Name: free-floating immunostaining of mouse brains
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00
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調査官はNIH(K01DK119471からCWへの助成金)によって支えられました。P01DK113954、R01DK115761、R01DK117281、R01DK125480、R01DK120858からYX、USDA/CRIS(51000-064-01SからYX)、および米国心臓協会の博士研究員(LTX)829565

両性のC57BL/6Jマウス(8〜16週齢)を本研究で使用した。すべての動物のケアとすべての手順は、ベイラー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 灌流
注:ステップ 1.1-1.6 はヒュームフードで行われます。
<ol><li>麻酔<ol>
<li>5 mL のイオブルラン( 材料表参照)を、デシケータの底に置いたペーパータオ?...

<ol>
	<li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity.">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li><li>Apovian, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+definition,+comorbidities,+causes,+and+burden.">Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden.</a> The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).</li><li>Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. 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(162), e61622 (2020).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+potassium+current+in+AgRP/NPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism.">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li><li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice.">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li></ol>

このプロトコルは、灌流、組織切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳の神経解剖学的研究のための確立された方法を提供する。ただし、一貫性のある信頼性の高い結果を得るには、いくつかの重要な詳細を最適化する必要があります。
灌流の質は、染色を成功させるために重要です。血液細胞(例えば、赤血球)が人工的な「陽性」染色<sup clas...

肥満とそれに伴う併存疾患の有病率は流行レベルに達し、社会経済的負担が大きい1,2を引き起こしている。肥満の原因となる生物学的プロセスをより深く理解するために、様々なマウスモデルが開発されました3,4。これらの動物モデルにおけるエネルギー恒常性の調節には中心的なメカニズムが重要であるため、マウス脳の神経解剖学的研究はこの分野で必要な技術となっています。しかし、脳組織学の技術の品質、信頼性、再現性は、様々な理由(例えば、抗体、組織、治療、種、研究目的)のために、同じ研究室内の研究室や研究者によってかなり異なります。したがって、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、マウス脳の組織学的研究のための一般的なプロトコルを確立する必要があります。一方、初心者は、迅速に学び、マスターし、個々のニーズを満たすために、このプロトコルを調整することができます。
免疫組織化学的染色は、様々な組織(例えば、脳および末梢組織)における特定の細胞タイプ、mRNA、およびタンパク質を可視化するために広く使用されてきた確立された方法である5,6。より具体的には、目的の抗原は、酵素(例えば、発色性免疫組織化学)または蛍光色素(フルオレセイン等性菌化)6に結合した特異的一次抗体および対応する二次抗体によって標識することができる。これらの技術の有用性の一例として、β-エンドルフィン(プロアピオメラノコルチン(POMC)でコードされる1つのペプチド)およびc-fos(ニューロン活性のマーカー)を円弧核に染色した。トリプトファンヒドロキシラーゼ2(セロトニン合成に不可欠な酵素)の欠失は、アルクアテ核中のPOMCニューロンにおけるc-fos発現を減少させることが示された。また、ビタミンD受容体mRNAの分布を、その領域ハイブリダイゼーション(RNAscope)8でマウス脳内にマッピングした。本論文は、マウス脳の組織学的研究の質と再現性を向上させることを目的として、自由浮遊免疫染色のためのステップバイステップのワークフローを用いて、信頼性の高い効率的な方法を提示する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;30% Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302</td>
			<td>30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td>10%, 25 &#176;C, pH 6.8-7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sub-Q Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifading mounting media with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable plastic desiccator</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5315-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVP antibody</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals</td>
			<td>H-065-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoprotectant buffer</td>
			<td>User preference</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DFC310FX microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Boxes (50-place)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBT</td>
			<td>User preference</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion two automated Perfusion System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39471005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 20x</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRVE703-1L</td>
			<td>25 &#176;C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slideing Microtome Microm HM450</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Microm HM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>RICCA Chemical</td>
			<td>7220-32</td>
			<td>0.9%, 25 &#176;C, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Protein, DyLight 488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#21832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>089k01921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WFA antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L1516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Z1 Scanner</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen 3.1 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>scanner software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

free-floating immunostaining of mouse brains

マウス脳の免疫構造化学的染色は、エネルギー代謝やその他の神経生物学的プロセスの調節の基礎となる中心的なメカニズムを調査するために神経科学で一般的に使用される日常的な技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、実験室によって異なる場合があります。染色実験ごとに、種、組織、標的タンパク質、試薬の作業条件の違いに基づいて重要な手順を最適化する必要があります。本論文では、大動脈灌流、脳切除、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングなど、この分野の研究者が容易に追跡できる信頼性の高いワークフローを詳細に示す。
また、研究者の個々のニーズを満たすためにこれらの手順を変更する方法についても説明します。このプロトコルの信頼性と効率を説明するために、ペリニューロンネットは、マウス脳内の抗AVP抗体を有するビオチン標識藤フラルブダ凝集(WFA)およびアルギニンバソプレシン(AVP)で染色された。最後に、手順全体の重要な詳細が取り上げられており、このプロトコルの利点は他のプロトコルのそれと比較されます。本論文は、マウス脳組織の自由浮遊免疫染色に最適化されたプロトコルを提示する。このプロトコルに従うと、このプロセスは、ジュニアと上級の両方の科学者が免疫染色研究の品質、信頼性、および再現性を向上させることが容易になります。

このプロトコルのフローチャートを 図 1 に簡単に示します。この研究室の凍結切除手順は、5つの脳サンプルを同時に切り離した 図2Aで実証されています。脳部の取り付けは 図2Bに示され、脳部を備えた完全に取り付けられたスライドを 図2Cに示す。 図3において、ブレグマ-0.82mm?...

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Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

マウス脳の免疫-検査染色は、神経科学研究で一般的に使用される技術です。しかし、脳組織学の結果の質、信頼性、再現性は、研究者や研究室によって異なる場合があります。我々は、再現性、信頼性、および効率的であることが証明されたマウス脳の組織学的研究のための確立された方法論を提示する。手順を実証するのを助けることは、私の研究室の助教授であるチュンメイ・ワン博士で、8〜16週齢のC57ブラック/6Jマウスで麻酔に成功したことを確認した後、泡板にマウスを固定し、胸郭と腹部の上に正中線に沿って縦方向の表面的な切開を行い、皮膚を脇に移動して壁の筋肉を露出させます。次に、筋肉層を切開して肝臓と腸を露出させる。その後、はさみを使用して胸部を切って胸郭を開き、心臓と肺を露出します。止血鉗子を使用して、胸部を脇に引っ張って作業領域を広げます。次に。灌流カニューレを配置するには、鈍いカニューレで左心室を直接貫通し、慎重に上昇大根に挿入します。カニューレと結合チューブの接続体の周りにピンを置き、発流中にカニューレを所定の位置に固定し、右心房を切断して循環からの血液の流出を可能にします。生理食塩水を使用する場合は、生理食塩水スイッチをオンにし、40〜60ミリリットルの生理食塩水でマウスを心腔内に浸透させます。右心房からの流出と肝臓の色を注意深く観察します。次に、ホルマリンをパーフューズするには、生理食塩水圧力スイッチをオフにし、ホルマリン圧力スイッチをオンにして、マウスに10%中性緩衝ホルマリンの40ミリリットルを浸透させます。揺れの証拠のために動物の手足を観察してください。脳を隔離するには、はさみを使用して頭を取り除き、インテグメントに沿って中間線の切開を行い、頭蓋骨を露出させ、皮膚と筋肉の付着を切り取ります。次に、軌道尾根でカットを行い、虹彩はさみの鋭い端を奥のマグナムに入れる。頭蓋の内面に沿ってはさみを進め、脳の損傷を避けるために上圧を維持する。次に、頭頂部と前頭骨および髄膜を慎重に取り除き、開いた頭蓋骨から脳を取り除きます。スライディングミクロトームの高さ調整プレートの上にドライアイスを置き、白霜が見えるまで待ち、プレートの上に30%スクロースの5ミリリットルを慎重に広げ、スクロースが凍結した後に固体ベース層を形成する。次に、30%スクロースの500マイクロリットルを持つスクロースベースの上に水平にすべての脳サンプルを配置します。凍結の5〜10分後、脳が硬く白くなったら、目的の層または領域に達するまで脳をトリミングし、次に、トリムモードからフィードモードに切り替え、脳組織を切り離して25マイクロメートル厚い切片を生成する。次に、PBSで満たされた48ウェルプレートを準備し、1つのマウス脳に5つの井戸をマークします。ペイントブラシを使用して、1つのセクションを収集し、1つの井戸に配置し、同じマウスの後続のセクションを収集し、2番目の井戸に配置します。5番目のウェルに達するまで手順を繰り返し、第1~5ウェルにセクション6~10を配置します。PBSで満たされた6ウェルの細胞培養プレートの1つの井戸に細胞ストレーナーを入れ、絵筆を使用して、一連の脳切片を細胞ストレーナーに移します。シェーカー上のPBSで満たされた別のよく細胞ストレーナーに移すことによって、PBSでこれらのセクションをすすいだ。次に、細胞ストレーナーから1ミリリットルのビオチン標識WFAを含む1.5ミリリットルのチューブに脳切片を移し、一晩で50 RPMのロッキングプラットフォームでインキュベートする。翌日、先に示したようにPBSで脳切片をすすいでから、1ミリリットルのストレプトアビジン-デイライト488溶液を含むチューブに切片を移し、ロッキングプラットフォームで2時間インキュベートする。脳切片を再びPBSで洗い込んだ後、2時間ブロッキングバッファにインキュベートし、続いて一次抗体のインキュベーションを一晩揺るがすプラットフォームでインキュベートします。翌日、PBSリンスに続いて、二次抗体中の切片を2時間インキュベートする。PBSの100ミリリットルで2ペトリ料理を充填し、最初の料理に1ストレーナーからすべての脳セクションを転送します。尾部から鼻の方向に神経解剖学的順序で脳のセクションを整列させます.その後、1つのスライドをスタンドでわずかに傾けた2番目の皿に沈み、細かいペイントブラシを使用して、エアバッファインターフェイスのすぐ下に静かに脳セクションを傾けたスライドに置きます。次に、移管ピペットを使用して、ゆっくりと穏やかに緩やかにバッファを取り外し、脳部が空気緩衝インターフェースの上に完全に上がるまでそのレベルを下げる。スライドの下部に到達し、すべてのセクションがスライドに取り付けられるまで、この手順を繰り返します。イメージングの場合は、スキャナとコンピュータの電源を入れ、スライドをローディングデバイスでスライドホルダーに置き、ホルダーをスキャナーに挿入します。スキャナーのソフトウェアを開き、適切なストレージの場所とスキャンプロファイルを選択します。プレビュー スキャンを開始する] ボタンをクリックして、プレビュー スキャンを開始します。スキャン後、組織検出ウィザードを開き、イメージング用の対象領域を丸で囲みます。イメージングのリージョンを選択したら、[スキャンの開始]ボタンをクリックし、スキャンが完了するまで待ちます。結果ファイルを確認し、イメージをエクスポートします。ここに示されているのは、ブレグマ陰性0.82ミリメートルにおけるコロナマウス脳切片の代表的な蛍光免疫体化学画像であり、藤フロリブンダ・アググルチニン、アルギニン・バソプレシン、およびDAPIの分布を示す。藤のフロリバンダ・アググルチニンシグナルは、前視床下部および直巣核の骨膜領域で観察され、アルギニン・バソプレシンシグナルは、パラベンタリカル核で観察される。このプロトコルを初めて試す際には、経験豊富な研究者の監督のもとで実行することをお勧めします。このプロトコルは、異なる研究者や研究室の間で最適で一貫した組織学的結果を生成するのに役立ち、この技術を学ぶ初心者のための参考となるでしょう。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

共焦点光シート顕微鏡全体マウスの脳のミクロンスケールの分解能光トモ

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...