Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بعد موافقة لجنة استخدام معهد باستور ووزارة الزراعة الفرنسية رقم 2016-0022. يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء محرك السيارة لزراعة الأنسجة.
1. إعداد الكواشف والمواد اللازمة لزراعة المواد العضوية المعوية
<ol><li>لإعداد وسط زراعة النمو ، امزج DMEM / F-12...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

يوفر هذا العمل بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل سراديب الفئران الصولجان ، وزراعتها في عضويات 3D ، وتحليل ROS في المواد العضوية من خلال الجمع بين مسبار فلوروجيني حساس ل ROS مع تصوير مجهري نوعي للعضويات الكاملة وقياس ROS الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي على الخلايا المفردة بعد التفكك العضوي.
<p class="jov...

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. كما يمكن إنتاجها بنشاط بواسطة مجمعات إنزيمية متخصصة مثل NADPH-Oxidases المرتبط بالغشاء (NOX) و Dual Oxidases (DUOX) ، والتي تولد أنيون فائق الأكسيد وبيروكسيد الهيدروجين 1. من خلال التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة وكاسحات ROS ، يمكن للخلايا ضبط توازن الأكسدة والاختزال بدقة ، وبالتالي حماية توازن الأنسجة 2. على الرغم من أن ROS يمكن أن يكون شديد السمية للخلايا ويتلف الحمض النووي والبروتينات والدهون ، إلا أنها جزيئات إشارة حاسمة2. في الظهارة المعوية ، هناك حاجة إلى مستويات ROS معتدلة لانتشار الخلايا الجذعية والسلف 3 ؛ مستويات ROS العالية تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج 4. يرتبط الإجهاد التأكسدي المزمن بالعديد من أمراض الجهاز الهضمي ، مثل أمراض الأمعاء الالتهابية أو السرطان. على سبيل المثال ، في نموذج الفأر لسرطان الأمعاء الذي يحركه Wnt ، وجد أن إنتاج ROS المرتفع من خلال تنشيط NADPH-oxidases مطلوب لفرط انتشار الخلايا السرطانية5,6. إن تحديد كيفية إدارة الخلايا المعوية، وخاصة الخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية للإجهاد التأكسدي وكيف يمكن للبيئة الخلوية أن تؤثر على هذه القدرة أمر ضروري لفهم مسببات هذا المرض بشكل أفضل7.
في الأنسجة ، تقدم أنواع الخلايا المختلفة حالة أكسدة قاعدية قد تختلف وفقا لوظيفتها والتمثيل الغذائي والتعبير عن مستويات متفاوتة من جزيئات المؤكسدة ومضادات الأكسدة4,7. مراقبة ROS في الجسم الحي أمر صعب للغاية. تم تطوير أصباغ نفاذية للخلايا تنبعث منها التألق وفقا لحالة الأكسدة والاختزال الخاصة بها لتصور وقياس ROS الخلوي في الخلايا الحية والحيوانات. ومع ذلك، تعتمد فعاليتها على انتشارها داخل الأنسجة الحية وقراءتها السريعة، مما يجعل من الصعب استخدامها في النماذج الحيوانية8.
في الماضي ، تم إجراء دراسة تأثير المركبات على توليد ROS باستخدام خطوط الخلايا ، ولكن هذا قد لا يعكس الوضع في الجسم الحي . النموذج العضوي المعوي ، الذي طورته مجموعة Clevers9 ، يمكن من نمو الخلايا الأولية المعوية خارج الجسم الحي. تؤدي زراعة الخبايا المعوية في المصفوفات ، في وجود عوامل نمو محددة ، إلى هياكل ثلاثية الأبعاد ، تسمى المواد العضوية (الأمعاء الصغيرة) ، والتي تعيد إنتاج تنظيم الزغابات ، مع خلايا من سلالات ظهارية مختلفة تبطن تجويفا داخليا ، والخلايا الجذعية المعوية الموجودة في نتوءات صغيرة تشبه الخبايا.
هنا ، بالاستفادة من هذا النموذج ، يتم وصف طريقة بسيطة لدراسة الإجهاد التأكسدي في الخلايا المعوية الأولية بدقة خلية واحدة عن طريق إضافة صبغة حساسة ل ROS متاحة تجاريا إلى وسط الثقافة العضوية.
غالبا ما تستخدم قارئات اللوحات للكشف عن إنتاج ROS في إجمالي عدد السكان. يستخدم هذا البروتوكول قياس التدفق الخلوي أو فحص التصوير للكشف عن ROS في نوع معين من الخلايا مع خلايا معدلة وراثيا أو تلطيخ معين للأجسام المضادة. يتضمن هذا العمل زراعة الأعضاء المعوية للفئران وتصور ROS عن طريق التصوير البؤري والقياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي. باستخدام Lgr5-GFP من الفئران العضوية المعوية الصغيرة المشتقة ، من الممكن تحليل مستوى الإجهاد التأكسدي في الخلايا الجذعية المعوية على وجه التحديد بناء على علاجات مختلفة. يمكن تكييف هذا البروتوكول لاختبار تأثير الجزيئات الخارجية ، مثل موراميل ثنائي الببتيد المشتق من الميكروبات (MDP)10 ، على توازن ROS ، بعد تحفيز المواد العضوية مع المركبات المختارة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا أساسية في التوازن المعوي. ROS هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي للخلايا. يتم إنتاجها استجابة للعدوى أو الإصابة على مستوى الغشاء المخاطي لأنها تشارك في الاستجابات المضادة للميكروبات والتئام الجروح. كما أنها رسل ثانويون مهمون ، ينظمون العديد من المسارات ، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. من ناحية أخرى ، تؤدي مستويات ROS المفرطة إلى الإجهاد التأكسدي ، والذي يمكن أن يكون ضارا بالخلايا ويفضل الأمراض المعوية مثل الالتهاب المزمن أو السرطان. يوفر هذا العمل طريقة مباشرة للكشف عن ROS في عضويات الفئران المعوية عن طريق التصوير الحي وقياس التدفق الخلوي ، باستخدام مسبار فلوروجيني متاح تجاريا. هنا يصف البروتوكول فحص تأثير المركبات التي تعدل توازن الأكسدة والاختزال في المواد العضوية المعوية وتكشف عن مستويات ROS في أنواع محددة من الخلايا المعوية ، ويتضح هنا من خلال تحليل الخلايا الجذعية المعوية المصنفة وراثيا مع GFP. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع مجسات الفلورسنت الأخرى.

وكدليل على مفهوم البروتوكول الموصوف، استخدمت الخبايا التي تم الحصول عليها من خط الفأر Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 حيث تعرض الخلايا الجذعية المعوية تعبير GFP الفسيفسائي، الذي أنشأه باركر وآخرون، لتوصيف الخلايا الجذعية المعوية10 في البداية والسماح برسم خريطة لهذه الخلايا بناء على تعبيرها عن G...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

يصف هذا البروتوكول طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في عضويات الفئران المعوية باستخدام التصوير النوعي ومقايسات قياس الخلايا الكمية. يمكن توسيع هذا العمل ليشمل مجسات الفلورسنت الأخرى لاختبار تأثير المركبات المختارة على ROS.

تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

هذه الطريقة هي أداة قيمة في مجال البيولوجيا الخلوية لتقييم مستويات ROS الخلوية في الخلايا الأولية الحية المزروعة في المختبر كعضويات باستخدام مسبار فلوروجيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور ROS نوعيا في المواد العضوية المعوية السليمة عن طريق الفحص المجهري وتحليلها كميا في الخلايا المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحات 96-well. يمكن تطبيق هذه الطريقة على النماذج العضوية الأخرى ويمكن استخدام أجهزة استشعار الفلورسنت البديلة لتحليل المسارات الخلوية المختلفة.قبل تطبيق هذا البروتوكول لأول مرة ، يجب أن يصبح المجرب على دراية بالثقافة العضوية والمرور. على الرغم من أن بروتوكولنا يتكيف بشكل جيد مع أساليب الفحص ، إلا أنه يجب على المبتدئين البدء ببعض العينات. ستوضح الإجراء صوفي دولاوروي ، وهي مهندسة من المختبر.بعد التضحية بفأر Lgr5-GFP عمره 8 إلى 10 أسابيع ، اجمع خمسة إلى ثمانية سنتيمترات من الصائم الذي يشمل المنطقة الواقعة بين الاثني عشر والدقاق ، وضعه في DPBS بارد مكمل بالمضادات الحيوية على الجليد. بعد ذلك ، قم بتنظيف المحتوى المعوي عن طريق التنظيف باستخدام خمسة إلى 10 ملليلتر من DPBS البارد الذي يحتوي على مضادات حيوية. ثم باستخدام مقص طرف الكرة ، افتح الأمعاء طوليا ، وباستخدام الملقط ، انقل الأنسجة إلى طبق بتري يحتوي على DPBS البارد مع المضادات الحيوية.رج الأنسجة داخل الطبق لشطفه. بعد ذلك ، أمسك بالأمعاء عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور البلاستيكية وانقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من 10 ملليمولار بارد EDTA. اقلب الأنبوب ثلاث مرات واحتضنه على الثلج لمدة 10 دقائق.بعد الحضانة ، انقل الأنسجة في أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من DPBS والدوامة لمدة دقيقتين. أضف على الفور 10 ميكرولترات من الكسر في طبق بتري واستخدم المجهر لتقييم جودة الكسر. بعد عمليتي نقل في DPBS تحتوي على أنابيب مع دوامة لمدة دقيقتين بين كل عملية نقل ، احتضن الأمعاء في EDTA على الجليد لمدة خمس دقائق كما هو موضح سابقا.بعد ثلاث عمليات نقل متتالية في أنابيب تحتوي على DPBS مع دوامة لمدة ثلاث دقائق بين كل عملية نقل ، قم بدمج أفضل الكسور في أنبوب 50 ملليلتر عن طريق عكس الأنابيب المحددة ثلاث مرات والتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون. ثم قم بتدوير الخبايا ، وتخلص من supernatant وقم بتعطيل الكريات ميكانيكيا قبل إضافة خمسة ملليلترات من DMEM F12 البارد. احسب عدد الخبايا الموجودة في 10 ميكرولتر أليكوت يدويا تحت المجهر.بعد العد ، قم بتدوير الخبايا مرة أخرى وقم بإزالة supernatant بعناية. ثم قم بتعطيل الكريات ميكانيكيا وإضافة وسط ثقافة النمو إلى الأنبوب للحصول على تركيز 90 سكرابا لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف مجلدين من مصفوفة الغشاء السفلي غير المخفف أو BMM للحصول على تركيز نهائي من 30 سكرابا لكل ميكرولتر وماصة التعليق بعناية لأعلى ولأسفل دون إدخال فقاعات الهواء في المزيج.لتحليل قياس التدفق الخلوي ، تخلط لوحة 10 ميكرولتر من الخبايا BMM كقبة في وسط كل بئر من لوحة مستديرة سفلية 96 بئرا تم تسخينها مسبقا. وللتصوير ، قم بإيداع 10 ميكرولترات من المزيج كطبقة رقيقة في غرفة ميكروسلايد ذات ثمانية آبار تم تسخينها مسبقا. بعد السماح ل BMM بالتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ضع الألواح في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.بعد 15 دقيقة ، أضف 250 ميكرولتر من وسط النمو في كل بئر ، مع الحرص على عدم فصل BMM ، ووضع اللوحة في الحاضنة. لتصور الإجهاد التأكسدي بواسطة المجهر البؤري ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون n-acetylcysteine في الآبار المقابلة لغرفة الشريحة الدقيقة المكونة من ثمانية آبار المطلية بالمواد العضوية. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون هيدروبيروكسيد تيرت بوتيل في الآبار المقابلة واحتضنه لمدة 30 دقيقة أخرى.بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من تخفيف 1.25 ملليموليار للمسبار الفلوروجيني لكل بئر ، متبوعا بميكرولتر واحد من 1.25 ملليغرام لكل ملليلتر محلول Hoechst. بعد حضانة أخرى لمدة 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM وأضف بلطف 250 ميكرولتر من DMEM الدافئ دون أحمر الفينول. قم بتصوير المواد العضوية باستخدام مجهر بؤري مجهز بغرفة حرارية وإمدادات غاز تكتشف المسبار الفلوروجيني.باستخدام عنصر التحكم الإيجابي ، قم بإعداد شدة الليزر والتعرض للوقت لإشارة ROS ، وتحقق من أن هذه الإشارة أقل في عنصر التحكم السلبي. بعد ذلك ، باستخدام عدسة ، قم بفحص الشريحة لتحديد المواد العضوية التي تعبر عن GFP وضبط كثافة الليزر. قم بإعداد مكدس z من 25 ميكرومتر وتحديد المواضع للحصول على صورة مخيطة للعضوي بأكمله للحصول على قسم من المواد العضوية يظهر طبقة واحدة من الخلايا.أضف ميكرولتر واحد من محلول مخزون n-acetylcysteine في آبار التحكم السلبية في الصفيحة السفلية المستديرة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على المواد العضوية. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة ، أضف محلول مخزون هيدروبيروكسيد ثلاثي بوتيل ميكرولتر واحد في الآبار المقابلة واحتضنه لمدة 30 دقيقة. ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بإزالة الوسط دون إزعاج BMM المرفق ونقله إلى لوحة سفلية مستديرة أخرى ذات 96 بئرا.احتفظ بهذه اللوحة جانبا. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من التربسين وباستخدام ماصة متعددة القنوات ، ماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات لتدمير BMM. بعد حضانة قصيرة مدتها خمس دقائق ، قم بفصل المواد العضوية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مرة ثانية.قم بتدوير اللوحة وتخلص من السوبرناتانت عن طريق عكس اللوحة. أضف الوسط الذي تم جمعه سابقا في صفيحة أخرى من 96 بئرا مرة أخرى إلى الآبار المقابلة وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل خمس مرات. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من المسبار الفلوروجيني واحتضنه لمدة 30 دقيقة.ثم قم بتدوير اللوحة مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا باستخدام 250 ميكرولتر من محلول DAPI. انقل العينات في أنابيب قياس التدفق الخلوي واحتفظ بالأنابيب على الجليد. قم بتحسين إعدادات جهد التشتت الأمامي والجانبي على التحكم غير الملطخ والجهد الكهربي بالليزر لكل فلوروفور باستخدام عينات أحادية اللون.ثم باستخدام استراتيجية بوابة مناسبة ، قم بجمع ما لا يقل عن 20،000 حدث. أظهرت الصور التمثيلية متحدة البؤرة لتلطيخ ROS والمواد العضوية أنه في وجود مثبط NAC ، لا تظهر سوى الإشارة من الخلايا الميتة الموجودة في تجويف العضوي. في المواد العضوية غير المعالجة ، يمكن رؤية مستويات ROS القاعدية ، خاصة في الخلايا الإيجابية GFP ، مما يثبت أن الخلايا الجذعية تنتج ROS أعلى من الخلايا المتباينة.تقدم الخلايا الإيجابية GFP إشارة سيتوبلازمية أكثر أهمية مع المحفز في وجود المسبار الفلوروجيني ، مما يدل على أن مستويات ROS تزداد بشكل خاص في الخلايا الجذعية بعد العلاج. يظهر تحليل التدفق الخلوي لإنتاج ROS في المواد العضوية المعوية أن مستويات ROS القاعدية تنخفض بعد التحفيز باستخدام مثبط وتزداد بعد التحدي باستخدام المستحث. الخلايا المعالجة مسبقا مع مثبط ثم تحفيزها مع المحفز الحاضر مستويات أقل من تلك التي تم تحفيزها مع المحفز وحده.يظهر تحليل مماثل على الخلايا الجذعية المسورة كإيجابية GFP انخفاضا بمقدار 3.5 أضعاف في مستوى ROS عند العلاج المثبط وزيادة أربعة أضعاف عند العلاج المحث على الخلايا غير المحفزة. عند محاولة هذا الإجراء ، يجب على المستخدمين تذكر الحد من إجهاد الخلايا أثناء التلاعب العضوي والتفكك. بالإضافة إلى ذلك ، يجب دائما تضمين عناصر التحكم الإيجابية والسلبية عند تحليل ROS.بعد هذا الإجراء ، يمكن استكمال التحليل عن طريق تلطيخ التألق المناعي على المواد العضوية الثابتة السليمة ، وفرز الخلايا ، وتحليل التعبير الجيني للحصول على رؤى إضافية حول تنظيم ROS. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تعرف كيفية زراعة المواد العضوية المعوية الفئرانية ، وإجراء تحليل التصوير المباشر للعضويات السليمة ، ومعالجة الأعضاء المعوية لتحليل التدفق الخلوي.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

كشف، تصور وQuantitating الجيل من أنواع الاكسجين التفاعلية في النظام النموذجي الاميبا

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

الكشف في الوقت الحقيقي عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الاستجابة المناعية في الأرز باستخدام مقايسة التلألؤ الكيميائي

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...