Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af det franske nationale forskningsagenturs (ANR) bevilling 17-CE14-0022 (i-Stress).

Alle dyreforsøg blev udført efter godkendelse af Institut Pasteur Use Committee og af det franske landbrugsministerium nr. 2016-0022. Alle trin udføres inde i en vævskulturhætte.
1. Fremstilling af reagenser og materialer til dyrkning af tarmorganoider
<ol><li>For at forberede vækstkulturmedium blandes avanceret DMEM/F-12 suppleret med 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin (P/S)-opløsning, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murin EGF, 20 μg/ml murine Noggin 500 ng/ml mus R-Spondin1 (se ...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Dette arbejde giver en trinvis protokol til at isolere murine jejunal krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved at kombinere en ROS-følsom fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopi billeddannelse af hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjælp af flowcytometri på enkeltceller efter organoid dissociation.
Det første kritiske skridt i denne metode er krypter ekstraktion procedure. Faktisk er kvaliteten af kryptforberedelse nøglen til vellykket dannelse af ...

Reaktive iltarter (ROS) er naturlige biprodukter af cellulær metabolisme. De kan også produceres aktivt af specialiserede enzymatiske komplekser såsom de membranbundne NADPH-oxidaser (NOX) og dualoxidaser (DUOX), som genererer superoxidaniion og hydrogenperoxid1. Ved at udtrykke antioxidantenzymer og ROS-ådselædere kan cellerne finjustere deres redoxbalance og derved beskytte vævets homeostase2. Selvom ROS kan være meget giftigt for cellerne og beskadige DNA, proteiner og lipider, er de afgørende signalmolekyler2. I tarmepitelet kræves moderate ROS-niveauer til spredning af stam- og stamceller3; høje ROS-niveauer fører til deres apoptose4. Kronisk oxidativ stress er forbundet med mange gastrointestinale sygdomme, såsom inflammatoriske tarmsygdomme eller kræft. Som et eksempel, i en musemodel af Wnt-drevet tarmkræft, blev forhøjet ROS-produktion gennem aktivering af NADPH-oxidaser fundet at være nødvendig for kræftceller hyperproliferation5,6. Det er vigtigt at definere, hvordan tarmceller, især stamceller, håndterer oxidativ stress, og hvordan det cellulære miljø kan påvirke denne kapacitet, for bedre at forstå ætiologien af denne sygdom7.
I et væv præsenterer forskellige celletyper en basal oxidativ tilstand, der kan variere afhængigt af deres funktion og metabolisme og ekspressionen af forskellige niveauer af oxidant- og antioxidantmolekyler4,7. Overvågning af ROS in vivo er meget udfordrende. Cellegennemtrængelige farvestoffer, der udsender fluorescens i henhold til deres redoxtilstand, er udviklet til at visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Deres effektivitet afhænger dog af deres diffusion inde i levende væv og deres hurtige udlæsning, hvilket gør dem vanskelige at bruge i dyremodeller8.
Tidligere blev undersøgelsen af virkningen af forbindelser på ROS-generering udført ved hjælp af cellelinjer, men dette afspejler muligvis ikke in vivo-situationen . Tarmorganoidmodellen, udviklet af gruppen Clevers9, muliggør vækst af intestinale primære celler ex vivo. Kultur af tarmkrypter i matricer, i nærvær af definerede vækstfaktorer, fører til tredimensionelle strukturer, kaldet organoider (mini-tarm), som reproducerer krypt-villus-organisationen, med celler fra de forskellige epitelafstamninger, der forer et indre lumen, og tarmstamcellerne, der er bosiddende i små kryptlignende fremspring.
Her beskrives en simpel metode til at studere oxidativ stress i primære tarmceller ved enkeltcelleopløsningen ved at tilføje et kommercielt tilgængeligt ROS-følsomt farvestof til organoidkulturmediet.
Pladelæsere bruges ofte til at detektere ROS-produktion i en samlet befolkning. Denne protokol bruger flowcytometri eller billeddannelsesassay til at detektere ROS i en bestemt celletype med genetisk modificerede celler eller specifik antistoffarvning. Dette arbejde involverer musetarmorganoidkultur og ROS-visualisering ved konfokal billeddannelse og kvantificering ved flowcytometri. Ved hjælp af Lgr5-GFP-mus-afledte tyndtarmsorganoider er det muligt specifikt at analysere niveauet af oxidativt stress i tarmstamceller ved forskellige behandlinger. Denne protokol kan tilpasses til at teste indflydelsen af eksogene molekyler, såsom mikrobiota-afledt muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balancen efter stimulering af organoider med de udvalgte forbindelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Reaktive iltarter (ROS) spiller væsentlige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter af cellemetabolisme. De produceres som reaktion på infektion eller skade på slimhindeniveau, da de er involveret i antimikrobielle reaktioner og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, der regulerer flere veje, herunder cellevækst og differentiering. På den anden side fører overdrevne ROS-niveauer til oxidativ stress, som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsygdomme som kronisk betændelse eller kræft. Dette arbejde giver en ligetil metode til at detektere ROS i tarmmurinorganoiderne ved levende billeddannelse og flowcytometri ved hjælp af en kommercielt tilgængelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen af effekten af forbindelser, der modulerer redoxbalancen i tarmorganoider og detekterer ROS-niveauer i specifikke tarmcelletyper, her eksemplificeret ved analysen af tarmstamcellerne, der er genetisk mærket med GFP. Denne protokol kan anvendes sammen med andre fluorescerende sonder.

Som et bevis på konceptet for den beskrevne protokol blev krypterne opnået fra Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muselinjen anvendt, hvor intestinale stamceller viser mosaik GFP-ekspression, som blev etableret af Barker et al., for at karakterisere intestinale stamceller10 oprindeligt og tillade at kortlægge disse celler baseret på deres GFP-ekspression. Der tilvejebringes der derved en model til sammenligning af ROS-niveauer i en bestemt celletypepopulation ved forskellige behandlinger. En ROS-hæmmer (...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Den foreliggende protokol beskriver en metode til påvisning af reaktive iltarter (ROS) i tarmmurineorganoiderne ved hjælp af kvalitativ billeddannelse og kvantitative cytometriassays. Dette arbejde kan potentielt udvides til andre fluorescerende sonder for at teste effekten af udvalgte forbindelser på ROS.

Analyse af oxidativ stress i murintarmorganoider ved hjælp af reaktiv iltartsfølsom fluorogen sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Denne metode er et værdifuldt værktøj inden for cellulær biologi til vurdering af cellulære ROS-niveauer i levende primære celler dyrket in vitro som organoider ved hjælp af en fluorogen sonde. Den største fordel ved denne teknik er, at ROS kan visualiseres kvalitativt i intakte tarmorganoider ved mikroskopi og kvantitativt analyseres i dissocierede celler ved flowcytometri ved anvendelse af 96-brøndsplader. Denne metode kan anvendes på andre organoidmodeller, og alternative fluorescerende sensorer kan bruges til at analysere forskellige cellulære veje.Før denne protokol anvendes for første gang, skal eksperimentatoren blive fortrolig med organoidkulturen og passaging. Selvom vores protokol er velegnet til screeningsmetoder, bør begyndere starte med et par prøver. Sophie Dulauroy, en ingeniør fra laboratoriet, demonstrerer proceduren.Efter at have ofret en 8-til-10-ugers gammel Lgr5-GFP-mus, skal du samle fem til otte centimeter af jejunumet, der omfatter regionen mellem tolvfingertarmen og ileum, og placere den i kold DPBS suppleret med antibiotika på is. Rengør derefter tarmindholdet ved at skylle med fem til 10 ml kold DPBS indeholdende antibiotika. Brug derefter kuglespidssaks, åbn tarmen i længderetningen, og brug tang til at overføre vævet til en petriskål indeholdende kold DPBS med antibiotika.Ryst vævet inde i fadet for at skylle det. Tag derefter fat i tarmen ved aspiration ved hjælp af en plastpasteurpipette og overfør den til et 15 ml rør indeholdende 10 ml kold 10 millimolær EDTA. Omvendt røret tre gange og inkuber det på is i 10 minutter.Efter inkubationen overføres vævet i et rør indeholdende 10 ml DPBS og hvirvel i to minutter. Tilsæt straks 10 mikroliter af fraktionen i en petriskål og brug et mikroskop til at vurdere kvaliteten af fraktionen. Efter to overførsler i DPBS indeholdende rør med to minutters hvirvel mellem hver overførsel, inkuberes tarmen i EDTA på is i fem minutter som tidligere påvist.Efter tre på hinanden følgende overførsler i rør, der indeholder DPBS med tre minutters hvirvel mellem hver overførsel, kombineres de bedste fraktioner i et 50 ml rør ved at invertere de valgte rør tre gange og filtrere gennem en 70 mikron cellesil. Drej derefter krypterne, kassér supernatanten og forstyr pelleten mekanisk, før du tilføjer fem milliliter kold DMEM F12. Tæl antallet af krypter, der er til stede i en 10 mikroliter aliquot manuelt under et mikroskop.Efter tælling skal du dreje krypterne igen og forsigtigt fjerne supernatanten. Derefter forstyrre pelleten mekanisk og tilføje vækstkulturmedium til røret for at opnå en koncentration på 90 krypter pr. Mikroliter. Tilsæt derefter to volumener ufortyndet kældermembranmatrix eller BMM for at få en endelig koncentration på 30 krypter pr. Mikroliter og pipetter forsigtigt suspensionen op og ned uden at indføre luftbobler i blandingen.Til flowcytometrianalyse blandes plade 10 mikroliter af krypterne BMM som en kuppel i midten af hver brønd i en forvarmet rund bundplade med 96 brønde. Og til billeddannelse deponeres 10 mikroliter af blandingen som et tyndt lag i et forvarmet mikroskredskammer med otte brønde. Efter at BMM har ladet størkne ved stuetemperatur i fem minutter, anbringes pladerne i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Efter 15 minutter tilsættes 250 mikroliter vækstmedium i hver brønd, pas på ikke at løsne BMM og placere pladen i inkubatoren. For at visualisere oxidativ stress ved konfokal mikroskopi tilsættes en mikroliter n-acetylcystein-stamopløsning i de tilsvarende brønde i mikroslidkammeret med otte brønde belagt med organoider. Efter en times inkubation tilsættes en mikroliter tert-butylhydroperoxidopløsning i de tilsvarende brønde og inkuberes i yderligere 30 minutter.Derefter tilsættes en mikroliter af den 1,25 millimolære fortynding af den fluorogene sonde pr. Brønd efterfulgt af en mikroliter på 1,25 mg pr. Milliliter Hoechst-opløsning. Efter yderligere 30 minutters inkubation fjernes mediet uden at forstyrre BMM'en, og der tilsættes forsigtigt 250 mikroliter varmt DMEM uden phenolrødt. Forestil dig organoiderne ved hjælp af et konfokalmikroskop udstyret med et termisk kammer og gasforsyning, der detekterer den fluorogene sonde.Brug den positive kontrol til at indstille laserintensiteten og tidseksponeringen for ROS-signalet og kontrollere, at dette signal er lavere i den negative kontrol. Brug derefter et okular til at screene diaset for at identificere de organoider, der udtrykker GFP, og justere laserintensiteten. Opret en z-stak på 25 mikrometer og definer positioner for at opnå et syet billede af hele organoidet for at få en del af organoiderne, der viser et lag af celler.Tilsæt en mikroliter af n-acetylcystein-stamopløsningen i de negative kontrolbrønde på den 96-brønds runde bundplade, der indeholder organoiderne. Efter en times inkubation tilsættes en mikroliter tert-butylhydroperoxid-stamopløsning i de tilsvarende brønde og inkuberes i 30 minutter. Brug derefter en flerkanalspipette til at fjerne mediet uden at forstyrre den vedhæftede BMM og overføre den til en anden 96-brønds rund bundplade.Hold denne plade til side. Derefter tilsættes 100 mikroliter trypsin og ved hjælp af en flerkanals pipette, pipette op og ned fem gange for at ødelægge BMM. Efter en kort fem minutters inkubation dissocieres organoiderne ved at pibere op og ned en anden gang.Drej pladen og kassér supernatanten ved at vende pladen om. Tilsæt mediet, der tidligere er opsamlet i en anden 96-brønds plade, tilbage i de tilsvarende brønde, og genophæv cellerne ved at pipettere op og ned fem gange. Derefter tilsættes en mikroliter af den fluorogene sonde og inkuberes i 30 minutter.Drej derefter pladen igen og resuspend cellerne med 250 mikroliter DAPI-opløsning. Overfør prøverne i flowcytometrirør og opbevar rørene på is. Optimer indstillingerne for spredningsspænding fremad og på siden på ikke-tilbageholdte kontrol- og laserspændinger for hver fluorofor ved hjælp af monoplettede prøver.Brug derefter en passende gating-strategi til at indsamle mindst 20.000 begivenheder. Repræsentative konfokale billeder af ROS-farvning og organoider viste, at i nærvær af NAC-hæmmeren er kun signalet fra de døde celler indeholdt i organoidens lumen synligt. I den ikke-behandlede organoid kan de basale ROS-niveauer ses, især i GFP-positive celler, hvilket beviser, at stamceller producerer højere ROS end differentierede celler.GFP-positive celler præsenterer et mere signifikant cytoplasmatisk signal med induktoren i nærvær af den fluorogene sonde, hvilket viser, at ROS-niveauerne stiger især i stamceller efter behandling. Flowcytometrianalyse af ROS-produktion i tarmorganoiderne viser, at basale ROS-niveauer falder efter stimulering med inhibitor og øges efter udfordring med inducer. Celler, der er forbehandlet med inhibitor og derefter stimuleret med induktor, har lavere niveauer end dem, der stimuleres med inducer alene.En lignende analyse af stamceller gated som GFP-positive viser et 3,5 gange fald i ROS-niveauet ved inhibitorbehandling og en firedobling ved inducerbehandling i forhold til ikke-stimulerede celler. Når man forsøger denne procedure, skal brugerne huske at begrænse cellestress under organoid manipulation og dissociation. Derudover bør positive og negative kontroller altid medtages, når ROS analyseres.Efter denne procedure kan analysen suppleres med immunofluorescensfarvning på faste intakte organoider, cellesortering og genekspressionsanalyse for at få yderligere indsigt i ROS-regulering. Efter at have set denne video skal du vide, hvordan man dyrker murine intestinale organoider, udfører levende billeddannelsesanalyse af intakte organoider og behandler tarmorganer til flowcytometrianalyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Afsløring, visualisere og kvantificering af generation af reaktive ilt arter i en amøbe Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokol for Lentiviral transduktion og nedstrøms analyse af Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Måling oxidativ stress Modstand af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brønds mikrotiterplader

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet assay som et indirekte mål for Systemisk oxidativt stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Dyrkning af organoider fra Intestinal Villi Epithelium under dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse af E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Realtidspåvisning af produktion af reaktive iltarter i immunrespons i ris med et kemiluminescensassay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrkning af organoider fra murinale krypter og en enkelt stamcelle til organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Undersøgelse af epitelvirkningerne af tarmbetændelse in vitro på etablerede murinkolonoider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...