Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss 17-CE14-0022 (i-Stress) der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) unterstützt.

Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung durch das Verwendungskomitee des Institut Pasteur und durch das französische Landwirtschaftsministerium Nr. 2016-0022 durchgeführt. Alle Schritte werden in einer Gewebekulturhaube durchgeführt.
1. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Kultivierung von Darmorganoiden
<ol><li>Zur Herstellung des Wachstumskulturmediums mischen Sie fortgeschrittenes DMEM/F-12, ergänzt mit 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin (P/S)-Lösung, 10 mM HEPES, 50...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Diese Arbeit bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung muriner Jejunalkrypten, zur Kultivierung zu 3D-Organoiden und zur Analyse von ROS in Organoiden durch Kombination einer ROS-empfindlichen fluorogenen Sonde mit qualitativer Mikroskopiebildgebung ganzer Organoide und quantitativer ROS-Messung mittels Durchflusszytometrie an einzelnen Zellen nach Organoiddissoziation.
Der erste kritische Schritt in dieser Methode ist das Extraktionsverfahren für Krypten. In der Tat ist die Qu...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie können auch aktiv durch spezialisierte enzymatische Komplexe wie die membrangebundenen NADPH-Oxidasen (NOX) und Dual-Oxidasen (DUOX) hergestellt werden, die Superoxidanion und Wasserstoffperoxid1 erzeugen. Durch die Expression von antioxidativen Enzymen und ROS-Aasfressern können Zellen ihr Redoxgleichgewicht fein abstimmen und so die Gewebehomöostase schützen2. Obwohl ROS für die Zellen hochgiftig sein und DNA, Proteine und Lipide schädigen kann, sind sie entscheidende Signalmoleküle2. Im Darmepithel sind moderate ROS-Spiegel für die Proliferation von Stamm- und Vorläuferzellen erforderlich3; hohe ROS-Werte führen zu ihrer Apoptose4. Chronischer oxidativer Stress ist mit vielen Magen-Darm-Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen oder Krebs verbunden. In einem Mausmodell für Wnt-getriebenen Darmkrebs wurde beispielsweise festgestellt, dass eine erhöhte ROS-Produktion durch Aktivierung von NADPH-Oxidasen für die Hyperproliferation von Krebszellen erforderlich ist5,6. Zu definieren, wie Darmzellen, insbesondere Stammzellen, Stammzellen mit oxidativem Stress umgehen und wie die zelluläre Umgebung diese Kapazität beeinflussen kann, ist wichtig, um die Ätiologie dieser Krankheit besser zu verstehen7.
In einem Gewebe weisen verschiedene Zelltypen einen basalen oxidativen Zustand auf, der je nach ihrer Funktion und ihrem Stoffwechsel und der Expression unterschiedlicher Mengen an oxidativen und antioxidativen Molekülen variieren kann4,7. Die Überwachung von ROS in vivo ist eine große Herausforderung. Zellpermeable Farbstoffe, die Fluoreszenz entsprechend ihrem Redoxzustand emittieren, wurden entwickelt, um zelluläre ROS in lebenden Zellen und Tieren sichtbar zu machen und zu messen. Ihre Wirksamkeit hängt jedoch von ihrer Diffusion in lebenden Geweben und ihrer schnellen Auslesung ab, was ihre Verwendung in Tiermodellen erschwert8.
In der Vergangenheit wurde die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen auf die ROS-Erzeugung unter Verwendung von Zelllinien durchgeführt, was jedoch möglicherweise nicht die In-vivo-Situation widerspiegelt. Das darmorganoide Modell, das von der Gruppe von Clevers9 entwickelt wurde, ermöglicht das Wachstum von intestinalen Primärzellen ex vivo. Die Kultur von Darmkrypten in Matrizen führt in Gegenwart definierter Wachstumsfaktoren zu dreidimensionalen Strukturen, organoiden (Mini-Darm) genannten Strukturen, die die Krypten-Zotten-Organisation reproduzieren, wobei Zellen aus den verschiedenen Epithellinien ein inneres Lumen auskleiden und die Darmstammzellen in kleinen kryptenartigen Vorsprüngen leben.
Hier wird unter Ausnutzung dieses Modells eine einfache Methode beschrieben, um oxidativen Stress in primären Darmzellen mit der Einzelzellauflösung zu untersuchen, indem ein kommerziell erhältlicher ROS-sensitiver Farbstoff in das Organoidkulturmedium gegeben wird.
Plattenleser werden häufig verwendet, um die ROS-Produktion in einer Gesamtpopulation zu erkennen. Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie oder bildgebende Assays, um ROS in einem bestimmten Zelltyp mit genetisch veränderten Zellen oder spezifischer Antikörperfärbung nachzuweisen. Diese Arbeit umfasst die intestinale Organoidkultur der Maus und die ROS-Visualisierung durch konfokale Bildgebung und Quantifizierung durch Durchflusszytometrie. Mit Lgr5-GFP-Mäuse-abgeleiteten Dünndarm-Organoiden ist es möglich, das Niveau des oxidativen Stresses in Darmstammzellen nach verschiedenen Behandlungen spezifisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um den Einfluss exogener Moleküle, wie z. B. mikrobiota-abgeleitetes Muramyl-Dipeptid (MDP)10, auf die ROS-Waage zu testen, nachdem Organoide mit den ausgewählten Verbindungen stimuliert wurden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intestinalen Homöostase. ROS sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie werden als Reaktion auf Infektionen oder Verletzungen auf Schleimhautebene produziert, da sie an antimikrobiellen Reaktionen und Wundheilung beteiligt sind. Sie sind auch kritische sekundäre Botenstoffe, die mehrere Wege regulieren, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung. Auf der anderen Seite führen übermäßige ROS-Spiegel zu oxidativem Stress, der für Zellen schädlich sein kann und Darmerkrankungen wie chronische Entzündungen oder Krebs begünstigt. Diese Arbeit bietet eine einfache Methode zum Nachweis von ROS in den murinen Organoiden des Darms durch Live-Bildgebung und Durchflusszytometrie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen fluorogenen Sonde. Hier beschreibt das Protokoll die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen, die das Redoxgleichgewicht in Darmorganoiden modulieren und ROS-Spiegel in bestimmten Darmzelltypen nachweisen, veranschaulicht hier durch die Analyse der mit GFP genetisch markierten Darmstammzellen. Dieses Protokoll kann mit anderen Fluoreszenzsonden verwendet werden.

Als Proof of Concept des beschriebenen Protokolls wurden die aus der Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 Mauslinie gewonnenen Krypten verwendet, in denen Darmstammzellen eine von Barker et al. etablierte Mosaik-GFP-Expression aufweisen, um Darmstammzellen10 zunächst zu charakterisieren und diese Zellen anhand ihrer GFP-Expression abzubilden. Dabei wird ein Modell bereitgestellt, um die ROS-Spiegel in einer bestimmten Zelltyppopulation bei verschiedenen Behandlungen zu vergleichen. Ein ROS-Inhibitor (NAC) wurd...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den intestinalen murinen Organoiden unter Verwendung qualitativer Bildgebung und quantitativer Zytometrie-Assays. Diese Arbeit kann möglicherweise auf andere fluoreszierende Sonden ausgedehnt werden, um die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf ROS zu testen.

Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Diese Methode ist ein wertvolles Werkzeug auf dem Gebiet der Zellbiologie zur Beurteilung zellulärer ROS-Spiegel in lebenden Primärzellen, die in vitro als Organoide mit einer fluorogenen Sonde kultiviert wurden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ROS in intakten Darmorganoiden durch Mikroskopie qualitativ visualisiert und in dissoziierten Zellen mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von 96-Well-Platten quantitativ analysiert werden kann. Diese Methode kann auf andere Organoidmodelle angewendet werden und alternative Fluoreszenzsensoren könnten verwendet werden, um verschiedene zelluläre Signalwege zu analysieren.Bevor er dieses Protokoll zum ersten Mal anwendet, sollte sich der Experimentator mit der Organoidkultur und dem Passaging vertraut machen. Obwohl unser Protokoll gut an Screening-Ansätze angepasst ist, sollten Anfänger mit ein paar Proben beginnen. Das Verfahren wird Sophie Dulauroy, eine Ingenieurin aus dem Labor, demonstrieren.Nachdem Sie eine 8 bis 10 Wochen alte Lgr5-GFP-Maus geopfert haben, sammeln Sie fünf bis acht Zentimeter des Jejunums, das die Region zwischen Zwölffingerdarm und Ileum umfasst, und legen Sie es in kaltes DPBS, das mit Antibiotika auf Eis ergänzt wird. Als nächstes reinigen Sie den Darminhalt, indem Sie mit fünf bis 10 Millilitern kaltem DPBS, das Antibiotika enthält, spülen. Öffnen Sie dann mit einer Kugelspitzenschere den Darm längs und übertragen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine Petrischale, die kaltes DPBS mit Antibiotika enthält.Schütteln Sie das Gewebe in der Schale, um es zu spülen. Als nächstes greifen Sie den Darm durch Aspiration mit einer Kunststoff-Pasteur-Pipette und übertragen Sie ihn in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter kaltes 10-Millimolar-EDTA enthält. Drehen Sie die Röhre dreimal um und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis.Nach der Inkubation wird das Gewebe für zwei Minuten in ein Röhrchen mit 10 Millilitern DPBS und Wirbel übertragen. Fügen Sie sofort 10 Mikroliter der Fraktion in eine Petrischale hinzu und verwenden Sie ein Mikroskop, um die Qualität der Fraktion zu beurteilen. Nach zwei Transfers in DPBS-haltigen Röhrchen mit zweiminütigen Wirbeln zwischen jedem Transfer, inkubieren Sie den Darm in EDTA auf Eis für fünf Minuten, wie zuvor gezeigt.Nach drei aufeinanderfolgenden Transfers in DPBS-haltigen Röhrchen mit dreiminütiger Wirbelung zwischen jedem Transfer werden die besten Fraktionen zu einem 50-Milliliter-Röhrchen kombiniert, indem die ausgewählten Röhrchen dreimal invertiert und durch ein 70-Mikron-Zellsieb filtriert werden. Dann drehen Sie die Krypten, verwerfen Sie den Überstand und zerbrechen Sie das Pellet mechanisch, bevor Sie fünf Milliliter kaltes DMEM F12 hinzufügen. Zählen Sie die Anzahl der in einem 10-Mikroliter-Aliquot vorhandenen Krypten manuell unter einem Mikroskop.Nach dem Zählen drehen Sie die Krypten erneut und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Dann das Pellet mechanisch aufbrechen und dem Röhrchen Wachstumskulturmedium hinzufügen, um eine Konzentration von 90 Krypten pro Mikroliter zu erhalten. Als nächstes fügen Sie zwei Volumen unverdünnter Kellermembranmatrix oder BMM hinzu, um eine endgültige Konzentration von 30 Krypten pro Mikroliter zu erhalten, und pipettieren Sie die Suspension vorsichtig auf und ab, ohne Luftblasen in die Mischung einzuführen.Für die Durchflusszytometrie-Analyse mischen sich Platte 10 Mikroliter der Krypten BMM als Kuppel in der Mitte jedes Bohrlochs einer vorgewärmten runden unteren 96-Well-Platte. Und für die Bildgebung 10 Mikroliter der Mischung als dünne Schicht in einer vorgewärmten Mikrorutschen-Acht-Wellen-Kammer abscheiden. Nachdem sie das BMM fünf Minuten lang bei Raumtemperatur erstarren lassen, legen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einen Inkubator.Nach 15 Minuten fügen Sie 250 Mikroliter Wachstumsmedium in jede Vertiefung hinzu, achten Sie darauf, das BMM nicht zu lösen, und legen Sie die Platte in den Inkubator. Um oxidativen Stress durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen, fügen Sie einen Mikroliter n-Acetylcystein-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen der mit Organoiden plattierten Mikrorutsche-Acht-Well-Kammer hinzu. Nach einer einstündigen Inkubation einen Mikroliter tert-Butylhydroperoxid-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben und weitere 30 Minuten inkubieren.Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter der 1,25 Millimol-Verdünnung der fluorogenen Sonde pro Vertiefung hinzu, gefolgt von einem Mikroliter von 1,25 Milligramm pro Milliliter Hoechst-Lösung. Nach einer weiteren 30-minütigen Inkubation entfernen Sie das Medium, ohne das BMM zu stören, und fügen Sie vorsichtig 250 Mikroliter warmes DMEM ohne Phenolrot hinzu. Stellen Sie die Organoide mit einem konfokalen Mikroskop vor, das mit einer Thermischen Kammer und einer Gasversorgung ausgestattet ist, die die fluorogene Sonde erkennt.Stellen Sie mit der Positivkontrolle die Laserintensität und die Zeitbelichtung für das ROS-Signal ein und überprüfen Sie, ob dieses Signal in der Negativkontrolle niedriger ist. Als nächstes screenen Sie den Objektträger mit einem Okular, um die Organoide zu identifizieren, die GFP ausdrücken, und passen Sie die Laserintensität an. Richten Sie einen Z-Stapel von 25 Mikrometern ein und definieren Sie Positionen, um ein zusammengefügtes Bild des gesamten Organoids zu erhalten, um einen Abschnitt der Organoide zu erhalten, der eine Zellschicht zeigt.Fügen Sie einen Mikroliter der n-Acetylcystein-Stammlösung in die Negativkontrolltöpfe der runden 96-Well-Bodenplatte mit den Organoiden hinzu. Nach einer einstündigen Inkubation einen Mikroliter tert-Butylhydroperoxid-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben und 30 Minuten inkubieren. Entfernen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette das Medium, ohne das angebrachte BMM zu stören, und übertragen Sie es auf eine weitere runde 96-Well-Bodenplatte.Halten Sie diesen Teller beiseite. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Trypsin hinzu und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, pipettieren Sie fünfmal auf und ab, um das BMM zu zerstören. Dissoziieren Sie nach einer kurzen fünfminütigen Inkubation die Organoide, indem Sie ein zweites Mal auf und ab pipettieren.Drehen Sie die Platte und verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umkehren. Fügen Sie das zuvor in einer anderen 96-Well-Platte gesammelte Medium wieder in die entsprechenden Wells hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie fünfmal nach oben und unten pipettieren. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter der fluorogenen Sonde hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten.Dann drehen Sie die Platte erneut und resuspendieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern DAPI-Lösung. Übertragen Sie die Proben in Durchflusszytometrieröhrchen und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Optimieren Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungseinstellungen für nicht gebeizte Steuer- und Laserspannungen für jeden Fluorophor mit monogefärbten Proben.Sammeln Sie dann mit einer geeigneten Gating-Strategie mindestens 20.000 Ereignisse. Repräsentative konfokale Bilder von ROS-Färbung und Organoiden zeigten, dass in Gegenwart des NAC-Inhibitors nur das Signal der toten Zellen sichtbar ist, die im Lumen des Organoids enthalten sind. Im unbehandelten Organoid sind die basalen ROS-Spiegel zu sehen, insbesondere in GFP-positiven Zellen, was beweist, dass Stammzellen eine höhere ROS produzieren als differenzierte Zellen.GFP-positive Zellen präsentieren in Gegenwart der fluorogenen Sonde ein signifikanteres zytoplasmatisches Signal mit dem Induktor, was zeigt, dass die ROS-Spiegel insbesondere in Stammzellen nach der Behandlung ansteigen. Die durchflusszytometrische Analyse der ROS-Produktion in den Darmorganoiden zeigt, dass die basalen ROS-Spiegel nach Stimulation mit Inhibitor abnehmen und nach Herausforderung mit Induktor ansteigen. Zellen, die mit Inhibitor vorbehandelt und dann mit Induktor stimuliert werden, weisen niedrigere Spiegel auf als diejenigen, die mit Induktor allein stimuliert werden.Eine ähnliche Analyse an Stammzellen, die als GFP-positiv abgegrenzt wurden, zeigt eine 3,5-fache Abnahme des ROS-Spiegels bei Inhibitorbehandlung und eine vierfache Zunahme bei Induktorbehandlung gegenüber nicht stimulierten Zellen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, sollten Benutzer daran denken, den Zellstress während der Organoidmanipulation und Dissoziation zu begrenzen. Darüber hinaus sollten Bei der Analyse von ROS immer Positiv- und Negativkontrollen einbezogen werden.Nach diesem Verfahren kann die Analyse durch Immunfluoreszenzfärbung auf festen intakten Organoiden, Zellsortierung und Genexpressionsanalyse ergänzt werden, um zusätzliche Einblicke in die ROS-Regulation zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie Sie murine Darmorganoide züchten, Live-Imaging-Analysen intakter Organoide durchführen und Darmorgane für die Durchflusszytometrie-Analyse verarbeiten.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Forschung

Biologie

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...