Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
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ペニントン生物医学研究センター比較生物学コアスタッフの動物ケアに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金U54GM104940(JPK)とKL2TR003097(LAG)によって部分的に支援されました。動物を含むすべての実験と手順は、ペニントン生物医学研究センター制度動物の世話と使用委員会によって承認されました。

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著者らは、この研究に関連する利益相反はありません。

癌におけるミトコンドリア呼吸の評価方法は、主にインビトロモデル13、14、15、16に限定されてきた。化学透過率6、7、17を用いた腫瘍におけるミトコンドリア呼吸の測定に成功したが、腫瘍タイプ間で普遍的に適用され、比較できる均一な金標準アプローチはない。さらに、一貫したデータ分析とレポートの欠如は、データの一般化性と再現性が限られています。本明細書で概説される方法は、切除されたばかりの固形腫瘍検体からミトコンドリア製剤中のミトコンドリア呼吸18を測定するための簡単で比較的迅速なアプローチを提供する。腫瘍は、交体移植マウスLuminal B、ERα陰性EO771乳腺癌細胞19から増殖させた。
組織の取り扱いに精通し、注意することは酸素消費率の正確さおよび正常化を大きく改善する。サンプルが冷たく保たれていない場合、保存培地に一貫して沈んでいない場合、または過度に処理されていないと、組織およびミトコンドリアは容易に損傷を受ける可能性があり、最適以下のルーチンおよびOXPHOS率をもたらす。さらに、ホモジナイズ組織の正確な湿潤重量は、これが一次的な正規化方法であるため、極めて重要である。他の正規化方法は、クエン酸合成酵素活性20などの全タンパク質またはミトコンドリア特異的マーカーなどと考えられる。さらに、組織の不均一性に対処する必要があります, 事前に行われた実験に含める腫瘍領域に関する決定 で. 壊死、線維性、および結合組織は、均質化および/または十分に呼吸をし、これらの腫瘍領域を意図的にアッテ除かない限り避けるべきである。特に、腫瘍はタイプや切除領域によっては非常に粘着性があり、正確な計量と移動がより困難になる。均質化に使用されるストロークの数は、ミトコンドリア外膜への損傷を軽減しながら、ミトコンドリアの完全な調製を確保するために最適化する必要があります。
精度と再現性を向上させるには、ホモジュネート製剤、組織濃度、基質、アンカプラー、インヒビター濃度のストローク数に対して最適化実験を行うことを推奨します。研究は、異なる数の脳卒中と、それらが研究内のシトクロム c の添加に対する応答と、最大ミトコンドリア呼吸能力 21とどのように対応するかを比較することができる。チトクロム c 応答が少ない方が良いという一般的な受け入れがありますが、シトクロム c を添加した後の酸素消費量の増加は、外ミトコンドリア膜への損傷を示す可能性があるので、この閾値がすべての組織に対して何であるかについてはゴールドスタンダードはなく、組織が過労または準備不足にならないように実験的に調査する必要があります。この腫瘍組織では、~30%以下のシトクロム c 応答は呼吸機能を損なわないことがわかった。シトクロム c の使用は、検査が陽性であれば呼吸能力を正確に定量するために重要となる。この場合、添加は内因性シトクロムcを補充し 、 枯渇した場合、呼吸数の過小評価を引き起こす。
組織濃度滴定実験は、可能な濃度の範囲にわたって行われることができ、理想的には、研究中に調査されるSUITで行われるであろう。呼吸能力は腫瘍の種類と組成によって異なります。したがって、ミトコンドリアまたは高い呼吸能力を有する腫瘍は、より低い濃度(0.5〜5 mg/mL)を必要とする。少ないミトコンドリアまたは低呼吸能力を有する腫瘍は、より高い濃度(7-12 mg/mL)を必要とする。さらに、長い、または高度に消費された基質を有するSUITは、チャンバーまたはADP制限の再酸素化を防ぐために必要な組織が少ない場合があります。いくつかの組織は酸素消費において線形関係を持ち、他の組織は特定の濃度範囲で改善された感度と最大酸化を示す。選択した組織濃度は、再酸素化イベントの数を制限しながら、酸素フラックスを最大化するように最適化する必要があります。さらに、必要を過大評価するか、または濃度範囲の上限を目指す方が良い場合が多い。呼吸束の定量に不可欠な阻害剤は、ミトコンドリアのより大きなプールで使用するとより正確です。
もう一つの重要な考慮事項は、プロトコル中に使用される薬物の濃度です。ホモジネート濃度の変化は、最大応答に必要な基質、アンカプラー、および阻害剤の濃度を変化させる可能性があります。したがって、最適な濃度範囲が選択されたら、SUITプロトコルに必要な用量をテストする実験を行う必要があります。ADPを追加して、アデニル酸濃度が呼吸束に限定されないようにすることができます。FCCPやCCCPなどの化学アンカプラは、より高い濃度で呼吸を阻害します22.したがって、最大達成率を明らかにするために少量での活性化が不可欠です。ロテノーネや抗ミシンAなどの阻害剤は、最初の注射で飽和したときに最もよく使用されます。予備的な実験で最適な濃度が決定された一方で、阻害剤に対する反応の治療関連の違いも観察され、結果として得られた速度が定量化の基礎となるため、阻害剤の追加注入を1回追加することが多い。アスコルベート/TPMDの化学的阻害は、TMPDが自己酸化23を受けるので、正確な分析的還元に不可欠である。確立されたCIV阻害剤であるアジドナトリウムを添加し、アスコルビン酸/TMPD/シトクロム c の自動酸化を制御しました。Km研究の場合、コハク酸の存在下でロテノーネを単独で添加すると、低濃度24でコハク酸脱水素酵素活性を阻害できるオキサロアセテート蓄積を防止する。ADPの体積および濃度は、優勢な基質の組み合わせに対するミトコンドリアの感受性に大きく依存する。ADPに対して非常に敏感なミトコンドリア製剤は、より低い開始濃度を必要とする。さらに、pHに注意を払った検証済みの化学物質と適切な薬剤調製、該当する場合は光に対する感受性、および保存温度が実験を成功させるために不可欠です。
計測器のセットアップとルーチンケアは、これらの実験を成功させるために非常に重要です。チャンバーの適切かつ適切な洗浄は、生物学的、タンパク質、阻害剤、または非結合汚染の再現性と予防に不可欠です。クラーク型電極およびO2kシステムは消耗品に頼る版ベースのシステムに重大な費用の利点であるガラスの反応室を利用する。しかし、ガラス室は精力的に洗浄する必要があり、その後の研究で阻害剤汚染の原因となり得る。洗浄プロセス中にミトコンドリアが豊富な検体(例えば、単離された心臓または肝臓のミトコンドリア)とのインキュベーションは、実験的汚染のリスクを低減することができ、希釈およびアルコールベースの洗浄手順に加えて推奨されます。連続した研究が行われれば、エタノールおよびミトコンドリアによる洗浄は、インヒビター汚染の可能性を最小限に抑える。酸素センサのキャリブレーションは、酸素の一般的な分圧に対する呼吸の正確な測定値を得るために、各実験の前に推奨されます。複数のキャリブレーションが不可能な場合、洗浄手順の後に酸素濃度が安定し、一貫性を保つ場合は、1日1回のキャリブレーションで十分です。
上記で概説した手順は、以前に設計および最適化された保存溶液および呼吸媒体25、26、27を使用して腫瘍切除の4時間以内に腫瘍組織における酸素消費量を測定するためのOroboros O2k装置を活用する。このプロトコルの複数のパラメータは、後続のアプリケーションで変更できます。装置のセットアップとキャリブレーション、組織の準備に使用されるホモジナイザー、および最適なホモジネートおよびチャンバー酸素濃度はすべて、酸素モニタリングポテンシャルのある他の機器での使用に適合させることができます。例えば、ホモジネートを添加する際にチャンバーがわずかに過剰に充填され、したがってチャンバーが完全に閉じられると、チャンバー毛細管は満杯のままである。これはチャンバー内の酸素を消費しますが、サンプル濃度の最適化により、最初にどの酸素レベルを決定する際にこの消費を考慮することができます。あるいは、チャンバーが閉じられる前に周囲酸素で平衡化することが可能ですが、実験が始まる前に時間が長くなり、基板の添加が遅れることがよくあります。このプロトコルで使用されるホモジナイザーは広くアクセス可能であるが、ティッシュシュレッダーまたは自動化ホモジナイザー28のような他の商業的均質化技術を採用することができる。
さらに、組織調製および器具の手順は、結合および経路制御状態29の多様性による呼吸制御を研究するために、多数の異なるSUITと利用することができる。これらのSUITプロトコルは、機能容量を測定するために開発されており、したがって、潜在的な内在性基質の寄与は容量測定に影響を与え得ない。我々は、分析的に抗ミシンA-ロテノンの減算を通じてホモゲン酸の非ミトコンドリアの酸素消費量、または残留消費、またはアジドナトリウムの無感な率を考慮する。ミトコンドリアは、組織の種類と無傷性30、31に応じて、BIOPSまたは同様に長期間(>24時間)の構築された保存溶液で実行可能なままであり続けることができる。特定の基質のOXPHOSが異なる制限を有し得る時的な貯蔵限界を決定するために、研究を事前に行うことができる。これは、組織切除/生検の数時間以内に実験を行うことができない場合に不可欠です。37°Cは、ほとんどの哺乳類システムにおける呼吸機能の評価に最適で生理学的な温度です。しかし、アッセイ温度が評価32に干渉しているように見える場合、十分な応答性を確保するために広い温度範囲(25〜40°C)にわたって比較研究を行ってもよい。器械的な制約は、そのような研究を行う能力を制限するかもしれない。
上記の方法の主な制限は、1)機械的均質化によるミトコンドリアへの損傷の可能性、2)ATPまたは他の関心のある変数の同時決定を妨げる可能性があり、追加の補正方法または阻害剤使用を必要とし得るホモゲネート製剤におけるATPasesまたは他の細胞下生化学の存在である33、および3)1つの装置は一度に2つの実験に対応でき、連続する実験の間でクリーニングとセットアップが必要なため、サンプル当たりの多くのサンプルおよび/または複数のSUITの評価は時間がかかります。最適化実験とサンプルの一貫した調製により、一貫性のないデータに寄与するミトコンドリアの損傷を最小限に抑えることができます。
既存/代替方法に関する方法の重要性は、出発物質の量、ミトコンドリアの単離の課題、または透過組織における技術的課題と比較して、実現可能性が向上する。ホモジメートの調製は速く、酸素はほぼ制限されず、パーメビル化された組織と比較して人間の変動の影響を受けにくい。重要なことに、ほぼすべてのサンプルタイプは、組織間で比較分析を可能にするホモジネート調製に適しています。高分解能呼吸法は、ミトコンドリアOXPHOSおよびETの金標準測定である。前臨床および臨床癌研究におけるこの方法の適用は、現在 のインビトロ 研究を ex vivo 研究に拡大する能力を有する。さらに、臨床および診断の設定で潜在的な適用を提供する。

すべての細胞は、生成し、アデノシン三リン酸(ATP)、分子エネルギー通貨を消費する必要性によって密接にリンクされています。細胞変異が腫瘍の形成を生じるにつれて、ミトコンドリアは、非癌性組織1、2、3としばしば区別可能なエネルギー産生の多様化を通じて生存を保証する。したがって、腫瘍の種類、癌開始、進行、および治療応答の分類を容易にするために、ミトコンドリア呼吸機能の迅速かつ深いプロファイリングが重要な必要があります。
OXPHOSの一次基質は細胞透過性がないため、切除された組織標本の呼吸機能はそのまま評価できません。この制限を克服するために、ミトコンドリアは、単離、化学的透過、または機械的均質化のいずれかによって調製することができる。ミトコンドリアの単離は、長い間、呼吸機能の評価のためのゴールドスタンダードであると考えられています。しかし、それは大量の組織を必要とし、時間がかかり、かつミトコンドリア4の特定の画分に対して可能な選択バイアスと低収量である。透過性は、組織切片または繊維束を、細胞膜5を選択的に分解する中性洗剤に機械的に分離および曝露することからなる。透過は、個々の繊維束が離れてからかうことができるように、骨格や心筋などの縞組織で頻繁に採用されています。単離と比較して、パーメアビライゼーションは、母国の細胞環境および物理的形態5においてより多くのミトコンドリアをもたらす。透過性は腫瘍6、7、胎盤8などの他の組織にうまく適用されている。しかし、透過性繊維製剤の再現性は、拡散限界を克服するための解剖と酸素要件の一貫性のために困難であり得る9。さらに、透過性繊維は、細胞密度が高く、線維性の高い特定の腫瘍タイプでは不適当である可能性がある。組織ホモジメートは、原形質膜の機械的破壊によって生成され、ミトコンドリア収率および完全性10の点で透過繊維に類似している。組織均質化はまた、酸素拡散の限界を最小限にし、機械的力11、12の最適化を通じて組織タイプ全体にわたって容易に採用することができる。
ここでは、新たに摘出した固形腫瘍均質化物における酸化リン酸化(OXPHOS)および電子移動(ET)容量の定量化を簡単かつ迅速に行う方法を概説する。このプロトコルは、Oxygraph-2k(O2k)の高解像度レスピロメーターを使用して新鮮な組織を評価するように最適に設計されており、これはインストゥルメンタルのセットアップとキャリブレーションに関する予備知識を必要としますが、クラーク型電極、シーホースアナライザ、またはプレートリーダーを使用して同様に適応することができます。このプロトコルは、種および腫瘍タイプ間で再現的に適用できるだけでなく、ミトコンドリアET経路の多様性を評価するために適応することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

ミトコンドリアは、エネルギー産生、活性酸素種調節、高分子合成を通じたがんの発症と進行に不可欠です。ミトコンドリアの腫瘍環境への遺伝的および機能的適応は、増殖および転移性の可能性を促進する。DNAとRNAシーケンシングの出現は、腫瘍形成の遺伝メディエーターの評価に重大な障壁を取り除いた。しかし、これまで、腫瘍ミトコンドリア機能を評価するための方法論的アプローチは依然として不可解であり、実現可能性を制限する技術的能力を必要とし、最終的には実験および臨床の両方の設定で診断および予後値を減少させる。ここでは、高解像呼吸法を用いて、新たに摘出した固形腫瘍均質物における酸化リン酸化(OXPHOS)および電子移動(ET)容量の定量化を簡単かつ迅速に行う方法を概説する。このプロトコルは、種および腫瘍タイプ間で再現的に適用できるだけでなく、ミトコンドリアET経路の多様性を評価するために適応することができる。このプロトコルを用いて、発光B乳腺癌を有するマウスが、OXPHOSを介してアデノシン三リン酸を生成するためにコハク酸に対する欠陥ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド結合呼吸および依存を示すことを実証する。

最初の研究では、EO771腫瘍は低酸化的であり、したがって、適切なO2フラックス評価のために高いホモジネート濃度を必要とすることが明らかになった。最適化実験は、研究に最適な組織ホモジネート濃度範囲を決定するために実施した。腫瘍ホモジナイートは、最初は40mg/mLで調製し、次いで直線的に希釈した。組織質量に正規化されたO2フラックスは、濃度間で一貫していた(図1A-D)。40 mg/mL の結果、酸素が急激に枯渇し、実験には適していないことが観察されました (図 1A)。酸素消費量は30mg/mLおよび20mg/mLで大幅に減速したが、基質またはADPの不在の場合でも短時間で急速に減少した(図1B、C)。10 mg/mL濃度は、より長い90 minのSUITプロトコルをサポートする最適な酸素消費率(図1D)をもたらしました。
NADH およびコハネートリンク OXPHOS および ET、および CIV 活性を評価するために SUIT プロトコルが使用されました (図 2A)。ピルビン酸およびマル酸塩は、NADHを介してリーク(L)を駆動するADPの不在中に組織ホモジネートに添加された。次に、飽和ADPを最大NADH結合OXPHOS(P)を駆動し、続いてグルタミン酸を添加した。その後、チトクロムcを添加して外膜の完全性を確保した。呼吸速度の増加は、すべてのサンプルで20%未満であった(図2B)。NADH結合基質に対する反応が非常に低い場合、シトクロムc放出はコハク酸およびロテノンの存在下でも評価され、最小限のシトクロムc刺激を観察した(図2B)。興味深いことに、NADH結合OXPHOSはEO771腫瘍では無視できる(図2C)。次いで、コハク酸をピルビン酸、リンゴ酸、グルタミン酸の存在下に加えて、コハク酸デヒドロゲナーゼを通る電子流を刺激した。その後、FCCPを最大電子流量(E)を駆動するように滴定し、EO771腫瘍では酸化ではなくリン酸化が呼吸に限定されていたことが明らかになった(図2C)。ロテノーンとアンチマイシンAは、その後、それぞれ、複合体Iおよび複合体IIIを阻害するために滴定した。その後、アスコルビン酸とTMPDを加え、CIVを通る最大電子流を駆動し、アジドナトリウムによって阻害される。表1は、図2Cにプロットされた呼吸パラメータを定量化するための生データの分析還元式(表2)を示す。全体として、腫瘍ホモジネート呼吸プロファイル(図2C)は、腫瘍内のNおよびS結合基質で支持される減少した最大電子移動を除いて、非移植されたジジゴニン透過EO771細胞(図2D)のものと類似している。
NADH連動呼吸は無視できるものであったため、コハク酸塩の呼吸運動は、最大定格レート(VMAX)が達成されるまでADPの段階的滴定によってさらに評価された(図3A、3B)。コハク酸+ ロテノーンの存在下でのADPの半最大濃度(KM)は37.5μMであったのに対し、VMAXは〜10.5 pmol/s/mgであった(図3C)。したがって、比較的酸化率が低いにもかかわらず、EO771腫瘍はADPに対して非常に感受性が高く、比較的低いADP濃度でATP合成を持続した。
抽出のために生データの適切な領域を選択することは、実験の再現性と正確な定量化のために重要です。チトクロムcの場合、射出直前の定常状態でマークを選択する必要があります(図4A、マーク1)。O2フラックスが安定していない期間(約5〜10分)が続く初期注入アーティファクトがしばしば存在する。シトクロムc効率の評価は、O2フラックスが安定化したら追加の選択を行うことで行われる(図4A、マーク2)。基質、ADP、またはほとんどの阻害剤の添加後の選択も、注入アーティファクトの後、そしてO2フラックスが安定した後に行われる(図4B)。最大結合解除呼吸を決定するために使用される選択は、FCCPの滴定中に達成されるピーク増加時に行われますが、これはしばしば最後に行われた注射ではありません(図4C)。TMPDの選択は、アスコルビンとTMPDの両方が追加された後、呼吸のピーク増加時に行われます(図4D、マーク1)。このピークの直後に、阻害剤であるアジ化ナトリウムが添加され、呼吸が急速に減少するが、阻害された呼吸速度よりも低い注射アーティファクトを有することも多い(図4D)。インヒビターマークは、射出アーティファクトの直後に作られる(図4D、マーク2)。O2フラックスは通常安定せず、減少し続けます。
表1: 呼吸法と分析的導出. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2: 発光B乳腺腫瘍均質のサンプルおよび呼吸特性<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> 図1: 腫瘍ホモジネート濃度の最適化O2フラックス(赤)およびO2濃度(青)で調製した乳腺腫瘍ホモジナート(A)40 mg/mL、(B)30 mg/mL、(C)20 mg/mL、および(D)10mg/mLで調製した。トム:組織ホモジネート呼吸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> 図2:新たに摘出された腫瘍均質化物における高解像呼吸法によるOXPHOSおよびET容量の評価。(A)基質、阻害剤、アンカプラープロトコルの過程における酸素消費量(赤)および濃度(青)の代表的プロット。PM: ピルビン酸 + マレート, D: ADP, G: グルタミン酸, c: シトクロムc,S: コハク酸塩, F: FCCP, 腐敗: ロテノン, アマ: アンチマイシン A, Asc/TMPD: アスコルベート/テトラメチル p フェニレンジアミン.(B) シトクロムcを添加した場合のO2フラックスの増加率(C-D)ADP、FCCP、およびアスコルビン酸/TMPDの存在下でのマレート、ピルビン酸、グルタミン酸、およびコハク酸塩(C)EO771由来腫瘍ホモゲン酸塩および(D)非移植EO771デジコニン透過細胞で支えられる呼吸。トム:組織ホモジネート呼吸;PM: ピルビン酸 + マラト;PMG: ピルビン酸 + マレート + グルタミン酸;PMGS: ピルビン酸 + マレート + グルタミン酸 + コハク酸塩;CIV: コンプレックス IV;-L: リーク状態;-P:酸化リン酸化状態、-E:電子伝達状態N-リンク:定義されたNADH生成基板の組み合わせによってサポートされるO2フラックス。NS-リンク:定義されたNADH生成基質の組合せとコハク酸塩の収束によって支持されるO2フラックス。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> 図3:EO771乳腺腫瘍は高いADP(アデノシン5′−二リン酸)感受性を示した。(A)S連動ADP滴定プロトコル全体における酸素消費量(赤)と濃度(青)の代表的なプロット。トム:組織ホモジネート呼吸;S/腐敗:コハク酸塩/ロテノーネ;D: ADP.(B) ロテノーンの存在下でのコハク酸によって支えられ、ADPの濃度を増加させる (0 μM ADP = S/Rot-L).(C) コハク酸塩 + ロテノーンの存在下での ADP の最大濃度 (VMAX)と半分の濃度 (KM)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> 図4:データ抽出のための生O2フラックスのマーク選択を示す代表的なトレースは、(A)チトクロムc選択:O2フラックスが安定化した場合の射出後にシトクロムc注入前の選択番号1および選択番号2。c シトクロームc.(B)基質、ADP、および阻害剤選択:O2フラックスが安定化した射出後の選択数1(この代表的プロットではコハク酸塩)。S:コハク酸塩。(C)アンカプラー選択:アンカプラー滴定時の呼吸のピーク増加時の選択数1。この代表的なFCCP滴定プロットでは、3回目の注入は呼吸をわずかに減少させ、したがって選択には使用されない。F: ACCP.(D)TMPD選択:アスコルビンスおよびTMPD注射後の呼吸のピーク増加時の選択数1。アジ化ナトリウム選択:呼吸が最初に減少したときの急性注入アーティファクトの後の選択数2。As/Tm: アスコルベート/TMPD;アズド:アジデ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

新鮮な腫瘍ホモジナートにおけるミトコンドリア酸化リン酸化と電子移動能を評価する実用的なプロトコルと分析手法を開発しました。このプロトコルは、がんの開始、進行、および治療応答に寄与する様々なミトコンドリア機能を調査するために容易に適応することができる。

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

このプロトコルは、腫瘍ミトコンドリア機能を測定するための簡単かつ迅速な方法を記述する。このプロトコルは、臨床翻訳腫瘍学に広く適用され、癌の発症および進行におけるミトコンドリアの役割の診断および機械学的解釈を強化するのに役立ちます。この技術の主な利点は、組織均質化の適用が調製を簡素化し、拡散の限界を緩和しながらミトコンドリアの収量を最大化することです。この技術は、新たに生検または切除された腫瘍組織を用いた腫瘍ミトコンドリア機能の定量的評価を伴う臨床および診断設定における潜在的な応用を提供する。まず、ミトコンドリア呼吸媒体(MiR05)を1ミリリットル含むガラスホモジナイザーを、湿った氷の上にしっかりとフィットしたガラス害虫に入れることから始めます。組織を1ミリリットルの生検保存溶液(BIOPS)に氷冷ペトリ皿に入れます。腫瘍をそれぞれ約5〜10ミリグラムの小片に切り、残りの腫瘍片を氷の上に保たれたBIOPSの10ミリリットルに戻します。濾紙に慎重に組織切片を吸い込んだ後、小さなプラスチックタール計量ボートに置き、最初の湿式重量を記録します。未使用の部分をBIOPSの10ミリリットルの円錐管に戻し、継続的な保存を行います。MiR05を含む氷冷ホモジナイザーに組織切片を水没させ、重量ボートに残りの重量を記録します。0.09〜0.16ミリメートルのクリアランス範囲を有するガラス害虫を使用して、5〜7回のダウンおよびアップストロークを完了することによって腫瘍組織を穏やかに破壊する。各ストロークについて、害虫を下に押しながら時計回り/反時計回りに3回回転させ、害虫を引き上げながらさらに3回回転させます。組織がストロークの間にホモジナイザーの底に落ち着くようにしますが、泡立ちを防ぐために流体ボリュームの上に害虫を完全に持ち込むことは避けてください。ホモジュネートを15ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、氷の上に置きます。ピペットは、新鮮なMiR05を1〜3ミリリットルの新鮮なMiR05を害虫の上に、ホモジナイザーに入れ、残りの組織ホモゲネートを洗浄する。ホモジネートを含む円錐管にMiR05洗浄を注ぎます。このステップを2~3回繰り返して、ホモジネートの完全な移動を確実に行います。組織ホモジネート濃度を正確に計算するには、ホモジナイザーとホモゲネートを注意深く検査し、結合組織を含む非ホモジナイズ材料を残します。ピンセットで到達できないホモジナイザーから非ホモジナイザー材料を除去し、ホモジナイザーにMiR05を添加した後、組織を含む体積をピペットで吸引し、内容物をペトリ皿に移動させる。ホモゲン酸からホモジネートから円錐管の底に大きく落ち着いた非ホモジナイズ材料を取り除き、円錐管のキャップの上に置きます。ペトリ皿または円錐形のチューブキャップからピンセットで組織を取り出し、ろ過用紙にブロットします。残りのホモジネートを円錐形のチューブキャップから円錐形チューブに追加します。チューブをキャップし、反転して混ぜます。ホモジナイザーを再検査し、任意の追加の非ホモジナイズ材料をホモゲネートし、必要に応じて非ホモジナイズ材料を除去する手順を繰り返します。ホモジナイザーから回収した非ホモジナイズ材料の質量を計量して記録する。移された任意のひどく無傷の組織のためのホモゲネート調製物を検査し、非ホモジナイズされた部分を取り除き、必要に応じて重量を量る。重量のボート、ホモジナイザー、およびホモゲネートから回収した組織重量を最初の湿潤重量から引いて、最終的なサンプル重量を計算する。最終的なサンプル重量を使用して、さらにMiR05を加えて、所望の濃度にホモゲネートを持ち込みます。ホモジネートを計量して調製したら、できるだけ早くアッセイに進みます。サンプルは、器具に移されるまで湿った氷の上に保管してください。機器が較正され、サンプルが準備されたら、ねじれた動きでストッパーを取り外し、チャンバーからMiR05を吸引し、チャンバー内に露出した膜を避けます。ホモゲネートをよく混ぜ、ホモゲネートの2.25ミリリットルをチャンバに加えます。1つのホモジネートが複数のチャンバに加えられ、ホモゲネートのピペットが均一な組織分布を確保するためにホモゲネートを混合しながら各チャンバに一度に1ミリリットルを加えられていると仮定する。F4 をクリックしてイベントの名前とタイムスタンプを指定し、[問題] をクリックします。鈍い18ゲージの針を使用して、酸素タンクからの酸素で50ミリリットルの注射器をレギュレータとガスチューブで満たします。酸素をチャンバーに直接注入し、約500マイクロモル酸素に過酸素化します。緩くストッパーを挿入し、酸素が約480マイクロモルに達するまで閉じるのを待ちます。ねじれ運動で、チャンバーをゆっくりと閉じ、呼吸を約15〜20分間平衡させます。必要に応じて、ストッパーの中央キャピラリーをMiR05で充填します。専用のマイクロシリンジを使用して、基質、アンカプラー、および阻害剤を完全に閉じたチャンバーに注入し、各チャンバのイベントにリアルタイムで名前を付けてタイムスタンプを付けます。F6 を選択して、酸素濃度と酸素勾配負のスケールを必要に応じて調整します。各注射後、水溶性化合物のシリンジを水で3回洗浄し、エタノール溶解化合物の場合は70%エタノールを洗浄します。0.8モルのマルレートの5マイクロリットルを追加し、すぐに次の注入に進みます。注射注射器を水で3回洗います。すぐに5マイクロリットルの1モルピルビン酸を加え、呼吸が安定するのを待ちます。注射器を洗浄した後、0.5モルADPの10マイクロリットルを加え、ADP応答が安定するのを待ちます。注射器を洗い、2モルグルタミン酸の5マイクロリットルを加え、呼吸が安定するのを待ちます。注射器を洗い、4ミリモルシトクロム-Cの5マイクロリットルを加え、呼吸が安定するのを待ちます。注射器を洗浄した後、20マイクロリットルの1モルコハク酸を加え、呼吸が安定するのを待ちます。滴定は、1 ミリモルの FCCP の 0.5 ~1 マイクロリットル単位で、各注入後に呼吸が安定するまで待ちます。呼吸の増加がなくなるまで続けます。注射注射器を70%エタノールで3回洗浄します。150マイクロモルロテロンの2マイクロリットルを追加し、呼吸が安定するのを待ちます。さらなる阻害がないことを確認するために、ロテノンの別の1マイクロリットルを追加します。呼吸の減少がある場合は、呼吸の減少がなくなるまで追加の注射を続け、その後、70%エタノールで注射注射器を3回洗浄します。125マイクロモルアンチマイシンAの2マイクロリットルを加え、呼吸が安定するのを待ちます。さらに阻害されないように、もう1マイクロリットルのアンチマイシンAを加える。呼吸の減少がある場合は、呼吸の減少がなくなるまで追加の注射を続けます。70%エタノールで注射器を3回洗います。チャンバーの酸素濃度を確認してください。濃度が125マイクロモルを下回る場合は、室内の空気に再酸素化するか、酸素が呼吸束を制限しないことを確実にするために軽度の過酸素性を有する。0.8モルアスコルビンスの5マイクロリットルを追加します。70%エタノールで3回注射器を洗浄します。0.2モルTMPDの10マイクロリットルをすぐに加え、呼吸の増加を待ちます。注射器をエタノールで洗浄した後、アスコルビン酸TMPDプラトウスの呼吸束が速いときに、直ちに25マイクロリットルの4モルナトリウムアジドを加える。ファイル、保存、切断をクリックして終了します。ホモジネートの組織のミリリットル当たり40ミリグラムが急速な酸素枯渇をもたらしたことが観察された。酸素消費量は、組織ホモジネートのミリリットル当たり30ミリグラムと20ミリグラムで大幅に減速したが、基質またはADPが存在しない場合でも短時間で急速に減少した。組織ホモジネートのミリリットル濃度あたり10ミリグラムは、最適な酸素消費率をもたらした。SUITプロトコルは、NADHとコハク酸結合酸化リン酸化および電子移動、ならびに複合体IV活性を評価するために使用された。シトクロムC放出は、ピルビン酸およびマレート、またはコハク酸塩およびロテノーンの存在下で評価され、両者はホモゲネート調製物がミトコンドリアに損傷を与えなかったことを明らかにした。また、EO771腫瘍ではNADH結合酸化リン酸化がごくわずかであることがわかった。FCCPが最大電子流を駆動する滴定は、EO771腫瘍において、酸化ではなくリン酸化が呼吸に限定されていることを明らかにした。腫瘍ホモジネート呼吸プロファイルは、腫瘍内のNおよびS結合基質によって支持される減少した最大電子伝達を除いて、非移植されたジジコニン透過性EO771細胞のものと類似していた。コハク酸塩の呼吸運動は、最大速度が達成されるまでADPをサブサレーションする段階的な滴定によってさらに評価した。コハク酸とロテノーンの存在下でのADPの半最大濃度は37.5マイクロモルであったのに対し、最大速度は1ミリグラム当たり約10.5ピコモール/秒であった。ルーチンケアで設置された機器や組織の取り扱いは、これらの実験の成功にとって非常に重要です。これらの手順に従って、レート正規化に対する他の質量またはマーカー固有のアプローチを、関心のある質問に基づいて適用できます。一般的な対策としては、クエン酸合成酵素の総タンパク質定量と酵素活性が含まれますが、モデルシステム、統計設計、研究問題によって異なります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

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Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

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Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

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Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

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The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

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Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

固形腫瘍細胞株における側集団の解析

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A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

マイトカン細胞毒性の正確な決定のための自動差動核染色アッセイ

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

固形腫瘍移植による骨原発性骨腫瘍と骨転移のモデリング

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...