Name: free-floating immunostaining of mouse brains
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00
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Gli investigatori sono stati supportati da sovvenzioni del NIH (K01DK119471 a CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 e R01DK120858 a YX), USDA/CRIS (51000-064-01S a YX) e American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) a LT.

Topi C57BL/6J di entrambi i sessi (8-16 settimane di età) sono stati utilizzati nel presente studio. La cura di tutti gli animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Baylor College of Medicine.
1. Perfusione
NOTA: i passaggi da 1.1 a 1.6 vengono eseguiti in una cappa aspirante.
<ol><li>Anestesia<ol>
<li>Versare 5 ml di isoflurano (vedi la Tabella dei materiali...

<ol>
	<li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity.">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li><li>Apovian, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+definition,+comorbidities,+causes,+and+burden.">Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden.</a> The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).</li><li>Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+metabolic+syndrome:+a+review.">Animal models of metabolic syndrome: a review.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).</li><li>Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+the+metabolic+syndrome.">Mouse models of the metabolic syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).</li><li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+immunohistochemistry.">Basics of immunohistochemistry.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li><li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+methods+for+frozen+and+paraffin+sections.">Immunostaining methods for frozen and paraffin sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TPH2+in+the+dorsal+raphe+nuclei+regulates+energy+balance+in+a+sex-dependent+manner.">TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner.</a> Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+vitamin+D+receptor+expression+in+the+brain+using+a+novel+VDR(Cre)+mouse.">Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue.">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).</li><li>Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation,+embedding,+and+sectioning+of+tissues,+embryos,+and+single+cells.">Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , (2001).</li><li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections.">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+potassium+current+in+AgRP/NPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism.">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice.">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li></ol>

Questo protocollo fornisce un metodo consolidato per studi neuroanatomici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento dei tessuti, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Tuttavia, alcuni dettagli chiave essenziali per risultati coerenti e affidabili devono essere ottimizzati.
La qualità della perfusione è fondamentale per una colorazione di successo. I risultati della colorazione potrebbero essere influenzati se il sangue rimane nel cervello, dato che le c...

La prevalenza dell'obesità e delle comorbidità associate ha raggiunto livelli epidemici, causando un enorme onere socioeconomico1,2. Sono stati sviluppati vari modelli murini per comprendere meglio i processi biologici responsabili dell'obesità3,4. Poiché i meccanismi centrali sono importanti per la regolazione dell'omeostasi energetica in questi modelli animali, gli studi neuroanatomici sul cervello dei topi sono diventati una tecnica necessaria in questo campo. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità delle tecniche di istologia cerebrale variano considerevolmente tra i laboratori e persino i ricercatori all'interno dello stesso laboratorio per vari motivi (ad esempio, anticorpi, tessuti, trattamenti, specie, obiettivi di ricerca). Pertanto, è necessario stabilire un protocollo generale per gli studi istologici del cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging. Nel frattempo, i principianti possono imparare, padroneggiare e regolare rapidamente questo protocollo per soddisfare le loro esigenze individuali.
La colorazione immunoistochimica è un metodo consolidato che è stato ampiamente utilizzato per visualizzare specifici tipi di cellule, mRNA e proteine in una varietà di tessuti (ad esempio, cervello e tessuti periferici)5,6. Più specificamente, un antigene di interesse può essere etichettato da uno specifico anticorpo primario e da un corrispondente anticorpo secondario legato a un enzima (ad esempio, immunoistochimica cromogenica) o a un colorante fluorescente (isotiocianato di fluoresceina)6. Come esempio dell'utilità di queste tecniche, β-endorfina [un peptide codificato da pro-opiomelanocortina (POMC)] e c-fos (un marker di attività neuronale) sono stati colorati nel nucleo arcuato. La delezione della triptofano idrossilasi 2 (un enzima parte integrante della sintesi della serotonina) nel nucleo del rafe dorsale ha dimostrato di ridurre l'espressione di c-fos nei neuroni POMC nel nucleo arcuato7. Inoltre, la distribuzione dell'mRNA del recettore della vitamina D è stata mappata nel cervello del topo tramite ibridazione in situ (RNAscope)8. Questo documento presenta un metodo affidabile ed efficiente con un flusso di lavoro passo-passo per l'immunocolorazione fluttuante, con l'obiettivo di migliorare la qualità e la riproducibilità degli studi istologici del cervello del topo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;30% Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302</td>
			<td>30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>10%, 25 &#176;C, pH 6.8-7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sub-Q Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifading mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable plastic desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5315-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVP antibody</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals</td>
			<td>H-065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoprotectant buffer</td>
			<td>User preference</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC310FX microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes (50-place)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT</td>
			<td>User preference</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion two automated Perfusion System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39471005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 20x</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVE703-1L</td>
			<td>25 &#176;C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slideing Microtome Microm HM450</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Microm HM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td>7220-32</td>
			<td>0.9%, 25 &#176;C, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein, DyLight 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>089k01921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WFA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Z1 Scanner</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 3.1 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>scanner software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

free-floating immunostaining of mouse brains

La colorazione immunoistochimica del cervello dei topi è una tecnica di routine comunemente usata nelle neuroscienze per studiare i meccanismi centrali alla base della regolazione del metabolismo energetico e di altri processi neurobiologici. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'istologia cerebrale possono variare tra i laboratori. Per ogni esperimento di colorazione, è necessario ottimizzare le procedure chiave in base alle differenze di specie, tessuti, proteine mirate e condizioni di lavoro dei reagenti. Questo documento dimostra un flusso di lavoro affidabile in dettaglio, tra cui perfusione intra-aortica, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging, che può essere seguito facilmente dai ricercatori in questo campo.
Sono inoltre discussi come modificare queste procedure per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori. Per illustrare l'affidabilità e l'efficienza di questo protocollo, le reti perineuronali sono state colorate con Listeria florbunda agglutinina (WFA) marcata con biotina e arginina vasopressina (AVP) con un anticorpo anti-AVP nel cervello del topo. Infine, sono stati affrontati i dettagli critici per l'intera procedura e i vantaggi di questo protocollo rispetto a quelli di altri protocolli. Nel complesso, questo documento presenta un protocollo ottimizzato per l'immunocolorazione fluttuante del tessuto cerebrale del topo. Seguire questo protocollo rende questo processo più facile sia per gli scienziati junior che senior per migliorare la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità degli studi di immunocolorazione.

Il diagramma di flusso di questo protocollo è brevemente illustrato nella Figura 1. La procedura di criosezione di questo laboratorio è dimostrata nella Figura 2A, in cui sono stati sezionati contemporaneamente 5 campioni di cervello. Il montaggio delle sezioni cerebrali è mostrato nella Figura 2B e una diapositiva completamente montata con sezioni cerebrali è illustrata nella Figura 2C. Nella <stro...

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Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Questo protocollo descrive un approccio efficiente e riproducibile per gli studi istologici sul cervello del topo, tra cui perfusione, sezionamento cerebrale, immunocolorazione fluttuante, montaggio dei tessuti e imaging.

Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

La colorazione immuno-istochimica del cervello dei topi è una tecnica comunemente usata nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, la qualità, l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati dell'istologia cerebrale possono variare tra diversi ricercatori e laboratori. Presentiamo una metodologia consolidata per gli studi istologici del cervello dei topi che ha dimostrato di essere riproducibile, affidabile ed efficiente.Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà il Dr.Chunmei Wang, un assistente professore del mio laboratorio Dopo aver confermato l'anestesia di successo in un topo C57 nero / 6J di otto-16 settimane, fissare il mouse su una tavola di schiuma e fare un'incisione superficiale longitudinale lungo la linea mediana sopra il torace e l'addome, quindi spostare la pelle da parte per esporre la parete muscolare del torace e dell'addome. Quindi, fare un'incisione nello strato muscolare per esporre il fegato e l'intestino. Quindi, usando le forbici, tagliare la cassa toracica per aprire il torace ed esporre il cuore e i polmoni.Usando una pinza emostatica, tirare la cassa toracica da parte per allargare l'area di lavoro. Prossimo. per posizionare una cannula di perfusione, penetrare direttamente nel ventricolo cardiaco sinistro con una cannula smussata e inserirla con cura nell'aorta ascendente. Posizionare i perni attorno alla congiunzione della cannula e del tubo accoppiato sul pannello di schiuma per fissare la cannula in posizione durante la perfusione e procedere a tagliare l'atrio destro per consentire il deflusso del sangue dalla circolazione.Per la perfusione con soluzione salina, accendere il pressostato salino e perfondere il mouse transcardialmente con 40-60 millilitri di soluzione salina. Osservare da vicino il deflusso dall'atrio destro e il colore del fegato. Successivamente, per perfondere con formalina, spegnere il pressostato salino e accendere il pressostato della formalina per perfondere il mouse con 40 millilitri di formalina tamponata in neutro al 10%.Osserva gli arti dell'animale per prove di tremori. Per l'isolamento cerebrale, utilizzare le forbici per rimuovere la testa e fare un'incisione della linea mediana lungo il tegumento per esporre il cranio, quindi tagliare la pelle e l'attaccamento muscolare. Quindi, fai un taglio sulla cresta orbitale e posiziona l'estremità affilata delle forbici dell'iride nel forame magnum.Far avanzare le forbici lungo la superficie interna del cranio, mantenendo la pressione verso l'alto per evitare danni al cervello. Quindi, rimuovere con attenzione le ossa parietali e frontali e le meningi prima di rimuovere il cervello dal cranio aperto. Posizionare il ghiaccio secco sopra la piastra di regolazione dell'altezza di un microtomo scorrevole e attendere che il gelo bianco sia visibile, quindi distribuire con cura cinque millilitri di saccarosio al 30% sopra la piastra per formare uno strato di base solido dopo che il saccarosio si è congelato.Quindi, posizionare tutti i campioni di cervello orizzontalmente in una linea sopra la base di saccarosio con 500 microlitri del 30% di saccarosio. Dopo cinque o 10 minuti di congelamento, quando il cervello è diventato duro e bianco, tagliare il cervello fino a raggiungere lo strato o la regione desiderata, quindi passare dalla modalità di taglio alla modalità di alimentazione e sezione del tessuto cerebrale per generare sezioni spesse 25 micrometri. Quindi, preparare una piastra a 48 pozzetti piena di PBS e contrassegnare cinque pozzetti per un cervello di topo.Usando un pennello, raccogli una sezione e posizionala in un pozzetto, quindi raccogli la sezione successiva dello stesso mouse e posizionala nel secondo pozzo. Ripetere la procedura fino a raggiungere il quinto pozzo posizionando le sezioni da sei a 10 nel primo al quinto pozzo e così via. Posizionare un colino cellulare in un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti piena di PBS e, usando un pennello, trasferire una serie di sezioni cerebrali nel filtro cellulare.Risciacquare queste sezioni in PBS trasferendo il filtro cellulare in un altro pozzo pieno di PBS sullo shaker. Quindi, trasferire le sezioni cerebrali dal filtro cellulare in un tubo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di WFA marcato con biotina e incubare su una piattaforma a dondolo a 50 RPM durante la notte. Il giorno seguente, sciacquare le sezioni cerebrali con PBS come dimostrato in precedenza, quindi trasferire le sezioni in un tubo contenente un millilitro di soluzione di streptavidina-luce diurna 488 e incubare per due ore su una piattaforma a dondolo.Dopo aver risciacquato nuovamente le sezioni cerebrali con PBS, incubarle in tampone di blocco per due ore, seguito da incubazione in anticorpi primari durante la notte su una piattaforma a dondolo. Il giorno successivo, dopo i risciacqui PBS, incubare le sezioni in anticorpo secondario per due ore. Riempire due piastre di Petri con 100 millilitri di PBS e trasferire tutte le sezioni cerebrali da un colino al primo piatto.Allineare le sezioni cerebrali in ordine neuroanatomico da caudale a rostrale. Quindi, immergere una diapositiva nel secondo piatto con un'estremità leggermente inclinata con un supporto e, usando un pennello fine, posizionare delicatamente una sezione cerebrale appena sotto l'interfaccia del buffer dell'aria sulla diapositiva inclinata. Successivamente, utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere lentamente e delicatamente il buffer per abbassarne il livello fino a quando la sezione cerebrale è completamente sopra l'interfaccia del buffer dell'aria.Continuare a ripetere questo processo fino a raggiungere la parte inferiore della diapositiva e tutte le sezioni sono montate sulla diapositiva. Per l'imaging, accendere lo scanner e il computer, quindi posizionare le diapositive nel supporto diapositive con il dispositivo di caricamento e inserire il supporto nello scanner. Aprire il software per lo scanner e scegliere la posizione di archiviazione e il profilo di scansione appropriati.Avviare la scansione di anteprima facendo clic sul pulsante Avvia scansione anteprima. Dopo la scansione, aprire la procedura guidata di rilevamento dei tessuti e cerchiare le regioni di interesse per l'imaging. Dopo aver scelto le regioni per l'imaging, fare clic sul pulsante Avvia scansione e attendere che la macchina termini la scansione.Controlla il file dei risultati ed esporta le immagini. Qui sono mostrate immagini rappresentative di immuno-istochimica a fluorescenza di sezioni cerebrali di topo coronale a Bregma-negativo di 0,82 millimetri, che mostrano la distribuzione di glicine floribunda agglutinina, arginina vasopressina e DAPI. I segnali di agglutinina del glicine floribunda si osservano nell'area perifornica dell'ipotalamo anteriore e del nucleo reticolare, mentre i segnali di arginina vasopressina sono osservati nel nucleo paraventricolare.Quando si prova questo protocollo per la prima volta, suggeriamo di eseguirlo sotto la supervisione di un ricercatore esperto. Il protocollo aiuterà a generare risultati istologici ottimali e coerenti tra diversi ricercatori e laboratori e servirà come riferimento per i principianti che imparano questa tecnica.

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