Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
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Ce travail a été soutenu par Français subvention 17-CE14-0022 (i-Stress) de l’Agence nationale de la recherche (ANR).

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées après approbation par le Comité d’Utilisation de l’Institut Pasteur et par le Ministère de l’Agriculture Français n° 2016-0022. Toutes les étapes sont effectuées à l’intérieur d’une hotte de culture tissulaire.
1. Préparation de réactifs et de matériaux pour la culture d’organoïdes intestinaux
<ol><li>Pour préparer le milieu de culture de croissance, mélanger le DMEM/F-12 avancé complété par 1x glutamin...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Ce travail fournit un protocole étape par étape pour isoler les cryptes jéjunales murines, les cultiver en organoïdes 3D et analyser les ROS dans les organoïdes en combinant une sonde fluorogénique sensible aux ROS avec une imagerie microscopique qualitative des organoïdes entiers et une mesure quantitative des ROS en utilisant la cytométrie en flux sur des cellules individuelles après la dissociation organoïde.
La première étape critique de cette méthode est la procédure d’ext...

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils peuvent également être produits activement par des complexes enzymatiques spécialisés tels que les NADPH-oxydases (NOX) et les oxydases doubles (DUOX) liées à la membrane, qui génèrent des anions superoxydes et du peroxyde d’hydrogène1. En exprimant des enzymes antioxydantes et des piégeurs de ROS, les cellules peuvent ajuster finement leur équilibre redox, protégeant ainsi l’homéostasie tissulaire2. Bien que les ROS puissent être très toxiques pour les cellules et endommager l’ADN, les protéines et les lipides, ce sont des molécules de signalisation cruciales2. Dans l’épithélium intestinal, des taux modérés de ROS sont nécessaires pour la prolifération des cellules souches et progénitrices3; des niveaux élevés de ROS conduisent à leur apoptose4. Le stress oxydatif chronique est lié à de nombreuses maladies gastro-intestinales, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin ou le cancer. À titre d’exemple, dans un modèle murin de cancer intestinal induit par Wnt, une production élevée de ROS par activation des NADPH-oxydases s’est avérée nécessaire pour l’hyperprolifération des cellules cancéreuses5,6. Définir comment les cellules intestinales, en particulier les cellules souches, les cellules souches gèrent le stress oxydatif et comment l’environnement cellulaire peut avoir un impact sur cette capacité est essentiel pour mieux comprendre l’étiologie de cette maladie7.
Dans un tissu, différents types de cellules présentent un état oxydatif basal qui peut varier en fonction de leur fonction et de leur métabolisme et de l’expression de différents niveaux de molécules oxydantes et antioxydantes4,7. La surveillance des ROS in vivo est très difficile. Des colorants perméables cellulaires qui émettent de la fluorescence en fonction de leur état redox ont été développés pour visualiser et mesurer les ROS cellulaires dans les cellules vivantes et les animaux. Cependant, leur efficacité dépend de leur diffusion à l’intérieur des tissus vivants et de leur lecture rapide, ce qui les rend difficiles à utiliser dans les modèles animaux8.
Dans le passé, l’étude de l’effet des composés sur la génération de ROS a été réalisée à l’aide de lignées cellulaires, mais cela peut ne pas refléter la situation in vivo . Le modèle organoïde intestinal, développé par le groupe clevers9, permet la croissance des cellules primaires intestinales ex vivo. La culture de cryptes intestinales dans des matrices, en présence de facteurs de croissance définis, conduit à des structures tridimensionnelles, appelées organoïdes (mini-intestin), qui reproduisent l’organisation crypte-villosité, avec des cellules des différentes lignées épithéliales tapissant une lumière interne, et les cellules souches intestinales résidant dans de petites protubérances ressemblant à des cryptes.
Ici, en tirant parti de ce modèle, une méthode simple est décrite pour étudier le stress oxydatif dans les cellules intestinales primaires à la résolution unicellulaire en ajoutant un colorant sensible aux ROS disponible dans le commerce dans le milieu de culture organoïde.
Les lecteurs de plaques sont souvent utilisés pour détecter la production de ROS dans une population totale. Ce protocole utilise la cytométrie en flux ou le test d’imagerie pour détecter les ROS dans un type cellulaire particulier avec des cellules génétiquement modifiées ou une coloration d’anticorps spécifique. Ce travail implique la culture d’organoïdes intestinaux de souris et la visualisation des ROS par imagerie confocale et quantification par cytométrie en flux. En utilisant des organoïdes de l’intestin grêle dérivés de souris Lgr5-GFP, il est possible d’analyser spécifiquement le niveau de stress oxydatif dans les cellules souches intestinales lors de différents traitements. Ce protocole peut être adapté pour tester l’influence de molécules exogènes, telles que le muramyl-dipeptide (MDP)10 dérivé du microbiote, sur l’équilibre ROS, après avoir stimulé les organoïdes avec les composés sélectionnés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie intestinale. Les ROS sont des sous-produits naturels du métabolisme cellulaire. Ils sont produits en réponse à une infection ou à une blessure au niveau de la muqueuse car ils sont impliqués dans les réponses antimicrobiennes et la cicatrisation des plaies. Ils sont également des messagers secondaires essentiels, régulant plusieurs voies, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. D’autre part, des niveaux excessifs de ROS conduisent à un stress oxydatif, qui peut être délétère pour les cellules et favoriser les maladies intestinales comme l’inflammation chronique ou le cancer. Ce travail fournit une méthode simple pour détecter les ROS dans les organoïdes murins intestinaux par imagerie en direct et cytométrie en flux, à l’aide d’une sonde fluorogénique disponible dans le commerce. Ici, le protocole décrit le dosage de l’effet des composés qui modulent l’équilibre redox dans les organoïdes intestinaux et détectent les niveaux de ROS dans des types de cellules intestinales spécifiques, illustré ici par l’analyse des cellules souches intestinales génétiquement marquées avec GFP. Ce protocole peut être utilisé avec d’autres sondes fluorescentes.

Comme preuve de concept du protocole décrit, les cryptes obtenues à partir de la lignée de souris Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 ont été utilisées dans lesquelles les cellules souches intestinales présentent une expression mosaïque de GFP, qui a été établie par Barker et al., pour caractériser initialement les cellules souches intestinales10 et permettre de cartographier ces cellules en fonction de leur expression GFP. Un modèle est ainsi fourni pour comparer les niveaux de ROS dans une popul...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Le présent protocole décrit une méthode de détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les organoïdes murins intestinaux à l’aide d’une imagerie qualitative et de tests de cytométrie quantitative. Ce travail peut être potentiellement étendu à d’autres sondes fluorescentes pour tester l’effet de composés sélectionnés sur les ROS.

Analyse du stress oxydatif dans les organoïdes intestinaux murins à l’aide d’une sonde fluorogénique sensible aux espèces réactives de l’oxygène

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Cette méthode est un outil précieux dans le domaine de la biologie cellulaire pour évaluer les niveaux de ROS cellulaires dans les cellules primaires vivantes cultivées in vitro en tant qu’organoïdes à l’aide d’une sonde fluorogénique. Le principal avantage de cette technique est que les ROS peuvent être visualisées qualitativement dans des organoïdes intestinaux intacts par microscopie et analysées quantitativement dans des cellules dissociées par cytométrie en flux à l’aide de plaques de 96 puits. Cette méthode peut être appliquée à d’autres modèles organoïdes et d’autres capteurs fluorescents peuvent être utilisés pour analyser différentes voies cellulaires.Avant d’appliquer ce protocole pour la première fois, l’expérimentateur doit se familiariser avec la culture organoïde et le passage. Bien que notre protocole soit bien adapté aux approches de dépistage, les débutants devraient commencer par quelques échantillons. Sophie Dulauroy, une ingénieure du laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Après avoir sacrifié une souris Lgr5-GFP âgée de 8 à 10 semaines, collectez cinq à huit centimètres du jéjunum englobant la région située entre le duodénum et l’iléon, et placez-la dans du DPBS froid complété par des antibiotiques sur la glace. Ensuite, nettoyez le contenu intestinal en rinçant avec cinq à 10 millilitres de DPBS froid contenant des antibiotiques. Ensuite, à l’aide de ciseaux à pointe de bille, ouvrez l’intestin longitudinalement et, à l’aide de pinces, transférez le tissu dans une boîte de Petri contenant du DPBS froid avec des antibiotiques.Secouez le tissu à l’intérieur du plat pour le rincer. Ensuite, attrapez l’intestin par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique et transférez-le dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres d’EDTA froid de 10 millimolaires. Inverser le tube trois fois et l’incuber sur de la glace pendant 10 minutes.Après l’incubation, transférer le tissu dans un tube contenant 10 millilitres de DPBS et de vortex pendant deux minutes. Ajoutez immédiatement 10 microlitres de la fraction dans une boîte de Pétri et utilisez un microscope pour évaluer la qualité de la fraction. Après deux transferts dans des tubes contenant du DPBS avec un vortex de deux minutes entre chaque transfert, incuber l’intestin dans de l’EDTA sur de la glace pendant cinq minutes, comme démontré précédemment.Après trois transferts successifs dans des tubes contenant du DPBS avec un vortex de trois minutes entre chaque transfert, combinez les meilleures fractions dans un tube de 50 millilitres en inversant les tubes sélectionnés trois fois et en filtrant à travers une passoire cellulaire de 70 microns. Ensuite, faites tourner les cryptes, jetez le surnageant et perturbez mécaniquement la pastille avant d’ajouter cinq millilitres de DMEM F12 froid. Comptez manuellement le nombre de cryptes présentes dans une aliquote de 10 microlitres au microscope.Après avoir compté, faites tourner à nouveau les cryptes et retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, perturbez mécaniquement la pastille et ajoutez un milieu de culture de croissance au tube pour obtenir une concentration de 90 cryptes par microlitre. Ensuite, ajoutez deux volumes de matrice de membrane basale non diluée ou BMM pour obtenir une concentration finale de 30 cryptes par microlitre et pipetez soigneusement la suspension de haut en bas sans introduire de bulles d’air dans le mélange.Pour l’analyse par cytométrie en flux, la plaque 10 microlitres des cryptes BMM se mélangent comme un dôme au centre de chaque puits d’une plaque à fond rond préchauffée de 96 puits. Et pour l’imagerie, déposez 10 microlitres du mélange sous forme de couche mince dans une chambre à microslide préchauffée de huit puits. Après avoir laissé le BMM se solidifier à température ambiante pendant cinq minutes, placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Après 15 minutes, ajoutez 250 microlitres de milieu de croissance dans chaque puits, en prenant soin de ne pas détacher le BMM, et placez la plaque dans l’incubateur. Pour visualiser le stress oxydatif par microscopie confocale, ajoutez un microlitre de solution mère de n-acétylcystéine dans les puits correspondants de la chambre à huit puits de microslide plaquée d’organoïdes. Après une incubation d’une heure, ajouter un microlitre de solution mère d’hydroperoxyde de tert-butyle dans les puits correspondants et incuber pendant 30 minutes supplémentaires.Ensuite, ajoutez un microlitre de la dilution de 1,25 millimolaire de la sonde fluorogénique par puits, suivi d’un microlitre de 1,25 milligramme par millilitre de solution de Hoechst. Après une autre incubation de 30 minutes, retirez le milieu sans perturber le BMM et ajoutez doucement 250 microlitres de DMEM chaud sans rouge phénol. Imagez les organoïdes à l’aide d’un microscope confocal équipé d’une chambre thermique et d’une alimentation en gaz qui détecte la sonde fluorogénique.À l’aide du contrôle positif, configurez l’intensité du laser et l’exposition temporelle pour le signal ROS, et vérifiez que ce signal est plus faible dans le contrôle négatif. Ensuite, à l’aide d’un oculaire, filtrez la diapositive pour identifier les organoïdes exprimant GFP et ajuster l’intensité du laser. Mettez en place une pile z de 25 micromètres et définissez des positions pour obtenir une image cousue de l’organoïde entier afin d’obtenir une section des organoïdes montrant une couche de cellules.Ajouter un microlitre de la solution mère de n-acétylcystéine dans les puits témoins négatifs de la plaque inférieure ronde de 96 puits contenant les organoïdes. Après une incubation d’une heure, ajouter une solution mère d’hydroperoxyde de tert-butyle microlitre dans les puits correspondants et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanal, retirez le fluide sans perturber le BMM attaché et transférez-le sur une autre plaque inférieure ronde de 96 puits.Gardez cette assiette de côté. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de trypsine et en utilisant une pipette multicanal, pipette de haut en bas cinq fois pour détruire le BMM. Après une courte incubation de cinq minutes, dissociez les organoïdes en pipetant de haut en bas une deuxième fois.Faites tourner la plaque et jetez le surnageant en inversant la plaque. Ajoutez le milieu précédemment recueilli dans une autre plaque de 96 puits dans les puits correspondants et remettez en suspension les cellules en pipetant cinq fois de haut en bas. Ensuite, ajoutez un microlitre de la sonde fluorogénique et incubez pendant 30 minutes.Ensuite, faites tourner à nouveau la plaque et remettez en suspension les cellules avec 250 microlitres de solution de DAPI. Transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie en flux et maintenez les tubes sur la glace. Optimisez les paramètres de tension de diffusion avant et latérale sur les tensions de contrôle et laser non colorées pour chaque fluorophore à l’aide d’échantillons monocolores.Ensuite, à l’aide d’une stratégie de contrôle appropriée, collectez un minimum de 20 000 événements. Des images confocales représentatives de la coloration ROS et des organoïdes ont montré qu’en présence de l’inhibiteur NAC, seul le signal des cellules mortes contenues dans la lumière de l’organoïde est visible. Dans l’organoïde non traité, les niveaux de ROS basaux peuvent être observés, en particulier dans les cellules GFP positives, prouvant que les cellules souches produisent des ROS plus élevées que les cellules différenciées.Les cellules GFP positives présentent un signal cytoplasmique plus important avec l’inducteur en présence de la sonde fluorogénique, démontrant que les niveaux de ROS augmentent particulièrement dans les cellules souches après le traitement. L’analyse par cytométrie en flux de la production de ROS dans les organoïdes intestinaux montre que les niveaux de ROS basaux diminuent après stimulation avec inhibiteur et augmentent après provocation avec inducteur. Les cellules prétraitées avec un inhibiteur puis stimulées avec un inducteur présentent des niveaux inférieurs à ceux stimulés avec un inducteur seul.Une analyse similaire sur les cellules souches contrôlées comme GFP positives montre une diminution de 3,5 fois du taux de ROS lors du traitement inhibiteur et une multiplication par quatre lors du traitement inducteur par rapport aux cellules non stimulées. Lorsqu’ils tentent cette procédure, les utilisateurs doivent se rappeler de limiter le stress cellulaire lors de la manipulation et de la dissociation organoïdes. De plus, les témoins positifs et négatifs doivent toujours être inclus lors de l’analyse des ROS.Après cette procédure, l’analyse peut être complétée par une coloration par immunofluorescence sur des organoïdes intacts fixes, le tri cellulaire et l’analyse de l’expression génique pour obtenir des informations supplémentaires sur la régulation des ROS. Après avoir regardé cette vidéo, vous devez savoir comment cultiver des organoïdes intestinaux murins, effectuer une analyse d’imagerie en direct d’organoïdes intacts et traiter les organes intestinaux pour l’analyse de cytométrie en flux.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Détection, visualisation et la quantification de la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène dans un système modèle Amoeba

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Recherche

Biologie

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

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High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

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Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

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Mesurer le stress oxydatif Résistance<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; En 96 plaques de microtitration bien

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

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Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

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In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

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Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

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3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Étude des effets épithéliaux de l’inflammation intestinale in vitro sur les colonoïdes murins établis

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...