteristiche respiratorie degli omogeneizzati del tumore mammario luminale B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Figura 1: Ottimizzazione della concentrazione di omogeneizzati tumorali. Concentrazione di O2 Flux (rosso) e O2 (blu) negli omogeneizzati tumorali mammari preparati a (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL e (D) 10 mg/mL. Thom: Respirazione omogeneizzata tissutale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Figura 2: Valutazione della capacità di OXPHOS ed ET mediante respirometria ad alta risoluzione in omogeneizzati tumorali appena asportati. (A) Grafico rappresentativo del consumo di ossigeno (rosso) e delle concentrazioni (blu) nel corso di un substrato, inibitore, protocollo di disaccoppiamento. PM: Piruvato + Malato, D: ADP, G: Glutammato, c: Citocromo c, S: Succinato, F: FCCP, Marciume: Rotenone, Ama: Antimicina A, Asc / TMPD: Ascorbato / Tetrametil-p-fenilendiammina. (B) Aumento percentuale del flusso di O2 con l'aggiunta del citocromo c. (C-D) Respirazione supportata da malato, piruvato, glutammato e succinato in presenza di ADP, FCCP e ascorbato/TMPD in (C) Omogenati tumorali derivati da EO771 e (D) cellule non impiantate EO771 permeabilizzate alla digitonina. Thom: Respirazione omogeneizzata tissutale; PM: Piruvato + Malato; PMG: Piruvato + Malato + Glutammato; PMGS: Piruvato + Malato + Glutammato + Succinato; CIV: Complesso IV; -L: Stato di perdita; -P: Stato di fosforilazione ossidativa, -E: Stato di trasferimento di elettroni; N-linked: flusso O2 supportato da combinazioni di substrato che generano NADH definite; NS-linked: flusso di O2 supportato dalla convergenza di combinazioni di substrato generate da NADH e succinato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Figura 3: I tumori mammari EO771 hanno mostrato un'elevata sensibilità all'ADP (adenosina 5′-difosfato). (A) Rappresentazione rappresentativa del consumo di ossigeno (rosso) e delle concentrazioni (blu) in un protocollo di titolazione ADP legato all'S. Thom: Respirazione omogeneizzata tissutale; S/Rot: Succinato/Rotenone; D: ADP. (B) Respirazione supportata da succinato in presenza di rotenone e concentrazioni crescenti di ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Tasso massimale (VMAX) e concentrazione semi-massimale (KM) di ADP in presenza di succinato + rotenone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Figura 4: Traccia rappresentativa che illustra laselezione del segno dei flussi grezzi di O2 per l'estrazione dei dati. (A) Selezione del citocromo c: selezione numero 1 prima dell'iniezione del citocromo c e selezione numero 2 dopo l'iniezione quando il flusso di O2 si è stabilizzato. c Citocromo c. (B) Selezione del substrato, dell'ADP e degli inibitori: selezione numero 1 dopo l'iniezione (succinato in questo grafico rappresentativo) in cui il flusso di O2 si è stabilizzato. S: Succinate. (C) Selezione del disaccoppiatore: selezione numero 1 al picco di aumento della respirazione durante la titolazione del disaccoppiatore. In questo grafico di titolazione FCCP rappresentativo, la terza iniezione diminuisce leggermente la respirazione e quindi non viene utilizzata per la selezione. F: ACCP. (D) Selezione TMPD: selezione numero 1 al picco di aumento della respirazione dopo le iniezioni di ascorbato e TMPD. Selezione dell'azide di sodio: selezione numero 2 dopo l'artefatto di iniezione acuta quando la respirazione inizialmente diminuisce. As/Tm: Ascorbato/TMPD; Azd: Azide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Abbiamo sviluppato un protocollo pratico e un approccio analitico per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale e la capacità di trasferimento di elettroni negli omogeneizzati tumorali freschi. Questo protocollo può essere facilmente adattato per esaminare varie funzioni mitocondriali che contribuiscono all'inizio, alla progressione e alla risposta al trattamento del cancro.

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Questo protocollo descrive un metodo semplice e rapido per misurare la funzione mitocondriale del tumore. Il protocollo è ampiamente applicabile all'oncologia clinica traslazionale e contribuirà a migliorare l'interpretazione diagnostica e meccanicistica del ruolo dei mitocondri nell'insorgenza e nella progressione del cancro. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'applicazione dell'omogeneizzazione tissutale per semplificare la preparazione e massimizzare la resa dei mitocondri mitigando i limiti di diffusione.Questa tecnica offre potenziali applicazioni in contesti clinici e diagnostici con una valutazione quantitativa della funzione mitocondriale tumorale utilizzando tessuto tumorale appena sottoposto a biopsia o asportato. Inizia posizionando un omogeneizzatore di vetro contenente un millilitro di mezzo respiratorio mitocondriale, o MiR05, in un pestello di vetro aderente su ghiaccio bagnato. Posizionare il tessuto in un millilitro di soluzione di conservazione della biopsia, o BIOPS, in una capsula di Petri ghiacciata.Tagliare il tumore in piccoli pezzi di circa 5-10 milligrammi ciascuno e rimettere i restanti pezzi di tumore in 10 millilitri di BIOPS tenuti sul ghiaccio. Dopo aver tamponato accuratamente le sezioni di tessuto su una carta da filtro, posizionarle su una piccola barca di plastica catramata e registrare il peso umido iniziale. Riposizionare i pezzi inutilizzati nel tubo conico da 10 millilitri di BIOPS per una conservazione continua.Immergere le sezioni di tessuto in un omogeneizzatore ghiacciato contenente MiR05 e registrare il peso rimanente sulla barca di pesatura. Utilizzando un pestello di vetro con un intervallo di gioco da 0,09 a 0,16 millimetri, interrompere delicatamente il tessuto tumorale completando da cinque a sette colpi verso il basso e verso l'alto. Per ogni colpo, ruotare il pestello con un movimento in senso orario / antiorario tre volte mentre si spinge il pestello verso il basso e altre tre volte mentre si tira indietro il pestello.Lasciare che il tessuto si depositi sul fondo dell'omogeneizzatore tra un colpo e l'altro, ma evitare di portare il pestello completamente al di sopra del volume del fluido per evitare la formazione di schiuma. Versare l'omogeneizzato in un tubo conico da 15 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Pipettare da uno a tre millilitri di MiR05 fresco sopra il pestello e nell'omogeneizzatore per lavare l'omogeneizzatore di tessuto rimanente.Versare il lavaggio MiR05 nel tubo conico contenente l'omogeneizzato. Ripetere questo passaggio due o tre volte per garantire il trasferimento completo dell'omogeneizzato. Per calcolare con precisione la concentrazione di omogeneizzato tissutale, ispezionare attentamente l'omogeneizzatore e l'omogeneizzato per il materiale non omogeneizzato rimanente, che include il tessuto connettivo.Per rimuovere dall'omogeneizzatore il materiale non omogeneizzato che non può essere raggiunto con una pinzetta, dopo aver aggiunto MiR05 all'omogeneizzatore, aspirare il volume, compreso il tessuto, con una pipetta e spostare il contenuto in una capsula di Petri. Rimuovere l'omogeneizzato del materiale non omogeneizzato sistemato in pezzi di grandi dimensioni sul fondo del tubo conico aspirandoli con una pipetta e posizionarli sul cappuccio del tubo conico. Rimuovere il fazzoletto dalla capsula di Petri o dal cappuccio del tubo conico con una pinzetta e tamponarlo su carta da filtro.Aggiungere l'omogeneizzato rimanente dal cappuccio del tubo conico nel tubo conico. Tappare il tubo, quindi invertire per mescolare. Ispezionare nuovamente gli omogeneizzatori e l'omogeneizzatore per qualsiasi materiale aggiuntivo non omogeneizzato e ripetere i passaggi per rimuovere il materiale non omogeneizzato, se necessario.Pesare e registrare la massa del materiale non omogeneizzato recuperato dall'omogeneizzatore. Ispezionare la preparazione omogenea per qualsiasi tessuto grossolanamente intatto trasferito e rimuovere i pezzi non omogeneizzati e pesare se necessario. Sottrarre il peso del tessuto recuperato dalla barca di pesatura, dall'omogeneizzatore e dall'omogeneizzatore dal peso umido iniziale per calcolare il peso finale del campione.Utilizzando il peso finale del campione, aggiungere ulteriore MiR05 per portare l'omogeneizzato alla concentrazione desiderata. Una volta che l'omogeneizzato è stato pesato e preparato, procedere al test il prima possibile. Conservare il campione conservato su ghiaccio bagnato fino a quando non viene trasferito allo strumento.Una volta calibrato lo strumento e preparato il campione, rimuovere i tappi con un movimento di torsione e aspirare il MiR05 dalle camere, evitando la membrana esposta all'interno della camera. Mescolare bene l'omogeneizzato e aggiungere 2,25 millilitri di omogeneizzato alla camera. Supponiamo che un omogeneizzato venga aggiunto a più camere, pipettare un millilitro dell'omogeneizzato alla volta in ogni camera mentre si mescola l'omogeneizzato per garantire un'equa distribuzione tissutale.Fare clic su F4 per assegnare un nome e un timestamp all'evento, quindi fare clic su OK. Riempire una siringa da 50 millilitri con ossigeno da un serbatoio di ossigeno con un regolatore e un tubo del gas usando un ago smussato da 18 calibri. Iniettare l'ossigeno direttamente nelle camere per iperossigenarle a circa 500 micromolari di ossigeno.Inserire liberamente i tappi e attendere che si chiudano fino a quando l'ossigeno raggiunge circa 480 micromolari. Con un movimento di torsione, chiudere lentamente la camera e lasciare che la respirazione si equilibri per circa 15-20 minuti. Riempire il capillare centrale del tappo con MiR05, se necessario.Utilizzare microsiringhe dedicate per iniettare substrati, disaccoppiatori e inibitori in camere completamente chiuse per nominare e marcare il timestamp degli eventi per ciascuna camera in tempo reale. Selezionare F6 per regolare la concentrazione di ossigeno e le scale negative della pendenza dell'ossigeno in base alle esigenze. Dopo ogni iniezione, lavare la siringa tre volte in acqua per i composti solubili in acqua e il 70% di etanolo per i composti disciolti dall'etanolo.Aggiungere cinque microlitri di malato 0,8-molare e procedere immediatamente all'iniezione successiva. Lavare la siringa per iniezione tre volte in acqua. Aggiungere immediatamente cinque microlitri di piruvato 1-molare e attendere che la respirazione si stabilizzi.Dopo aver lavato la siringa, aggiungere 10 microlitri di ADP 0,5 molare e attendere che la risposta ADP si stabilizzi. Lavare la siringa e aggiungere cinque microlitri di glutammato 2-molare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Lavare la siringa, quindi aggiungere cinque microlitri di citocromo C 4 millimolare e attendere che la respirazione si stabilizzi.Dopo aver lavato la siringa, aggiungere 20 microlitri di succinato 1-molare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Titolare incrementi da 0,5 a 1 microlitro di FCCP da 1 millimolare e attendere che la respirazione si stabilizzi dopo ogni iniezione. Continuare fino a quando non vi è alcun ulteriore aumento della respirazione.Lavare la siringa per iniezione tre volte con etanolo al 70%. Aggiungere due microlitri di rotenone 150-micromolare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Aggiungere un altro microlitro di rotenone per assicurarsi che non vi sia ulteriore inibizione.Se c'è una diminuzione della respirazione, continuare con ulteriori iniezioni fino a quando non vi è alcuna diminuzione della respirazione, quindi lavare la siringa per iniezione tre volte con etanolo al 70%. Aggiungere due microlitri di antimicina A 125 micromolare e attendere che la respirazione si stabilizzi. Aggiungere un altro microlitro di antimicina A per assicurarsi che non vi sia ulteriore inibizione.Se c'è una diminuzione della respirazione, continuare con ulteriori iniezioni fino a quando non vi è alcuna diminuzione della respirazione. Lavare la siringa tre volte con il 70% di etanolo. Controllare la concentrazione di ossigeno della camera.Se la concentrazione è inferiore a 125 micromolari, riossigenare all'aria ambiente o leggermente iperossigenato per garantire che l'ossigeno non limiti il flusso respiratorio. Aggiungere cinque microlitri di ascorbato 0,8 molare. Lavare la siringa tre volte con etanolo al 70%.Aggiungere immediatamente 10 microlitri di TMPD 0,2 molari e attendere un aumento della respirazione. Dopo aver lavato la siringa con etanolo, aggiungere immediatamente 25 microlitri di azide di sodio 4-molare quando il flusso respiratorio dell'ascorbato TMPD si stabilizza. Termina il facendo clic su File, Salva e disconnetti.È stato osservato che 40 milligrammi per millilitro di omogeneizzato tissutale hanno provocato un rapido esaurimento di ossigeno. Il consumo di ossigeno è rallentato sostanzialmente con 30 e 20 milligrammi per millilitro di omogeneizzato tissutale, ma è comunque diminuito rapidamente in breve tempo in assenza di substrati o ADP. La concentrazione di 10 milligrammi per millilitro di omogeneizzato tissutale ha determinato il tasso ottimale di consumo di ossigeno.Un protocollo SUIT è stato utilizzato per valutare la fosforilazione ossidativa legata al NADH e al succinato e il trasferimento di elettroni, nonché l'attività del complesso IV. Il rilascio di citocromo C è stato valutato in presenza di piruvato e malato, o succinato e rotenone, entrambi i quali hanno rivelato che il preparato di omogeneizzato non danneggiava i mitocondri. È stato anche scoperto che la fosforilazione ossidativa legata al NADH era trascurabile nei tumori EO771.La titolazione di FCCP per guidare il flusso massimo di elettroni ha rivelato che nei tumori EO771, la fosforilazione, piuttosto che l'ossidazione, era limitante alla respirazione. I profili respiratori omogeneizzati tumorali erano simili a quelli delle cellule EO771 non impiantate, permeabilizzate alla digitonina, ad eccezione del ridotto trasferimento massimo di elettroni supportato da substrati legati a N e S nel tumore. La cinetica respiratoria del succinato è stata ulteriormente valutata mediante titolazioni graduali di ADP subsaturo fino al raggiungimento della velocità massima.La concentrazione semi-massimale di ADP in presenza di succinato e rotenone era di 37,5 micromolari, mentre la velocità massima era di circa 10,5 picomoli al secondo, per milligrammo. Gli strumenti installati nella cura di routine, così come la gestione dei tessuti, sono di fondamentale importanza per il successo di questi esperimenti. Seguendo queste procedure, altri approcci specifici di massa o marcatore per la normalizzazione dei tassi possono essere applicati in base alla questione dell'interesse.Le misure comuni includono la quantificazione totale delle proteine e l'attività enzimatica della citrato sintasi, ma variano in base al sistema modello, al disegno statistico e alla domanda di ricerca.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

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Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

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Ricerca sul cancro

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Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

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