Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core за уход за животными. Это исследование было частично поддержано грантами Национального института здравоохранения U54GM104940 (JPK) и KL2TR003097 (LAG). Все эксперименты и процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Пеннингтонского биомедицинского исследовательского центра.

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+cancer+metabolism.">Fundamentals of cancer metabolism.</a> Science Advances. 2 (5), 1600200 (2016).</li><li>Bajzikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivation+of+dihydroorotate+dehydrogenase-driven+pyrimidine+biosynthesis+restores+tumor+growth+of+respiration-deficient+cancer+cells.">Reactivation of dihydroorotate dehydrogenase-driven pyrimidine biosynthesis restores tumor growth of respiration-deficient cancer cells.</a> Cell Metabolism. 29 (2), 399-416 (2019).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ubiquinol+oxidation+is+necessary+for+tumour+growth.">Mitochondrial ubiquinol oxidation is necessary for tumour growth.</a> Nature. 585 (7824), 288-292 (2020).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6 (3), 18317 (2011).</li><li>Saks, V. A., et al., Saks, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics of the Cell: Quantitative Aspects. , 81-100 (1998).</li><li>Kaambre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+analysis+of+cellular+respiration+in+situ+in+intraoperational+samples+of+human+breast+cancer.">Metabolic control analysis of cellular respiration in situ in intraoperational samples of human breast cancer.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (5), 539-558 (2012).</li><li>Koit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+human+colorectal+and+breast+cancer+clinical+material+is+regulated+differently.">Mitochondrial respiration in human colorectal and breast cancer clinical material is regulated differently.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 1372640 (2017).</li><li>Holland, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+mitochondrial+respiration+in+the+human+placenta+over+gestation.">Changes in mitochondrial respiration in the human placenta over gestation.</a> Placenta. 57, 102-112 (2017).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).</li><li>Makrecka-Kuka, M., Krumschnabel, G., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+for+simultaneous+measurement+of+oxygen+and+hydrogen+peroxide+fluxes+in+permeabilized+cells,+tissue+homogenate+and+isolated+mitochondria.">High-resolution respirometry for simultaneous measurement of oxygen and hydrogen peroxide fluxes in permeabilized cells, tissue homogenate and isolated mitochondria.</a> Biomolecules. 5 (3), 1319-1338 (2015).</li><li>Kondrashova, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+native+properties+of+mitochondria+in+rat+liver+homogenate.">Preservation of native properties of mitochondria in rat liver homogenate.</a> Mitochondrion. 1 (3), 249-267 (2001).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells.">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292 (1), 125-136 (2007).</li><li>Hlozkov&#225;, K., Starkov&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+metabolic+profile+of+primary+leukemia+cells.">Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (141), e58426 (2018).</li><li>Zhang, J., Zhang, Q., Haznadar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Metabolism: Methods and Protocols. , 353-363 (2019).</li><li>Wigner, P., Zielinski, K., Labieniec-Watala, M., Marczak, A., Szwed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin-transferrin+conjugate+alters+mitochondrial+homeostasis+and+energy+metabolism+in+human+breast+cancer+cells.">Doxorubicin-transferrin conjugate alters mitochondrial homeostasis and energy metabolism in human breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4544 (2021).</li><li>Sch&#246;pf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+phosphorylation+and+mitochondrial+function+differ+between+human+prostate+tissue+and+cultured+cells.">Oxidative phosphorylation and mitochondrial function differ between human prostate tissue and cultured cells.</a> The FEBS Journal. 283 (11), 2181-2196 (2016).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Le Naour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EO771,+the+first+luminal+B+mammary+cancer+cell+line+from+C57BL/6+mice.">EO771, the first luminal B mammary cancer cell line from C57BL/6 mice.</a> Cancer Cell International. 20, 328 (2020).</li><li>Gnaiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+physiology.">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetics Communications. 1, 44 (2020).</li><li>Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respirometric+oxidative+phosphorylation+assessment+in+saponin-permeabilized+cardiac+fibers.">Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li><li>Munday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+radical,+hydrogen+peroxide+and+hydroxyl+radical+during+the+autoxidation+of+N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.">Generation of superoxide radical, hydrogen peroxide and hydroxyl radical during the autoxidation of N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine.</a> Chemico-Biological Interactions. 65 (2), 133-143 (1988).</li><li>Moser, M. D., Matsuzaki, S., Humphries, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+succinate-linked+respiration+and+complex+II+activity+by+hydrogen+peroxide.">Inhibition of succinate-linked respiration and complex II activity by hydrogen peroxide.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 488 (1), 69-75 (2009).</li><li>Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G., Kapelko, V. I., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+parameters+in+cardiac+tissue:+a+novel+method+of+assessment+by+using+saponin-skinned+fibers.">Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 892 (2), 191-196 (1987).</li><li>Gnaiger, E., Heldmaier, G., Klingenspor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+the+Cold.">Mitochondria in the Cold.</a> Life in the Cold. , 431-442 (2000).</li><li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+fluorespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells,+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle,+and+isolated+mitochondria.">High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+disruption+of+respiratory+supercomplexes+as+a+new+strategy+to+suppress+Her2(high)+breast+cancer.">Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2(high) breast cancer.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 26 (2), 84-103 (2017).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathways+and+respiratory+control.">Mitochondrial pathways and respiratory control.</a> Bioenergetics Communications. 5th ed. , (2020).</li><li>Barksdale, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+viability+in+mouse+and+human+postmortem+brain.">Mitochondrial viability in mouse and human postmortem brain.</a> FASEB Journal. 24 (9), 3590-3599 (2010).</li><li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions.">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reportys. 10 (1), 13179 (2020).</li><li>Jorgensen, L. B., Overgaard, J., Hunter-Manseau, F., Pichaud, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+changes+in+mitochondrial+substrate+use+at+critically+high+temperatures:+a+comparative+study+using+Drosophila.">Dramatic changes in mitochondrial substrate use at critically high temperatures: a comparative study using Drosophila.</a> Journal of Experimental Biology. 224, (2021).</li><li>Salin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+ATP+production+in+tissue+homogenates+and+calculation+of+effective+P/O+ratios.">Simultaneous measurement of mitochondrial respiration and ATP production in tissue homogenates and calculation of effective P/O ratios.</a> Physiological Reports. 4 (20), 13007 (2016).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов, связанного с данной работой.

Все клетки тесно связаны своей потребностью производить и потреблять аденозинтрифосфат (АТФ), молекулярную энергетическую валюту. Поскольку клеточные мутации приводят к образованию опухолей, митохондрии обеспечивают выживание за счет диверсификации производства энергии, которая часто фенотипически отличается от нераковойткани 1,2,3. Таким образом, существует острая необходимость в быстром и глубоком профилировании дыхательной функции митохондрий, чтобы облегчить классификацию типа опухоли, инициации рака, прогрессирования и ответа на лечение.
Дыхательные функции образцов иссеченной ткани не могут быть оценены неповрежденными, поскольку первичные субстраты для OXPHOS не являются клеточно-проницаемыми. Чтобы преодолеть это ограничение, митохондрии могут быть получены либо путем выделения, химической пермеабилизации, либо механической гомогенизации. Митохондриальная изоляция долгое время считалась золотым стандартом для оценки дыхательной функции. Тем не менее, он требует большого количества ткани, занимает много времени и является низкопродуктивным с возможным смещением отбора для определенных фракций митохондрий4. Пермеабилизация состоит из механического разделения и воздействия на участки тканей или пучки волокон мягкого моющего средства, которое избирательно разлагает плазматическую мембрану5. Пермеабилизация часто используется в поперечно-полосатых тканях, таких как скелетная и сердечная мышцы, поскольку отдельные пучки волокон могут быть разделены. По сравнению с изоляцией, пермеабилизация дает больше митохондрий в их родной клеточной среде и физической форме5. Пермеабилизация успешно применяется в других тканях, таких как опухоль6,7 и плацента8; однако воспроизводимость пермеабилизированных волоконных препаратов может быть затруднена из-за консистенции рассечения и потребностей в кислороде для преодоления диффузионных ограничений9. Кроме того, пермеабилизированные волокна могут быть непригодны для некоторых типов опухолей, которые являются плотно клеточными и высокофиброзными. Тканевые гомогенаты образуются путем механического разрушения плазматической мембраны и аналогичны пермеабилизированным волокнам с точки зрения выхода митохондрий и целостности10. Тканевые гомогенаты также минимизируют ограничения диффузии кислорода и могут быть легко использованы между типами тканей путем оптимизации механической силы11,12.
Здесь мы описываем простой и быстрый метод количественной оценки скорости окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и способности переноса электронов (ET) в свежеиссеченных твердых гомогенатах опухоли. Протокол оптимально разработан для оценки свежих тканей с использованием респирометра высокого разрешения Oxygraph-2k (O2k), который требует предварительных знаний инструментальной настройки и калибровки, но может быть аналогичным образом адаптирован с использованием любого электрода типа Кларка, анализатора Seahorse или считывателя пластин. Протокол может быть воспроизводимо применен к видам и типам опухолей, а также адаптирован для оценки разнообразия митохондриальных et-путей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

Митохондрии необходимы для возникновения и прогрессирования рака посредством производства энергии, регуляции активных форм кислорода и синтеза макромолекул. Генетические и функциональные адаптации митохондрий к опухолевой среде стимулируют пролиферативный и метастатический потенциал. Появление секвенирования ДНК и РНК устранило критические барьеры для оценки генетических медиаторов опухолевого генеза. Однако на сегодняшний день методологические подходы к оценке митохондриальной функции опухоли остаются неуловимыми и требуют технического мастерства, ограничивающего осуществимость, в конечном итоге уменьшая диагностическую и прогностическую ценность как в экспериментальных, так и в клинических условиях. Здесь мы описываем простой и быстрый метод количественной оценки скорости окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и переноса электронов (ET) в свежеиссекенных твердых гомогенатах опухоли с использованием респирометрии высокого разрешения. Протокол может быть воспроизводимо применен к видам и типам опухолей, а также адаптирован для оценки разнообразия митохондриальных et-путей. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что мыши, перенесшие люминальный рак молочной железы B, демонстрируют дефектное никотинамид-динуклеотид-связанное дыхание и зависимость от сукцината для получения аденозинтрифосфата через OXPHOS.

Первоначальные исследования показали, что опухоли EO771 были низкоокислительными и, следовательно, требовали высоких концентраций гомогенатов для адекватной оценки потока O2. Были проведены оптимизационные эксперименты для определения оптимального диапазона концентрации гомогената в тканях для исследования. Гомогенаты опухоли первоначально получали при 40 мг/мл, а затем линейно разбавляли. ПотокO2, нормализованный до массы ткани, был согласован по всем концентрациям(рис. 1A-D). Было отмечено, что 40 мг/мл приводит к быстрому истощению кислорода и не подходит для экспериментов(рисунок 1А). Потребление кислорода существенно замедлилось с 30 мг/мл и 20 мг/мл, но все же быстро снижалось за короткое время в отсутствие субстратов или АДФ(Рисунок 1В,С). Концентрация 10 мг/мл привела к оптимальному расходу кислорода(рисунок 1D),который поддерживал бы более длинный 90-минутный протокол SUIT.
Протокол SUIT использовался для оценки NADH- и сукцинат-связанных OXPHOS и ET, а также активности CIV(рисунок 2A). Пируват и малат добавляли к гомогенату ткани в отсутствие АДФ для утечек (L) через NADH. Затем добавляли насыщенный АДФ для обеспечения максимального NADH-связанного OXPHOS (P), за которым следовало добавление глутамата. Затем добавляли цитохром c для обеспечения целостности наружной мембраны; увеличение частоты дыхания составило менее 20% во всех выборках(рисунок 2В). Учитывая очень низкую реакцию на NADH-связанные субстраты, высвобождение цитохрома c также оценивали в присутствии сукцината и ротенона и наблюдали минимальную стимуляцию цитохрома c (рисунок 2B). Интересно, что NADH-связанный OXPHOS был незначительным в опухолях EO771(рисунок 2C). Затем сукцинат добавляли в присутствии пирувата, малата и глутамата для стимуляции потока электронов через сукцинатдегидрогеназу. Затем FCCP был титрован для управления максимальным потоком электронов (E), что показало, что в опухолях EO771 фосфорилирование, а не окисление ограничивало дыхание(рисунок 2C). Ротенон и антимицин А были впоследствии титрованы для ингибирования комплекса I и комплекса III соответственно. Затем были добавлены аскорбат и TMPD для управления максимальным потоком электронов через CIV, который затем ингибируется азидом натрия. Таблица 1 иллюстрирует аналитические уравнения редукции исходных данных(Таблица 2)для количественного определения параметров дыхания, построенных на рисунке 2C. В целом, гомогенатные респираторные профили опухоли(рисунок 2C)аналогичны профилям неимплантированных проницаемых дигитонином клеток EO771(рисунок 2D),за исключением уменьшенного максимального переноса электронов, поддерживаемого N- и S-сцепленными субстратами в опухоли.
Поскольку NADH-связанное дыхание было незначительным, дыхательная кинетика сукцината дополнительно оценивалась путем поэтапного титрования субнасыщенного АДФ до достижения максимальной скорости (VMAX)(рисунок 3A,3B). Полумаксимальная концентрация (KM)АДФ в присутствии сукцината + ротенона составляла 37,5 мкМ, тогда как VMAX составляла ~10,5 пмоль/с/мг(рисунок 3C). Таким образом, несмотря на относительно низкие скорости окисления, опухоли EO771 были очень чувствительны к АДФ и поддерживали синтез АТФ при относительно низких концентрациях АДФ.
Выбор соответствующих областей необработанных данных для извлечения имеет решающее значение для воспроизводимости экспериментов и точной количественной оценки. Для цитохрома cмаркировка должна быть выбрана в установившемся состоянии непосредственно перед инъекцией(рисунок 4A, отметка1). Часто существует начальный артефакт инъекции, за которым может последовать период времени (около 5-10 минут), когда поток O2 не является устойчивым. Оценка эффективности цитохрома c производится путем дополнительного выбора после стабилизации потока O2 (рисунок 4A,отметка 2). Выбор после добавления субстратов, АДФ или большинства ингибиторов также производится после инъекционного артефакта и после стабилизации потока O2 (рисунок 4B). Отбор, используемый для определения максимального несвязанного дыхания, производится на пиковом увеличении, достигнутом при титровании FCCP, которое часто является не последней произведенной инъекцией(рисунок 4C). Выбор для TMPD производится после добавления аскорбата и TMPD и на пике увеличения дыхания(рисунок 4D,отметка 1). Сразу после этого пика добавляется ингибитор, азид натрия, который быстро уменьшает дыхание, но также часто имеет артефакт инъекции ниже, чем скорость ингибированного дыхания(рисунок 4D). Маркировка ингибитора производится сразу после инъекции артефакта(рисунок 4D,отметка 2). ПотокO2, как правило, не стабилизируется и продолжает уменьшаться.
Таблица 1: Дыхательная нотация и аналитический вывод. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Таблица 2: Выборочные и дыхательные характеристики гомогенатов люминальной опухоли молочной железы В. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> Рисунок 1:Оптимизация концентрации гомогената опухоли. O2 Flux (красный) и O2 Концентрация (синий) в гомогенатах опухоли молочной железы, приготовленных при(A)40 мг/мл,(B)30 мг/мл,(C)20 мг/мл и(D)10 мг/мл. Том: Тканевое гомогенатное дыхание. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> Рисунок 2:Оценка емкости OXPHOS и ET с помощью респирометрии высокого разрешения в свежеиссеченных гомогенатах опухоли. (A)Репрезентативный график потребления кислорода (красный) и концентраций (синий) в течение протокола субстрата, ингибитора, разъединителя. PM: Пируват + Малат, D: ADP, G: Глутамат, c: Цитохром c,S: Сукцинат, F: FCCP, Ротенон, Ama: Антимицин A, Asc / TMPD: Аскорбат / Тетраметил-п-фенилендиамин. (B)Процентное увеличение потокаO2 при добавлении цитохрома c. (C-D) Дыхание поддерживается малатом, пируватом, глутаматом и сукцинатом в присутствии АДФ, FCCP и аскорбата/TMPD в(C)EO771-производных опухолевых гомогенатах и(D)неимплантированных EO771 дигитонин-пермеабилизированных клетках. Том: Тканевое гомогенатное дыхание; ПМ: Пируват + Малат; ПМГ: Пируват + Малат + Глутамат; ПМГС: Пируват + Малат + Глутамат + Сукцинат; CIV: Комплекс IV; -L: Состояние утечки; -P: Состояние окислительного фосфорилирования, -E: Состояние переноса электронов; N-связанный: поток O2, поддерживаемый определенными NADH-генерирующими комбинациями подложек; NS-связанный: поток O2, поддерживаемый сходимостью определенных NADH-генерируемых комбинаций субстратов и сукцината. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> Рисунок 3:Опухоли молочной железы EO771 проявляли высокую чувствительность к АДФ (аденозин-5'-дифосфату). (A)Репрезентативный график потребления кислорода (красный) и концентраций (синий) во всем протоколе титрования АДФ, связанного с S. Том: Тканевое гомогенатное дыхание; S/Rot: Сукцинат/Ротенон; Д: АДП. (B)Дыхание, поддерживаемое сукцинатом в присутствии ротенона и повышение концентраций АДФ (0 мкМ АДФ = S/Rot-L). (C)Максимальная скорость (VMAX)и полумаксимальная концентрация (KM)АДФ в присутствии сукцината + ротенона. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> Рисунок 4:Репрезентативная трассировка, иллюстрирующая выбор метки необработанных потоков O2 для извлечения данных. (A) Выбор цитохрома c: выбор No 1 перед инъекцией цитохрома c и выбор No 2 после инъекции, когда поток O2 стабилизировался. c Цитохром c. (B)Выбор субстрата, АДФ и ингибитора: отбор No 1 после инъекции (сукцината на этом репрезентативном участке), где поток O2 стабилизировался. S: Сукцинат. (C) Выбор разъединителя: выбор No 1 на пике увеличения дыхания во время титрования разъединителя. На этом репрезентативном участке титрования FCCP третья инъекция немного снижает дыхание и, таким образом, не используется для отбора. F: ACCP. (D) Выбор TMPD: выбор No 1 на пике увеличения дыхания после инъекций аскорбата и TMPD. Выделение азида натрия: выделение No 2 после острого инъекционного артефакта, когда дыхание первоначально уменьшается. As/Tm: Аскорбат/TMPD; Азд: Азиде. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates at JoVE.com

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Мы разработали практический протокол и аналитический подход для оценки митохондриального окислительного фосфорилирования и способности переноса электронов в свежих гомогенатах опухоли. Этот протокол может быть легко адаптирован для изучения различных митохондриальных функций, которые способствуют инициации, прогрессированию рака и ответу на лечение.

Аналитическое определение митохондриальной функции иссеченных твердых гомогенатов опухоли

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Этот протокол описывает простой и быстрый метод измерения митохондриальной функции опухоли. Протокол широко применим к клинической трансляционной онкологии и поможет улучшить диагностическую и механистическую интерпретацию роли митохондрий в возникновении и прогрессировании рака. Основным преимуществом этой методики является применение гомогенизации тканей для упрощения приготовления и максимизации выхода митохондрий при одновременном смягчении ограничений диффузии.Этот метод предлагает потенциальное применение в клинических и диагностических условиях с количественной оценкой функции митохондрий опухоли с использованием свежепанзионной или иссеченной опухолевой ткани. Начните с помещения стеклянного гомогенизатора, содержащего один миллилитр митохондриальной дыхательной среды, или MiR05, в плотно прилегающий стеклянный пестик на влажном льду. Поместите ткань в один миллилитр раствора для сохранения биопсии, или BIOPS, в ледяную чашку Петри.Разрежьте опухоль на небольшие кусочки примерно по 5-10 миллиграммов каждый, а оставшиеся кусочки опухоли поместите обратно в 10 миллилитров BIOPS, хранящихся на льду. После тщательного промокания участков тканей на фильтровальной бумаге поместите их на небольшую пластиковую смоляную весовую лодку и запишите начальный влажный вес. Поместите неиспользованные кусочки обратно в 10-миллилитровую коническую трубку BIOPS для дальнейшего сохранения.Погрузите участки ткани в гомогенизатор ледяного холода, содержащий MiR05, и запишите оставшийся вес на весовой лодке. Используя стеклянный пестик с диапазоном клиренса от 0,09 до 0,16 миллиметра, мягко разрушайте опухолевую ткань, выполнив пять-семь ударов вниз и вверх. Для каждого удара поворачивайте пестик по часовой стрелке / против часовой стрелки три раза, толкая пестик вниз, и три дополнительных раза, вытягивая пестик обратно вверх.Дайте ткани осесть на дно гомогенизатора между ударами, но избегайте полного поднятия пестика над объемом жидкости, чтобы предотвратить вспенивание. Вылейте гомогенат в 15-миллилитровую коническую трубку и поместите его на лед. Пипетка от одного до трех миллилитров свежего MiR05 над пестиком и в гомогенизатор для промывки оставшегося гомогената ткани.Вылейте промывку MiR05 в коническую трубку, содержащую гомогенат. Повторите этот шаг два-три раза, чтобы обеспечить полную передачу гомогената. Чтобы точно рассчитать концентрацию гомогената в тканях, тщательно осмотрите гомогенизатор и гомогенат на наличие оставшегося негомогенизированного материала, в состав которого входит соединительная ткань.Чтобы удалить из гомогенизатора негомогенизированный материал, который не может быть достигнут пинцетом, после добавления MiR05 к гомогенизатору аспирировать объем, включая ткань, пипеткой и переместить содержимое в чашку Петри. Извлеките неомогенизированный материал, осевший крупными кусками в нижней части конической трубки, из гомогената, аспирируя их пипеткой, и поместите их на крышку конической трубки. Снимите ткань с чашки Петри или колпачка конической трубки пинцетом и промойте ее на фильтровальной бумаге.Добавьте оставшийся гомогенат из колпачка конической трубки обратно в коническую трубку. Закройте трубку крышкой, затем переверните, чтобы перемешать. Повторно проверьте гомогенизаторы и гомогенат для любого дополнительного негомогенизированного материала и повторите шаги, чтобы удалить негомогенизированный материал, если это необходимо.Взвешивайте и регистрируйте массу неодногенизированного материала, извлеченного из гомогенизатора. Осмотрите гомогенатный препарат на наличие любой переносимой грубо неповрежденной ткани, удалите неоднородизированные кусочки и взвесьте по мере необходимости. Вычтите вес ткани, извлеченный из весовой лодки, гомогенизатора и гомогената из первоначального живого веса, чтобы рассчитать окончательный вес образца.Используя окончательную массу образца, добавьте дополнительный MiR05, чтобы довести гомогенат до желаемой концентрации. После того, как гомогенат взвешен и приготовлен, приступайте к анализу как можно скорее. Храните образец на влажном льду до тех пор, пока он не будет перенесен на инструмент.После калибровки прибора и подготовки образца снимите пробки скручивающим движением и аспирируйте MiR05 из камер, избегая мембраны, подвергающейся воздействию внутри камеры. Хорошо перемешайте гомогенат и добавьте в камеру 2,25 миллилитра гомогената. Предположим, что один гомогенат добавляется в несколько камер, пипетка по одному миллилитру гомогената за раз в каждую камеру, смешивая гомогенат для обеспечения равного распределения тканей.Нажмите клавишу F4, чтобы назвать событие и пометить время, а затем нажмите кнопку ОК. Наполните 50-миллилитровый шприц кислородом из кислородного баллона с регулятором и газовой трубкой с помощью тупой иглы 18-го калибра. Вводите кислород непосредственно в камеры, чтобы гипероксигенировать их примерно до 500 микромолярного кислорода.Свободно вставьте пробки и подождите, пока кислород не достигнет примерно 480-микромоляров. Скручивающим движением медленно закройте камеру и дайте дыханию уравновеситься в течение примерно 15-20 минут. При необходимости заполните центральный капилляр пробки MiR05.Используйте специальные микрошприцы для введения подложек, разъединителей и ингибиторов в полностью закрытые камеры, чтобы назвать и отметить время событий для каждой камеры в режиме реального времени. Выберите F6, чтобы при необходимости отрегулировать концентрацию кислорода и отрицательные масштабы наклона кислорода. После каждой инъекции промывайте шприц три раза в воде для водорастворимых соединений и 70% этаноле для растворенных в этаноле соединений.Добавьте пять микролитров 0,8-молярного малата и приступайте сразу к следующей инъекции. Промыть шприц для инъекций три раза в воде. Сразу же добавьте пять микролитров 1-молярного пирувата, и дождитесь стабилизации дыхания.После промывки шприца добавьте 10 микролитров 0,5-молярного АДФ и дождитесь стабилизации реакции АДФ. Вымойте шприц и добавьте пять микролитров 2-молярного глутамата и дождитесь стабилизации дыхания. Вымойте шприц, затем добавьте пять микролитров 4-миллимолярного цитохрома-С и дождитесь стабилизации дыхания.После промывки шприца добавить 20 микролитров 1-молярного сукцината и дождаться стабилизации дыхания. Титруйте 0,5-1-микролитровые приращения 1-миллимолярного FCCP и ждите, пока дыхание стабилизируется после каждой инъекции. Продолжают до тех пор, пока не произойдет дополнительного увеличения дыхания.Промыть шприц для инъекций трижды в 70% этаноле. Добавьте два микролитра 150-микромолярного ротенона и дождитесь стабилизации дыхания. Добавьте еще один микролитр ротенона, чтобы убедиться, что нет дальнейшего ингибирования.Если наблюдается снижение дыхания, продолжайте дополнительные инъекции до тех пор, пока не произойдет снижения дыхания, затем трижды промойте инъекционный шприц 70% этанолом. Добавьте два микролитра 125-микромолярного антимицина А и дождитесь стабилизации дыхания. Добавьте еще один микролитр антимицина А, чтобы убедиться, что нет дальнейшего ингибирования.Если наблюдается снижение дыхания, продолжайте дополнительные инъекции до тех пор, пока не произойдет снижения дыхания. Трижды промыть шприц 70% этанолом. Проверьте концентрацию кислорода в камере.Если концентрация ниже 125-микромолярной, реоксигенируйте в комнатный воздух или слегка гипероксигенат, чтобы гарантировать, что кислород не ограничивает дыхательный поток. Добавьте пять микролитров 0,8-молярного аскорбата. Промыть шприц три раза в 70% этаноле.Сразу добавьте 10 микролитров 0,2-молярного TMPD, и дождитесь увеличения дыхания. После промывки шприца этанолом добавляют 25 микролитров 4-молярного азида натрия сразу же, когда дыхательный поток аскорбата TMPD плато. Завершите работу, щелкнув Файл, Сохранить и отключиться.Было замечено, что 40 миллиграммов на миллилитр тканевого гомогената приводили к быстрому истощению кислорода. Потребление кислорода существенно замедлилось с 30 и 20 миллиграммами на миллилитр тканевого гомогената, но все же быстро снизилось за короткое время в отсутствие субстратов или АДФ. Концентрация гомогената тканей в 10 миллиграммах на миллилитр привела к оптимальному потреблению кислорода.Протокол SUIT использовался для оценки NADH- и сукцинат-связанного окислительного фосфорилирования и переноса электронов, а также активности комплекса IV. Высвобождение цитохрома С оценивали в присутствии пирувата и малата или сукцината и ротенона, оба из которых показали, что гомогенатный препарат не повреждает митохондрии. Также было обнаружено, что NADH-связанное окислительное фосфорилирование было незначительным в опухолях EO771.Титрование FCCP для управления максимальным потоком электронов показало, что в опухолях EO771 фосфорилирование, а не окисление, ограничивало дыхание. Гомогенатные респираторные профили опухоли были аналогичны профилям неимплантированных, пермеабилизированных дигитонином клеток EO771, за исключением уменьшенного максимального переноса электронов, поддерживаемого N- и S-сцепленными субстратами в опухоли. Респираторную кинетику сукцината дополнительно оценивали путем поэтапного титрования субсатурирующего АДФ до достижения максимальной скорости.Полумаксимальная концентрация АДФ в присутствии сукцината и ротенона составляла 37,5-микромолярной, тогда как максимальная скорость составляла примерно 10,5 пикомолей в секунду на миллиграмм. Инструменты, установленные для рутинного ухода, а также обработки тканей, имеют решающее значение для успеха этих экспериментов. В соответствии с этими процедурами могут применяться другие массовые или маркерные подходы к нормализации ставок на основе вопроса о проценте.Общие показатели включают общую количественную оценку белка и ферментативную активность цитратсинтазы, но варьируются в зависимости от системы моделей, статистического дизайна и исследовательского вопроса.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Оценивая роль митохондриальной функции в связанных с раком усталость

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Внеклеточная матрица модель трехмерных костей для остеосаркомы

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Анализ боковой популяции в линиях солидных опухолевых клеток

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Роман Стромальный Фибробласт-Модулированные 3D опухолевой сфероидной модели для изучения опухоли-Строма Взаимодействия и наркотиков Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

Автоматизированное дифференциальное ядерное окрашивание анализ для точного определения цитотоксичности митокана

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Моделирование первичных опухолей костей и метастазов в кости с имплантацией солидного опухолевого трансплантата в кость

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Изучение митохондриального энергетического метаболизма одиночных 3D-сфероидов микротизюса с использованием анализа внеклеточного потока

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...