Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de subsidie 17-CE14-0022 (i-Stress) van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR).

Alle dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring door het Institut Pasteur Use Committee en door het Franse ministerie van Landbouw nr. 2016-0022. Alle stappen worden uitgevoerd in een weefselkweekkap.
1. Bereiding van reagentia en materialen voor het kweken van intestinale organoïden
<ol><li>Om groeikweekmedium te bereiden, meng geavanceerde DMEM / F-12 aangevuld met 1x glutamine, 1x penicilline / streptomycine (P / S) -oplossing, 10 mM HEPES, 50 ng / ml murine EGF, 20 μg / ml murine Nog...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Dit werk biedt een stapsgewijs protocol om murine jejunale crypten te isoleren, ze te kweken tot 3D-organoïden en ROS in organoïden te analyseren door een ROS-gevoelige fluorogene sonde te combineren met kwalitatieve microscopiebeeldvorming van hele organoïden en kwantitatieve ROS-meting met behulp van flowcytometrie op afzonderlijke cellen na organoïde dissociatie.
De eerste kritieke stap in deze methode is de extractieprocedure voor crypten. Inderdaad, de kwaliteit van de voorbereiding v...

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn natuurlijke bijproducten van cellulair metabolisme. Ze kunnen ook actief worden geproduceerd door gespecialiseerde enzymatische complexen zoals de membraangebonden NADPH-Oxidasen (NOX) en Dual Oxidases (DUOX), die superoxide-anion en waterstofperoxide genereren1. Door antioxiderende enzymen en ROS-aaseters tot expressie te brengen, kunnen cellen hun redoxbalans fijn afstemmen, waardoor weefselhomeostase wordt beschermd2. Hoewel ROS zeer giftig kan zijn voor de cellen en DNA, eiwitten en lipiden kan beschadigen, zijn het cruciale signaalmoleculen2. In het darmepitheel zijn matige ROS-niveaus vereist voor stam- en voorlopercelproliferatie3; hoge ROS-waarden leiden tot hun apoptose4. Chronische oxidatieve stress is gekoppeld aan veel gastro-intestinale ziekten, zoals inflammatoire darmziekten of kanker. In een muismodel van Wnt-gedreven darmkanker bleek bijvoorbeeld een verhoogde ROS-productie door activering van NADPH-oxidasen nodig te zijn voor hyperproliferatie van kankercellen5,6. Definiëren hoe darmcellen, in het bijzonder stamcellen, stamcellen omgaan met oxidatieve stress en hoe de cellulaire omgeving deze capaciteit kan beïnvloeden, is essentieel om de etiologie van deze ziekte beter te begrijpen7.
In een weefsel vertonen verschillende celtypen een basale oxidatieve toestand die kan variëren afhankelijk van hun functie en metabolisme en de expressie van verschillende niveaus van oxidant- en antioxidantmoleculen4,7. Het monitoren van ROS in vivo is een grote uitdaging. Celdoorlatende kleurstoffen die fluorescentie uitzenden volgens hun redoxtoestand zijn ontwikkeld om cellulaire ROS in levende cellen en dieren te visualiseren en te meten. Hun werkzaamheid hangt echter af van hun diffusie in levende weefsels en hun snelle uitlezing, waardoor ze moeilijk te gebruiken zijn in diermodellen8.
In het verleden werd de studie van het effect van verbindingen op ROS-generatie gedaan met behulp van cellijnen, maar dit weerspiegelt mogelijk niet de in vivo situatie. Het intestinale organoïde model, ontwikkeld door de groep van Clevers9, maakt de groei van intestinale primaire cellen ex vivo mogelijk. Cultuur van intestinale crypten in matrices, in aanwezigheid van gedefinieerde groeifactoren, leidt tot driedimensionale structuren, organoïden (mini-darm) genoemd, die de crypt-villus-organisatie reproduceren, met cellen uit de verschillende epitheliale afstammingslijnen die een intern lumen bekleden, en de darmstamcellen die zich in kleine crypten-achtige uitsteeksels bevinden.
Hier wordt, gebruikmakend van dit model, een eenvoudige methode beschreven om oxidatieve stress in primaire darmcellen met de eencellige resolutie te bestuderen door een commercieel beschikbare ROS-gevoelige kleurstof toe te voegen aan het organoïde kweekmedium.
Plaatlezers worden vaak gebruikt om ROS-productie in een totale populatie te detecteren. Dit protocol maakt gebruik van flowcytometrie of imaging assay om ROS te detecteren in een bepaald celtype met genetisch gemodificeerde cellen of specifieke antilichaamkleuring. Dit werk omvat intestinale organoïde cultuur van muizen en ROS-visualisatie door confocale beeldvorming en kwantificering door flowcytometrie. Met behulp van Lgr5-GFP muizen-afgeleide dunne darm organoïden, is het mogelijk om specifiek het niveau van oxidatieve stress in intestinale stamcellen te analyseren op verschillende behandelingen. Dit protocol kan worden aangepast om de invloed van exogene moleculen, zoals microbiota-afgeleid muramyl-dipeptide (MDP)10, op de ROS-balans te testen, na het stimuleren van organoïden met de geselecteerde verbindingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een essentiële rol in intestinale homeostase. ROS zijn natuurlijke bijproducten van het celmetabolisme. Ze worden geproduceerd als reactie op infectie of letsel op mucosaal niveau omdat ze betrokken zijn bij antimicrobiële reacties en wondgenezing. Ze zijn ook kritische secundaire boodschappers, die verschillende routes reguleren, waaronder celgroei en differentiatie. Aan de andere kant leiden overmatige ROS-niveaus tot oxidatieve stress, wat schadelijk kan zijn voor cellen en darmziekten zoals chronische ontsteking of kanker kan bevorderen. Dit werk biedt een eenvoudige methode om ROS in de intestinale muriene organoïden te detecteren door middel van live beeldvorming en flowcytometrie, met behulp van een commercieel verkrijgbare fluorogene sonde. Hier beschrijft het protocol het testen van het effect van verbindingen die de redoxbalans in intestinale organoïden moduleren en ROS-niveaus detecteren in specifieke darmceltypen, hier geïllustreerd door de analyse van de darmstamcellen genetisch gelabeld met GFP. Dit protocol kan worden gebruikt met andere fluorescerende sondes.

Als een proof of concept van het beschreven protocol werden de crypten verkregen uit de Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muislijn gebruikt waarin intestinale stamcellen mozaïek GFP-expressie vertonen, die werd vastgesteld door Barker et al., om darmstamcellen10 in eerste instantie te karakteriseren en deze cellen in kaart te brengen op basis van hun GFP-expressie. Daarbij wordt een model geleverd om ROS-niveaus in een specifieke celtypepopulatie te vergelijken op verschillende behandelingen. Een ROS-remmer...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Deze methode is een waardevol hulpmiddel op het gebied van cellulaire biologie voor het beoordelen van cellulaire ROS-niveaus in levende primaire cellen die in vitro zijn gekweekt als organoïden met behulp van een fluorogene sonde. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat ROS kwalitatief kan worden gevisualiseerd in intacte darmorganoïden door microscopie en kwantitatief geanalyseerd in gedissocieerde cellen door flowcytometrie met behulp van 96-well platen. Deze methode kan worden toegepast op andere organoïde modellen en alternatieve fluorescerende sensoren kunnen worden gebruikt om verschillende cellulaire routes te analyseren.Voordat dit protocol voor de eerste keer wordt toegepast, moet de experimentator vertrouwd raken met de organoïde cultuur en passaging. Hoewel ons protocol goed is aangepast aan screeningsbenaderingen, moeten beginners beginnen met een paar voorbeelden. Sophie Dulauroy, een ingenieur van het laboratorium, demonstreert de procedure.Na het offeren van een 8 tot 10 weken oude Lgr5-GFP-muis, verzamel je vijf tot acht centimeter van het jejunum-omvattende gebied tussen de twaalfvingerige darm en het ileum en plaats je het in koude DPBS aangevuld met antibiotica op ijs. Reinig vervolgens het darmgehalte door te spoelen met vijf tot 10 milliliter koude DPBS met antibiotica. Gebruik vervolgens een kogelpuntschaar, open de darm in de lengterichting en breng met een tang het weefsel over in een petrischaal met koude DPBS met antibiotica.Schud het weefsel in de schaal om het af te spoelen. Pak vervolgens de darm door aspiratie met behulp van een plastic Pasteur-pipet en breng deze over in een buis van 15 milliliter met 10 milliliter koude 10 millimolar EDTA. Keer de buis drie keer om en incubeer deze gedurende 10 minuten op ijs.Breng na de incubatie het weefsel gedurende twee minuten over in een buis met 10 milliliter DPBS en vortex. Voeg onmiddellijk 10 microliter van de fractie toe in een petrischaaltje en gebruik een microscoop om de kwaliteit van de fractie te beoordelen. Na twee overdrachten in DPBS-bevattende buizen met twee minuten vortexing tussen elke overdracht, incubeer de darm in EDTA op ijs gedurende vijf minuten zoals eerder aangetoond.Na drie opeenvolgende overdrachten in buizen die DPBS bevatten met drie minuten vortexing tussen elke overdracht, combineert u de beste fracties in een buis van 50 milliliter door de geselecteerde buizen drie keer om te keren en door een celzeef van 70 micron te filteren. Draai vervolgens de crypten, gooi het supernatant weg en verstoor de pellet mechanisch voordat je vijf milliliter koude DMEM F12 toevoegt. Tel het aantal crypten dat aanwezig is in een aliquot van 10 microliter handmatig onder een microscoop.Draai na het tellen de crypten opnieuw en verwijder voorzichtig het supernatant. Verstoor vervolgens mechanisch de pellet en voeg groeicultuurmedium toe aan de buis om een concentratie van 90 crypten per microliter te verkrijgen. Voeg vervolgens twee volumes onverdunde keldermembraanmatrix of BMM toe om een uiteindelijke concentratie van 30 crypten per microliter te krijgen en pipetteer de suspensie voorzichtig op en neer zonder luchtbellen in de mix te introduceren.Voor flowcytometrie-analyse mengt plaat 10 microliter van de crypten BMM als een koepel in het midden van elke put van een voorverwarmde ronde bodemplaat met 96 putten. En voor beeldvorming, deponeer 10 microliter van het mengsel als een dunne laag in een voorverwarmde microslide acht-well kamer. Nadat u de BMM vijf minuten bij kamertemperatuur hebt laten stollen, plaatst u de platen in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Voeg na 15 minuten 250 microliter groeimedium toe aan elke put, zorg ervoor dat u de BMM niet losmaakt en plaats de plaat in de incubator. Om oxidatieve stress te visualiseren door confocale microscopie, voegt u één microliter n-acetylcysteïne-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten van de microslide acht-putkamer verguld met organoïden. Voeg na een incubatie van een uur een microliter tert-butylhydroperoxide-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten en incubeer nog eens 30 minuten.Voeg vervolgens één microliter van de 1,25 millimolaire verdunning van de fluorogene sonde per put toe, gevolgd door één microliter van 1,25 milligram per milliliter Hoechst-oplossing. Verwijder na nog eens 30 minuten incubatie het medium zonder de BMM te verstoren en voeg voorzichtig 250 microliter warme DMEM toe zonder fenolrood. Stel de organoïden voor met behulp van een confocale microscoop uitgerust met een thermische kamer en gastoevoer die de fluorogene sonde detecteert.Stel met behulp van de positieve regeling de laserintensiteit en tijdblootstelling voor het ROS-signaal in en controleer of dit signaal lager is in de negatieve regeling. Scherm vervolgens met behulp van een oculair de dia om de organoïden te identificeren die GFP uitdrukken en pas de laserintensiteit aan. Stel een z-stack van 25 micrometer in en definieer posities om een gestikt beeld van de hele organoïde te verkrijgen om een deel van de organoïden te krijgen dat één laag cellen toont.Voeg een microliter van de n-acetylcysteïne stockoplossing toe in de negatieve controleputten van de 96-putjes ronde bodemplaat met de organoïden. Voeg na een incubatie van een uur een microliter tert-butylhydroperoxide stockoplossing toe in de overeenkomstige putten en incubeer gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens met een meerkanaalspipet het medium zonder de aangesloten BMM te storen en breng het over op een andere 96-well ronde bodemplaat.Houd dit bord apart. Voeg vervolgens 100 microliter trypsine toe en pipetteer vijf keer op en neer met behulp van een meerkanaalspipet om de BMM te vernietigen. Dissociëer na een korte incubatie van vijf minuten de organoïden door een tweede keer op en neer te pipetteren.Draai de plaat en gooi het bovennatuurlijke weg door de plaat om te keren. Voeg het medium dat eerder in een andere 96-putplaat was verzameld, terug in de overeenkomstige putten en resuspend de cellen door vijf keer op en neer te pipetteren. Voeg vervolgens een microliter van de fluorogene sonde toe en incubeer gedurende 30 minuten.Draai vervolgens de plaat opnieuw en resuspend de cellen met 250 microliter DAPI-oplossing. Breng de monsters over in flowcytometriebuizen en houd de buizen op ijs. Optimaliseer de instellingen voor voorwaartse en zijdelingse verstrooiingsspanningen op onbevlekte besturings- en laserspanningen voor elke fluorofoor met behulp van monostained monsters.Verzamel vervolgens met behulp van een geschikte gating-strategie minimaal 20.000 evenementen. Representatieve confocale beelden van ROS-kleuring en organoïden toonden aan dat in aanwezigheid van de NAC-remmer alleen het signaal van de dode cellen in het lumen van de organoïde zichtbaar is. In de niet-behandelde organoïde kunnen de basale ROS-niveaus worden gezien, met name in GFP-positieve cellen, wat bewijst dat stamcellen hogere ROS produceren dan gedifferentieerde cellen.GFP-positieve cellen presenteren een significanter cytoplasmatisch signaal met de inductor in aanwezigheid van de fluorogene sonde, wat aantoont dat ros-niveaus toenemen, vooral in stamcellen na behandeling. Flowcytometrie-analyse van ROS-productie in de intestinale organoïden toont aan dat basale ROS-niveaus afnemen na stimulatie met remmer en toenemen na uitdaging met inductor. Cellen voorbehandeld met remmer en vervolgens gestimuleerd met inductor vertonen lagere niveaus dan die gestimuleerd met inductor alleen.Een vergelijkbare analyse van stamcellen die als GFP-positief zijn afgesloten, toont een 3,5-voudige afname van het ROS-niveau bij behandeling met remmers en een viervoudige toename bij inductorbehandeling ten opzichte van niet-gestimuleerde cellen. Bij het proberen van deze procedure moeten gebruikers eraan denken om celstress te beperken tijdens organoïde manipulatie en dissociatie. Bovendien moeten positieve en negatieve controles altijd worden opgenomen bij het analyseren van ROS.Na deze procedure kan de analyse worden aangevuld met immunofluorescentiekleuring op vaste intacte organoïden, celsortering en genexpressieanalyse om aanvullende inzichten te krijgen in ROS-regulatie. Na het bekijken van deze video, moet u weten hoe u muriene intestinale organoïden kunt laten groeien, live beeldvormingsanalyse van intacte organoïden kunt uitvoeren en darmorganen kunt verwerken voor flowcytometrie-analyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse van oxidatieve stress in zebravis embryo&#39;s

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-kweek van organoïden uit het intestinale villi-epitheel dat dedifferentiatie ondergaat

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

De 3D-kweek van organoïden uit murine darmcrypten en een enkele stamcel voor organoïde onderzoek

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...