Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
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우리는 동물 치료를위한 페닝턴 생물 의학 연구 센터 비교 생물학 핵심 직원에게 감사드립니다. 이 연구는 건강의 국가 학회보조금 U54GM104940 (JPK) 및 KL2TR003097 (LAG)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 동물과 관련된 모든 실험과 절차는 페닝턴 생물 의학 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.

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저자는이 작품과 관련된 이해 상충이 없습니다.

암에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는접근법은 주로 시험관 내 모델(13,14,15,16)으로제한되었다. 화학적 투과성6,7,17을사용하여 종양에서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 있어 일부 성공이 달성되었지만, 보편적으로 적용되고 종양 유형 전반에 걸쳐 비교할 수 있는 균일한 금표준 접근법은 없습니다. 또한 일관된 데이터 분석 및 보고가 부족하여 데이터 일반화성과 재현성이 제한됩니다. 본 원에 설명된 방법은 미토콘드리아호흡(18)을 측정하기 위한 간단하고 비교적 빠른 접근법을 제공하여 미토콘드리아 제제에서 갓 절제된 고형 종양 시편으로부터 제조한다. 종양은 정형소 이식된 뮤린 루미날 B, ERα-음성 EO771유방암세포(19)로부터성장하였다.
조직 취급에 대한 부지런함과 관리는 산소 소비율의 정확성과 정상화를 크게 향상시킬 것입니다. 조직과 미토콘드리아는 시료가 차갑게 유지되지 않거나, 보존 매체에 일관되게 침수되지 않거나, 지나치게 처리되어 최적이 아닌 루틴 및 OXPHOS 비율을 초래하는 경우 쉽게 손상될 수 있다. 추가적으로, 균질화 조직의 정확한 젖은 무게는 이것이 1 차적인 정규화 방법이기 때문에 중요한 중요성입니다. 구연산 신디하제활성(20)과같은 총 단백질 또는 미토콘드리아 특이적 마커와 같은 다른 정상화 방법이 고려될 수 있다. 추가적으로, 조직 이질성은 실험에 포함하기 위하여 종양 지구에 관하여 결정과 더불어 해결될 필요가 있을 것입니다 선행을 했습니다. 괴사, 섬유성 및 결합 조직은 균질화 및/또는 호흡을 잘 하지 않을 수 있으며 이러한 종양 부위를 의도적으로 분석하지 않는 한 피해야 합니다. 특히, 종양은 유형 및 절제 부위에 따라 매우 끈적거리며 정확한 계량 및 이송이 더 어려워질 수 있습니다. 균질화에 사용되는 뇌졸중의 수는 외부 미토콘드리아 막에 손상을 완화하면서 미토콘드리아의 완전한 준비를 보장하기 위해 최적화되어야한다.
향상된 정확도와 재현성을 위해, 우리는 균질 제제, 조직 농도 및 기질, 비 커플러, 억제제 농도에 대한 뇌졸중의 수에 대한 최적화 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 연구는 뇌졸중의 다른 수와 그들이 연구 내에서 사이토 크롬 c의 첨가에 반응하는 방법과 최대 미토콘드리아 호흡 용량 (21)을비교할 수 있습니다. 시토크롬 c 응답이 적다는 일반적인 수용이 있지만, 사이토크롬 c를 첨가한 후 산소 소비가 증가함에 따라 외부 미토콘드리아 막에 손상을 나타낼 수 있으며, 이 임계값이 모든 조직에 대해 어떤 기준인지에 관해서는 금본위제가 없으며 조직이 과로되거나 준비되지 않도록 실험적으로 조사되어야 한다. 이 종양 조직에서는~ 30% 미만의 사이토크롬 c 반응이 호흡기 기능을 손상시키지 않는 것으로 나타났다. Cytochrome c 사용은 시험이 양성인 경우에 호흡 용량의 정확한 정량화를 위해 중요하게 됩니다. 이 경우, 추가 보충 내인성 사이토크롬 c, 이는, 고갈하는 경우, 호흡 속도의 과소 평가를 일으킬 것이다.
조직 농도 적정 실험은 가능한 농도의 범위에 걸쳐 수행 될 수 있으며, 이상적으로, 연구 중에 조사 될 SUITs로 수행 될 것이다. 호흡 용량은 종양 유형 및 조성물에 따라 다릅니다. 따라서, 미토콘드리아 또는 높은 호흡 용량으로 조밀한 종양은 낮은 농도(0.5-5 mg/mL)를 필요로 한다. 미토콘드리아 또는 낮은 호흡 용량을 가진 종양은 더 높은 농도 (7-12 mg/mL)를 요구할 것입니다. 추가적으로, 길고 고도로 소모된 기질이 있는 SUITs는 챔버 또는 ADP 제한의 재산소화를 방지하기 위하여 더 적은 조직을 필요로 할 수 있습니다. 몇몇 조직은 산소 소비에 있는 선형 관계가 있을 것이고, 그 외는 특정 사격량에 향상된 감도 및 최대 산화를 보여줄 것입니다. 선택한 조직 농도는 산소 플럭스를 최대화하는 동시에 재산소 화 사건의 수를 제한하도록 최적화되어야 합니다. 또한, 농도 범위의 높은 끝에 대 한 필요 또는 목표를 과대 평가 하는 것이 좋습니다. 호흡 플럭스의 양에 필수적인 억제제는 미토콘드리아의 더 큰 풀에서 사용될 때 더 정확합니다.
또 다른 필수적인 고려 사항은 프로토콜 중에 사용되는 약물의 농도입니다. 동종 포진 농도의 변화는 최대 반응에 필요한 기판, 분리제 및 억제제의 농도를 변경할 수 있습니다. 따라서 최적의 농도 범위를 선택하면 SUIT 프로토콜에 필요한 용량을 테스트하는 실험이 수행되어야 합니다. 아데닐레이트 농도가 호흡기 플럭스에 제한되지 않도록 추가ADP를 추가할 수 있습니다. FCCP 또는 CCCP와 같은 화학 비커플러는 더 높은농도(22)에서호흡을 억제한다. 따라서, 최대 달성 속도를 드러내기 위해 소량으로 적정화하는 것이 필수적입니다. 로테네톤 및 항마이신 A와 같은 억제제는 첫 번째 주사 내에서 포화 시 가장 잘 사용됩니다. 최적의 농도는 예비 실험에서 결정되었지만, 우리는 또한 억제제에 대한 반응에서 치료 관련 차이를 관찰하고 따라서 종종 결과 요금이 정량화의 기초로 작용함에 따라 최대 억제를 입증하기 위해 억제제의 1 개의 추가 주입을 추가합니다. TMPD가 자동산화(23)를거치면서 아스코르베이트/TPMD의 화학적 억제는 정확한 분석 적 감소에 필수적이다. 우리는 산화 나트륨 아지드의 추가를 통해 아스코르바테/TMPD/사이토크롬 c의 자동 산화를 위해 통제, 설립 된 CIV 억제제. Km 연구의 경우, 간결한 단독으로 로테네를 첨가하면저농도(24)에서간결한 탈수소효소 활성을 억제할 수 있는 옥살로아세테이트 축적을 방지한다. ADP의 부피 및 농도는 일반적인 기판 조합에 미토콘드리아의 감도에 크게 의존한다. ADP에 매우 민감한 미토콘드리아 제제는 더 낮은 시작 농도를 필요로 합니다. 또한 pH에 주의를 기울여 검증된 화학 물질및 적절한 약물 제제, 해당되는 경우 빛에 대한 민감성 및 저장 온도는 성공적인 실험에 필수적입니다.
악기 설정 및 일상적인 관리는 이러한 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 챔버의 적절하고 적절한 청소는 생물학적, 단백질, 억제제 또는 커플러 오염의 재현성 및 예방에 필수적입니다. 클라크형 전극 및 O2k 시스템은 소모품에 의존하는 플레이트 기반 시스템에 상당한 비용 이점인 유리 반응 챔버를 활용합니다. 그러나 유리 챔버는 적극적으로 세척되어야하며 후속 연구에서 억제제 오염의 원인이 될 수 있습니다. 세척 과정에서 미토콘드리아가 풍부한 표본을 가진 배양(예를 들어, 고립된 심장 또는 간 미토콘드리아)은 실험 오염의 위험을 줄일 수 있으며 희석 및 알코올 기반 세척 절차 이외에 권장됩니다. 연속 적인 연구가 실행 되는 경우, 에탄올과 미토 콘 드리 아와 청소 억제제 오염의 가능성을 최소화. 산소 센서의 교정은 산소의 일반적인 부분 압력에 비해 호흡의 정확한 측정을 얻기 위해 각 실험 전에 권장됩니다. 다중 교정이 가능하지 않은 경우, 세척 시술 후 산소 농도가 안정적이고 일관된 상태를 유지하면 하루에 하나의 교정이 충분할 수 있습니다.
상술한 절차는 이전에 설계및 최적화된 보존 용액 및 호흡 매체25,26,27을사용하여 종양 절제 후 4시간 이내에 종양 조직에서 산소 소비를 측정하기 위한 Oroboros O2k 계측기를 활용한다. 이 프로토콜의 여러 매개 변수는 후속 응용 프로그램에 대해 수정할 수 있습니다. 기기 설정 및 교정, 조직 준비에 사용되는 균질화, 최적의 균질화 및 챔버 산소 농도는 모두 산소 모니터링 잠재력을 가진 다른 기기에 사용하기 위해 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 균주를 추가할 때 챔버가 약간 과밀되어 챔버가 완전히 닫히면 챔버 모세관이 가득 찼습니다. 이것은 챔버에 약간의 산소를 소비하지만, 샘플 농도의 최적화와 함께, 우리는 시작 산소 수준을 결정하는이 소비를 설명 할 수 있습니다. 대안적으로, 샘플은 챔버가 닫히기 전에 주변 산소에서 평형화할 수 있지만, 이것은 종종 실험이 시작되기 전에 시간의 양을 증가시키고 기판의 추가를 지연시킬 것이다. 이 프로토콜에 사용되는 균질화는 널리 접근 할 수 있지만, 조직 분쇄기 또는 자동화 된 균질화 기법과 같은 다른 상업적 균질화 기술을 사용할 수있습니다(28).
또한, 조직 제제 및 기기 절차는 다양한 SUIT와 함께 다양한 커플링 및 통로 제어상태(29)에의해 호흡기 조절을 연구할 수 있다. 이러한 SUIT 프로토콜은 기능 용량을 측정하기 위해 개발되었으며, 따라서 잠재적인 내인성 기판의 기여는 용량 측정에 영향을 미치지 않습니다. 당사는 항마이신 A-로테논 또는 아지드 나트륨 민감성의 감산을 통해 항미토콘드리아 산소 소비 및/또는 잔류 소비를 적절히 고려합니다. 미토콘드리아는 조직 유형 및 손상성30,31에따라 장기간(>24h)에 대해 생검 또는 유사하게 구성된 보존 용액에서 실행 가능한 상태를 유지할 수 있다. 특정 기판의 OXPHOS가 다른 한계를 가질 수 있기 때문에 시간적 저장 제한을 결정하기 위해 사전에 연구를 수행할 수 있습니다. 이것은 실험이 조직 절제/생검의 몇 시간 안에 수행될 수 없는 경우에 필수적입니다. 37°C는 대부분의 포유류 시스템에서 호흡 기능의 평가를 위한 최적 및 생리학적 온도이다. 그러나, 분석 온도가평가(32)를방해하는 것처럼 보이는 경우, 적절한 응답성을 보장하기 위해 넓은 온도 범위(25-40°C)에 걸쳐 비교 연구가 수행될 수 있다. 도구 적 제약은 그러한 연구를 수행하는 능력을 제한 할 수 있습니다.
전술한 방법의 주요 제한은 1) 기계적 균질화를 통한 미토콘드리아에 대한 손상 가능성, 2) ATP 또는 기타 관심 변수의 동시 결정을 방해할 수 있는 호모게네이트 제제에서 ATPases 또는 기타 세포형 생화학물질의 존재가 존재하며 추가 적인 교정 방법 또는 억제제 사용이 필요할 수 있다33 및 3) 샘플당 많은 샘플 및/또는 여러 SUIT의 평가는 한 번에 두 개의 실험을 수용할 수 있으며 연속적인 실험 사이에 정리및 설정이 필요하기 때문에 시간이 많이 소요됩니다. 최적화 실험과 일관된 샘플 준비는 일관성 없는 데이터에 기여하는 상당한 미토콘드리아 손상을 최소화할 수 있습니다.
기존/대체 방법에 대하여 방법의 중요성은 개시 물질의 양, 미토콘드리아 분리의 도전 또는 투과 조직에 있는 기술적인 도전의 양에 비해 향상된 타당성입니다. 균질화의 준비는 더 빠르며, 산소는 거의 제한되지 않으며, 투과 조직에 비해 인력 간의 가변성에 덜 취약합니다. 중요한 것은, 거의 모든 견본 모형은 조직에 걸쳐 비교 분석을 허용하는 호모전 준비에 적합합니다. 고해상도 호흡법은 미토콘드리아 OXPHOS 및 ET의 금 표준 측정입니다. 전임상 및 임상암 연구에서 이 방법의 적용은 생체 내 연구를 전생체 연구로 확대할 수 있는 능력을 가지고 있다. 또한 임상 및 진단 설정에서 잠재적인 응용 프로그램을 제공합니다.

모든 세포는 분자 에너지 통화인 아데노신 트리호스페이트(ATP)를 생산하고 섭취해야 할 필요성에 의해 밀접하게 연결됩니다. 세포 돌연변이가 종양의 형성을 초래함에 따라, 미토콘드리아는 비암조직1,2,3과일반적으로 구별되는 에너지 생산의 다양화를 통해 생존을 보장한다. 이와 같이, 종양 유형, 암 개시, 진행 및 치료 반응의 분류를 용이하게 하기 위해 미토콘드리아 호흡 기능의 신속하고 깊은 프로파일링을 위한 중요한 필요성이 있다.
OXPHOS에 대한 1차 기판은 세포 투과성이 없기 때문에 절제된 조직 표본의 호흡 기능은 그대로 평가될 수 없다. 이러한 한계를 극복하기 위해 미토콘드리아는 절연, 화학 적 투과성 또는 기계적 균질화에 의해 제조 될 수 있습니다. 미토콘드리아 절연은 호흡기 기능의 평가를 위한 금 본위제로 오랫동안 간주됩니다. 그러나, 그것은 조직의 다량을 필요로하고, 시간이 많이 소요되며, 미토콘드리아4의특정 분획에 대한 가능한 선택 편향으로 낮은 항복이다. 과미성화는 플라즈마 멤브레인5를선택적으로 저하시키는 온화한 세제에 대한 조직 섹션 또는 섬유 번들의 기계적 분리 및 노출로 구성된다. 개별 섬유 번들이 따로 놀릴 수 있기 때문에 투과는 골격 및 심장 근육과 같은 현저한 조직에서 자주 사용됩니다. 격리에 비해, 투과성 생성은 그들의 네이티브 세포 환경 및 물리적 양식 5에서 더 많은 미토콘드리아를산출합니다. 과미성비화는 종양6,7 및 태반8과같은 다른 조직에서 성공적으로 적용되었습니다. 그러나, 퍼미빌리화섬유 제제의 재현성은 해부 및 산소 요구 사항의 일관성으로 인해 확산한계를극복하기 위해 어려울 수 있다 9. 추가적으로, 과소 섬유는 조밀하게 세포및 높게 섬유성인 특정 종양 모형에서 부적당할 지도 모릅니다. 조직 균질화는 플라즈마 멤브레인의 기계적 중단을 통해 생성되며 미토콘드리아 수율 및무결성(10)의관점에서 과구 섬유와 유사하다. 조직 균질화는 또한 산소 확산의 한계를 최소화하고 기계적힘(11,12)의최적화를 통해 조직 유형 전반에 걸쳐 용이하게 사용될 수 있다.
여기서, 우리는 신선하게 절제된 고형 종양 균질화에서 산화 인산화(OXPHOS) 및 전자 전달(ET) 용량의 비율을 정량화하는 간단하고 신속한 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 기악 설정 및 교정에 대한 사전 지식이 필요하지만 클라크 형 전극, 해마 분석기 또는 플레이트 판독기를 사용하여 유사하게 조정할 수있는 Oxygraph-2k (O2k) 고해상도 호흡을 사용하여 신선한 조직을 평가하기 위해 최적으로 설계되었습니다. 프로토콜은 종 및 종양 모형에 걸쳐 재보적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 ET 통로의 다양성을 평가하기 위하여 적응될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

미토콘드리아는 에너지 생산, 반응성 산소 종 조절 및 거대 분자 합성을 통해 암의 발병 및 진행에 필수적입니다. 미토콘드리아의 유전적 및 기능적 적응은 종양 환경에 대한 확산 및 전이성 전위 잠재력을 유발합니다. DNA와 RNA 염기서열 분석의 출현은 종양 발생의 유전 중재자의 평가에 중요한 장벽을 제거했습니다. 그러나 현재까지 종양 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 방법론적 접근법은 여전히 애매하며 타당성을 제한하는 기술적 숙련도가 필요하며 궁극적으로 실험 및 임상 설정 모두에서 진단 및 예후 값을 감소시다. 여기서, 우리는 고해상도 호흡법을 사용하여 갓 절제된 고형 종양 균질화에서 산화 인산화(OXPHOS) 및 전자 전달(ET) 용량의 비율을 정량화하는 간단하고 신속한 방법을 간략하게 설명합니다. 프로토콜은 종 및 종양 모형에 걸쳐 재보적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 ET 통로의 다양성을 평가하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 발광 B 유방암을 가진 마우스가 OXPHOS를 통해 아데노신 삼위산염을 생성하기 위하여 간결한 에 결함이 있는 니코틴아마미드 adenine dinucleotide 연결호흡 및 의존을 전시한다는 것을 보여줍니다.

초기 연구 결과는 EO771 종양이 낮은 산화이고 이렇게 적당한 O2 플럭스 평가를 위한 높은 균질 농도를 요구했다는 것을 밝혔습니다. 최적화 실험은 연구를 위한 최적의 조직 균등포 농도 범위를 결정하기 위해 수행되었다. 종양 균질화는 처음에 40 mg/mL에서 제조된 다음 선형으로 희석하였다. 조직 질량으로 정규화된O2 플럭스는농도(그림 1A-D)에걸쳐 일관되었다. 40 mg/mL이 급속한 산소 고갈을 초래하고실험(도 1A)에적합하지 않은 것으로 관찰되었다. 산소 소비는 30 mg/mL 및 20 mg/mL로 실질적으로 둔화되었지만 기판 이나 ADP(그림 1B,C)가없는 상태에서 짧은 시간에 여전히 급격히 감소했습니다. 10 mg/mL 농도는 90분 더 긴 슈트 프로토콜을 지원하는 최적의 산소 소비율(도1D)을초래하였다.
SUIT 프로토콜은 NADH-및 간결한 OXPHOS 및 ET뿐만 아니라 CIV활동(그림 2A)을평가하는 데 사용되었습니다. Pyruvate 및 malate는 NADH를 통해 누출 (L)을 구동하는 ADP의 부재에 조직 호모전에 첨가되었다. 포화 ADP는 최대 NADH 연결 OXPHOS (P)를 구동하기 위해 추가된 다음 글루타민트를 첨가했습니다. 사이토크롬 c는 외부 막 무결성을 보장하기 위해 첨가되었다; 호흡률의 증가는 모든샘플(도 2B)에서20% 미만이었다. NADH 연결 기판에 대한 반응이 매우 낮을 때, 시토크롬 c 방출은 또한 간결하고 로테톤의 존재에서 평가되고 최소한의 사이토크롬 c 자극(도2B)을관찰하였다. 흥미롭게도, NADH-연결된 OXPHOS는 EO771종양(도 2C)에서무시할 수 있었다. 그런 다음 수치네이트는 피루바테, 말린, 글루타민트의 존재에 첨가되어 간결한 탈수소효소를 통해 전자흐름을 자극했다. FCCP는 EO771 종양에서 산화가 아닌 인산화가호흡(도 2C)으로제한되었다는 것을 밝혀낸 최대 전자 흐름(E)을 구동하기 위해 적정하였다. 로테네안 과 항마이신 A는 각각 복잡한 I와 복잡한 III를 억제하기 위해 적정하였다. 아스코르베이트와 TMPD는 CIV를 통해 최대 전자 흐름을 구동하기 위해 첨가되었고, 이는 나트륨 아지드에 의해 억제된다. 표 1은 도 2C에플롯된 호흡기 파라미터를 양량화하기 위해 원시 데이터(표2)의분석 적 감소 방정식을 도시한다. 전반적으로, 종양 균등호흡프로파일(도 2C)은종양내 N-및 S-연결된 기판에 의해 지원되는 감소된 최대 전자 전달을 제외하고 이식되지 않은 디지토닌-투과성 EO771 세포(도2D)와유사하다.
NADH-연결된 호흡은 무시할 수 있었기 때문에, 간결한 호흡 운동은 최대 속도(VMAX)가달성될 때까지 서브 포화 ADP의 단계별 적정에 의해 더 평가되었다(그림3A,3B). 간결한 + 로테네네의 존재시 ADP의 반최대 농도(KM)는37.5 μM이었고 VMAX는 ~10.5 pmol/s/mg(도3C)이었다. 따라서, 상대적으로 가난한 산화 속도에도 불구 하 고, EO771 종양 ADP에 매우 민감한 상대적으로 낮은 ADP 농도에서 지속적인 ATP 합성.
추출을 위해 원시 데이터의 적절한 영역을 선택하는 것은 실험의 재현성과 정확한 정량화에 매우 중요합니다. 사이토크롬 c의경우, 주사 직전의 정상 상태에서 마크를 선택해야한다(도 4A,마크 1). O2 플럭스가 안정되지 않는 기간(약 5-10분)이 뒤따를 수 있는 초기 사출 아티팩트가 종종 있습니다. 시토크롬 c 효율의 평가는O2 플럭스가 안정화되면 추가 선택을 함으로써 이루어진다(도4A,마크 2). 기판, ADP 또는 대부분의 억제제의 첨가 후 선택은 주사 유물 이후에 이루어지고 일단O2 플럭스가 안정화되면(도4B). 최대 결합되지 않은 호흡을 결정하는 데 사용되는 선택은 종종 최종 주입이 아닌 FCCP의 적정 시 달성된 피크증가(도 4C)에이루어진다. TMPD에 대한 선택은 아스코르베이트와 TMPD가 추가된 후 호흡의 최대증가(도 4D,마크 1)에 이루어진다. 이 피크 직후, 억제제, 아지드 나트륨이 첨가되어 호흡을 빠르게 감소시킬 뿐만 아니라 종종 주사 유물이 억제된 호흡속도(도4D)보다낮습니다. 억제제 마크는 주사 아티팩트(도4D,마크 2)직후에 이루어진다. O2 플럭스일반적으로 안정화되지 않고 계속 감소합니다.
표 1: 호흡기 표기막 및 분석 파생. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 발광 B 유방 종양균질의 샘플 및 호흡 특성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> 도 1: 종양 균등포 농도의 최적화. O2 플럭스(red) 및O2 농도(파란색)에서 제조된 유방 종양 균질화(A)40 mg/mL,(B)30 mg/mL,(C)20 mg/mL,(D)10 mg/mL에서 제조하였다. 톰: 조직 균모 호흡. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> 그림 2: OXPHOS 및 ET 용량의 평가는 갓 절제된 종양 균질화에서 고해상도 호흡학에 의한 평가. (A)기판, 억제제, 비커플기 프로토콜의 과정을 통해 산소 소비(red) 및 농도(blue)의 대표적인 플롯. PM: 피루바테 + 말레이트, D: ADP, G: 글루타메이트, c: 사이토크롬 c,S: 수치네이트, F: FCCP, 로트: 로테논, 아마: 안티마이신 A, Asc/TMPD: 아스코르바테/테트라메틸-phenyleniamine. (B)시토크롬 c를첨가하면O2 플럭스의 퍼센트 증가. (C-D) Malate, pyruvate, 글루타민트에 의해 지원되는 호흡은 ADP, FCCP 및 아스코르바테/TMPD의 존재에서 간결하게(C)EO771 유래 종양 균질화 및(D)비 이식 EO771 디포닌-퍼메아빌화 세포. 톰: 조직 균모 호흡; PM: 피루바테 + 말레이트; PMG: 피루바테 + 말린 + 글루타민트; PMGS: 피루바테 + 말린 + 글루타민트 + 수치네이트; CIV: 복잡한 IV; -L: 누출 상태; -P: 산화 인산화 상태, -E: 전자 전송 상태; N-연결: 정의된 NADH 생성 기판 조합에 의해 지원되는 O2 플럭스; NS 연결: 정의된 NADH 생성 기판 조합및 간결함의 수렴에 의해 지원되는 O2 플럭스. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> 그림 3: EO771 유방 종양은 높은 ADP (아데노신 5′-디포스페이트) 감도를 나타냈다. (A)S-연결된 ADP 적정 프로토콜 을 통하여 산소 소비(red) 및 농도(blue)의 대표적인 플롯. 톰: 조직 균모 호흡; S/로트: 수치네이트/로테네네; D: ADP. (B)로테네론의 존재와 ADP의 농도 증가 (0 μM ADP = S/Rot-L)의 증가 농도에서 간결에 의해 지원되는 호흡. (C)간결한 + 로테네론의 존재에서 ADP의 최대값(VMAX)및 반최대 농도(KM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> 도 4: 대표적인 추적은 데이터 추출을 위한 원시 O2 플럭스의 마크 선택을 보여주는 것입니다. (A)Cytochrome c 선택:O2 플럭스가 안정화되면 주입 후 Cytochrome c 주입 및 선택 번호 2 전에 선택 번호 1. c 사이토크롬 c. (B)기판, ADP 및 억제제 선택:O2 플럭스가 안정화된 주사 후 선택 번호 1(이 대표적인 플롯에서 간결). S: 수치네이트. (C)언커플러 선택: 선택 번호 1 은 분리기 적정 시 호흡이 최대 증가합니다. 이 대표적인 FCCP 적정 플롯에서 세 번째 주사는 호흡을 약간 감소시켜 선택에 사용되지 않습니다. F: ACCP. (D)TMPD 선택: 아스코르베이트 및 TMPD 주사 후 호흡의 피크 증가에 선택 번호 1. 나트륨 아지드 선택: 호흡이 처음에 감소할 때 급성 주사 유물 후 선택 번호 2. As/Tm: 아스코르베이트/TMPD; 아즈드: 아지데. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

우리는 신선한 종양 균질화에서 미토콘드리아 산화 인산화 및 전자 전달 용량을 평가하기 위한 실용적인 프로토콜 및 분석 접근법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 암 개시, 진행 및 치료 반응에 기여하는 다양한 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.

절제된 고형 종양 균질화의 미토콘드리아 기능의 분석 적 결정

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

이 프로토콜은 종양 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 간단하고 신속한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 임상 번역 종양학에 광범위하게 적용되며 암의 발병 및 진행에서 미토콘드리아의 역할에 대한 진단 및 기계론적 해석을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 균질화하여 제조를 단순화하고 확산의 한계를 완화하면서 미토콘드리아의 수율을 최대화하는 것입니다.이 기술은 새로 생검 또는 절제된 종양 조직을 사용하여 종양 미토콘드리아 기능의 정량적 평가와 임상 및 진단 설정에 있는 잠재적인 응용을 제공합니다. 먼저 미토콘드리아 호흡 배지 또는 MiR05의 1밀리리터를 함유한 유리 균질화제를 젖은 얼음 위에 단단히 끼우는 유리 봉제에 넣습니다. 생검 보존 용액 또는 생검의 1 밀리리터에 조직을 얼음 차가운 페트리 접시에 놓습니다.종양을 각각 약 5~10밀리그램의 작은 조각으로 자르고 남은 종양 조각을 얼음 위에 보관한 10밀리리터에 다시 넣습니다. 필터 용지에 티슈 섹션을 조심스럽게 얼룩진 후, 작은 플라스틱 타르 계량 보트에 놓고 초기 젖은 무게를 기록하십시오. 사용하지 않은 조각을 BIOPS의 10 밀리리터 원추형 튜브에 다시 배치하여 지속적인 보존을 위해 하십시오.조직 섹션을 MiR05가 함유된 얼음 냉균질제에 잠급니다. 0.09 ~ 0.16 밀리미터의 클리어런스 범위의 유리 유봉을 사용하여 5 ~ 7 개의 위아래로 스트로크를 완료하여 종양 조직을 부드럽게 방해합니다. 각 스트로크에 대해 유봉을 시계 방향으로/반시계 방향으로 세 번 회전시키면서 유봉을 아래로 밀고 유봉을 다시 당기면서 세 번 더 회전합니다.조직이 뇌졸중 사이에 균질화의 바닥에 정착할 수 있도록 허용하지만 발포를 방지하기 위해 유체 부피 위에 유봉을 완전히 가져 오는 것을 피하십시오. 15밀리리터 원컬 튜브에 동형어를 붓고 얼음 위에 놓습니다. 페일과 균질화로 신선한 MiR05의 1 ~3 밀리리터가 남은 조직 균질화세척을 합니다.MiR05 세척을 동종 구균이 들어 있는 원색 튜브에 붓습니다. 이 단계를 2~3회 반복하여 동종모네이트의 완전한 전송을 보장합니다. 조직 균질화 농도를 정확하게 계산하려면 결합 조직을 포함하는 남은 비균질화 물질에 대해 균질화및 균질화물질을 주의 깊게 검사합니다.핀셋으로 도달할 수 없는 균질화 물질로부터 비균질화 물질을 제거하기 위해, MiR05를 균질화기에 첨가한 후, 조직을 포함한 부피를 피펫으로 흡인시키고 페트리 접시로 이동한다. 피펫으로 그들을 흡입하여 동형 관의 바닥에 있는 큰 조각에 정착된 비균질화 물질을 제거하고 원물 튜브의 캡에 놓습니다. 페트리 접시 또는 원물 튜브 캡에서 핀셋으로 조직을 제거하고 필터 용지에 얼룩을 냅니다.원추형 튜브 캡에서 남은 동형모를 원추형 튜브에 다시 넣습니다. 튜브를 캡한 다음 혼합하는 반전. 균질화 및 균질화균재를 추가비균질화 물질에 대해 재검사하고 필요한 경우 균질화되지 않은 물질을 제거하는 단계를 반복한다.균질화로부터 회수된 비균질화 물질의 질량을 계량및 기록한다. 전달된 심하게 손상되지 않은 조직에 대한 균질제제를 검사하고, 비균질화 조각을 제거하고 필요에 따라 무게를 측정합니다. 최종 샘플 중량을 계산하기 위해 초기 젖은 중량에서 계량 보트, 균질화 및 균질화에서 회수된 조직 중량을 빼는다.최종 샘플 중량을 사용하여 MiR05를 추가하여 원하는 농도로 동종모네이트를 가져옵니다. 동형모의 무게와 준비되면 가능한 한 빨리 분석진행합니다. 샘플이 기기로 전송될 때까지 젖은 얼음에 보관하십시오.기기가 보정되고 샘플이 준비되면 비틀기 동작으로 스토퍼를 제거하고 챔버 내부에서 MiR05를 흡인하여 챔버 내부에 노출된 멤브레인을 피하십시오. 동종균을 잘 섞고 챔버에 균주형2.25 밀리리터를 추가합니다. 하나의 균모가 여러 챔버에 추가되고 있다고 가정, 동일한 조직 분포를 보장하기 위해 균모를 혼합하는 동안 각 챔버에 한 번에 호모게네이트의 파이펫 1 밀리리터.F4를 클릭하여 이벤트의 이름을 지정하고 타임스탬프를 클릭한 다음 Okay를 클릭합니다. 무딘 18 게이지 바늘을 사용하여 조절기 및 가스 튜브로 산소 탱크에서 산소로 50 밀리리터 주사기를 채웁니다. 약 500 마이크로 몰라 산소에 그들을 과산소를 챔버에 직접 산소를 주입.스토퍼를 느슨하게 삽입하고 산소가 약 480 마이크로 몰라에 도달 할 때까지 닫을 때까지 기다립니다. 비틀기 동작으로 챔버를 천천히 닫고 호흡이 약 15~20분 동안 평형화되도록 합니다. 필요한 경우 스토퍼의 중앙 모세관을 MiR05로 채웁니다.전용 현미경을 사용하여 기판, 분리기 및 억제제를 완전히 닫힌 챔버에 주입하여 각 챔버의 이벤트를 실시간으로 지정하고 타임스탬프를 찍습니다. 필요에 따라 산소 농도 및 산소 경사 음척도를 조정하려면 F6를 선택합니다. 각 주입 후, 수용성 화합물에 대한 물에 주사를 세 번 세척하고, 에탄올 용해 화합물에 대한 70 %에탄올.0.8-어금니 마레이의 5개의 마이크로리터를 추가하고 다음 주사로 즉시 진행합니다. 주사 주사기를 물에 세 번 씻으시면 됩니다. 즉시 1-어금니 피루바테의 5개의 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다.주사기를 세척한 후 0.5-어금니 ADP의 10마이크로리터를 추가하고 ADP 응답이 안정화될 때까지 기다립니다. 주사기를 씻고 2-어금니 글루타민의 5 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 주사기를 씻은 다음 4 밀리머 사이토크롬-C의 마이크로리터 5기를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다.주사기를 세척 한 후, 1-어금니 의 20 마이크로 리터를 추가하고 호흡이 안정 될 때까지 기다립니다. 1 밀리머 FCCP의 0.5- 1-마이크로리터 증분을 적시하고 각 주입 후 호흡이 안정화될 때까지 기다립니다. 호흡이 추가로 증가하지 않는 때까지 계속하십시오.사출 주사기를 70%에 탄올로 3회 세척합니다. 150 마이크로몰라 로테론의 2개의 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 더 이상 억제가 없는지 확인하기 위해 로테논의 또 다른 마이크로리터를 추가합니다.호흡의 감소가있는 경우, 호흡의 감소가 없을 때까지 추가 주사를 계속, 다음 70 %에탄올에서 세 번 주사 주사기를 세척. 125 마이크로몰라 항마이신 A의 2개의 마이크로리터를 추가하고 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 더 이상 억제가 없는지 확인하기 위해 항마이신 A의 또 다른 마이크로리터를 추가합니다.호흡의 감소가 있는 경우에, 호흡에 있는 감소가 없을 때까지 추가 주사를 계속하십시오. 70%에탄올로 주사기를 세 번 씻으시다. 챔버의 산소 농도를 확인합니다.농도가 125 마이크로몰라 이하인 경우, 산소가 호흡 플럭스를 제한하지 않도록 실내 공기에 재산소, 또는 약간 과산소를 합니다. 0.8-어금니 아스콜베이트 5개의 마이크로리터를 추가합니다. 주사기를 70%에 탄올로 3번 씻으시다.즉시 0.2-어금니 TMPD의 10 마이크로 리터를 추가하고 호흡의 증가를 기다립니다. 에탄올로 주사기를 세척한 후, 아스코르바테 TMPD 고원의 호흡 플럭스가 즉시 4-어자 나트륨 아지드 25마이크로리터를 추가합니다. 파일을 클릭하여 종료하고 저장 하고 연결을 끊습니다.그것은 관찰 되었다 40 조직 균모의 밀리 리터 당 밀리 그램 급속 한 산소 고갈 귀 착되 었. 산소 소비는 조직 균모제의 밀리리터 당 30 및 20 밀리그램으로 실질적으로 둔화되었지만 기판이나 ADP가 없는 상태에서 는 여전히 짧은 시간에 급격히 감소했습니다. 조직 균모의 밀리 리터 농도 당 10 밀리 그램 최적의 산소 소비 속도 결과.SUIT 프로토콜은 NADH 및 간결한 산화 인산화 및 전자 전달뿐만 아니라 복잡한 IV 활성을 평가하기 위해 사용되었습니다. Cytochrome C 릴리스는 피루바테와 말린, 또는 간결하고 로테네네의 존재에서 평가되었다, 둘 다 호모게네이트 준비가 미토콘드리아를 손상하지 않았다는 것을 밝혔다. 그것은 또한 NADH 연결 산화 인 산화 EO771 종양에서 무시할 수 있었다 는 것을 발견 되었다.최대 전자 흐름을 구동하는 FCCP의 적정은 EO771 종양에서 산화보다는 인산화가 호흡으로 제한되었다는 것을 밝혔습니다. 종양 균모전 호흡 프로파일은 종양에서 N 및 S-연결된 기판에 의해 지원되는 감소된 최대 전자 전달을 제외하고, 이식되지 않은, 디지토닌-투과성 EO771 세포의 것과 유사하였다. 간결한 호흡 역학은 최대 속도가 달성될 때까지 ADP를 정복하는 단계적 적정에 의해 더욱 평가되었다.간결하고 로테네인이 있는 ADP의 반 최대 농도는 37.5 마이크로몰라였으며, 최대 속도는 밀리그램당 초당 약 10.5피코몰이었다. 일상적인 치료에 설정된 악기와 조직 처리는 이러한 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 이러한 절차에 따라 금리 정상화에 대한 다른 질량 또는 마커별 접근 방식은 관심 문제에 따라 적용될 수 있습니다.일반적인 측정은 정석 신디사이저의 총 단백질 정량화 및 효소 활성을 포함하지만 모델 시스템, 통계 적 설계 및 연구 질문에 따라 다릅니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

연구

암 연구학

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...