Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 17-CE14-0022 (i-Stress) dell'Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati dopo l'approvazione da parte del Comitato per l'uso dell'Institut Pasteur e del Ministero dell'Agricoltura francese n. 2016-0022. Tutti i passaggi vengono eseguiti all'interno di una cappa di coltura tissutale.
1. Preparazione di reagenti e materiali per la coltivazione di organoidi intestinali
<ol><li>Per preparare il terreno di coltura, mescolare DMEM/F-12 avanzato integrato con 1x glutammina, 1x soluzione di penicillina/streptomici...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Questo lavoro fornisce un protocollo passo-passo per isolare le cripte digiunali murine, coltivarle in organoidi 3D e analizzare i ROS negli organoidi combinando una sonda fluorogenica sensibile ai ROS con l'imaging al microscopio qualitativo di organidi interi e la misurazione quantitativa dei ROS utilizzando la citometria a flusso su singole cellule dopo la dissociazione organoide.
Il primo passo critico in questo metodo è la procedura di estrazione delle cripte. In effetti, la qualità del...

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Possono anche essere prodotti attivamente da complessi enzimatici specializzati come le NADPH-ossidasi legate alla membrana (NOX) e le dual ossidasi (DUOX), che generano anione superossido e perossido di idrogeno1. Esprimendo enzimi antiossidanti e spazzini ROS, le cellule possono sintonizzare finemente il loro equilibrio redox, proteggendo così l'omeostasi dei tessuti2. Sebbene i ROS possano essere altamente tossici per le cellule e danneggiare il DNA, le proteine e i lipidi, sono molecole di segnalazione cruciali2. Nell'epitelio intestinale sono necessari livelli moderati di ROS per la proliferazione delle cellule staminali e progenitrici3; alti livelli di ROS portano alla loro apoptosi4. Lo stress ossidativo cronico è legato a molte malattie gastrointestinali, come le malattie infiammatorie intestinali o il cancro. Ad esempio, in un modello murino di cancro intestinale guidato da Wnt, è risultata necessaria un'elevata produzione di ROS attraverso l'attivazione di NADPH-ossidasi per l'iperproliferazione delle cellule tumorali5,6. Definire come le cellule intestinali, in particolare le cellule staminali, gestiscono lo stress ossidativo e come l'ambiente cellulare può influire su questa capacità è essenziale per comprendere meglio l'eziologia di questa malattia7.
In un tessuto, diversi tipi di cellule presentano uno stato ossidativo basale che può variare in base alla loro funzione e al loro metabolismo e all'espressione di diversi livelli di molecole ossidanti e antiossidanti4,7. Il monitoraggio dei ROS in vivo è molto impegnativo. I coloranti permeabili alle cellule che emettono fluorescenza in base al loro stato redox sono stati sviluppati per visualizzare e misurare i ROS cellulari nelle cellule viventi e negli animali. Tuttavia, la loro efficacia dipende dalla loro diffusione all'interno dei tessuti viventi e dalla loro rapida lettura, rendendoli difficili da usare nei modelli animali8.
In passato, lo studio dell'effetto dei composti sulla generazione di ROS è stato fatto utilizzando linee cellulari, ma questo potrebbe non riflettere la situazione in vivo . Il modello organoide intestinale, sviluppato dal gruppo di Clevers9, consente la crescita di cellule primarie intestinali ex vivo. La coltura di cripte intestinali in matrici, in presenza di fattori di crescita definiti, porta a strutture tridimensionali, chiamate organoidi (mini-intestino), che riproducono l'organizzazione cripto-villi, con cellule delle diverse linee epiteliali che rivestono un lume interno e le cellule staminali intestinali che risiedono in piccole sporgenze simili a cripte.
Qui, sfruttando questo modello, viene descritto un metodo semplice per studiare lo stress ossidativo nelle cellule intestinali primarie alla risoluzione di una singola cellula aggiungendo un colorante ros-sensibile disponibile in commercio nel terreno di coltura organoide.
I lettori di lastre sono spesso utilizzati per rilevare la produzione di ROS in una popolazione totale. Questo protocollo utilizza la citometria a flusso o il test di imaging per rilevare ROS in un particolare tipo di cellula con cellule geneticamente modificate o colorazione anticorpale specifica. Questo lavoro coinvolge la coltura di organoidi intestinali di topo e la visualizzazione ROS mediante imaging confocale e quantificazione mediante citometria a flusso. Utilizzando gli organoidi dell'intestino tenue derivati da topi Lgr5-GFP, è possibile analizzare in modo specifico il livello di stress ossidativo nelle cellule staminali intestinali con diversi trattamenti. Questo protocollo può essere adattato per testare l'influenza di molecole esogene, come il muramil-dipeptide derivato dal microbiota (MDP)10, sul bilancio ROS, dopo aver stimolato gli organoidi con i composti selezionati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo essenziale nell'omeostasi intestinale. I ROS sono sottoprodotti naturali del metabolismo cellulare. Sono prodotti in risposta a infezioni o lesioni a livello mucoso in quanto sono coinvolti nelle risposte antimicrobiche e nella guarigione delle ferite. Sono anche messaggeri secondari critici, che regolano diversi percorsi, tra cui la crescita e la differenziazione cellulare. D'altra parte, livelli eccessivi di ROS portano a stress ossidativo, che può essere deleterio per le cellule e favorire malattie intestinali come l'infiammazione cronica o il cancro. Questo lavoro fornisce un metodo semplice per rilevare i ROS negli organoidi murini intestinali mediante imaging dal vivo e citometria a flusso, utilizzando una sonda fluorogenica disponibile in commercio. Qui il protocollo descrive l'analisi dell'effetto di composti che modulano l'equilibrio redox negli organoidi intestinali e rilevano i livelli di ROS in specifici tipi di cellule intestinali, esemplificato qui dall'analisi delle cellule staminali intestinali geneticamente etichettate con GFP. Questo protocollo può essere utilizzato con altre sonde fluorescenti.

Come prova di concetto del protocollo descritto, sono state utilizzate le cripte ottenute dalla linea di topi Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 in cui le cellule staminali intestinali mostrano un'espressione GFP a mosaico, che è stata stabilita da Barker et al., per caratterizzare inizialmente le cellule staminali intestinali10 e consentire di mappare queste cellule in base alla loro espressione GFP. Viene quindi fornito un modello per confrontare i livelli di ROS in una specifica popolazione di tipo cellul...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Il presente protocollo descrive un metodo per rilevare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) negli organoidi murini intestinali utilizzando l'imaging qualitativo e i saggi quantitativi di citometria. Questo lavoro può essere potenzialmente esteso ad altre sonde fluorescenti per testare l'effetto di composti selezionati sui ROS.

Analisi dello stress ossidativo negli organoidi intestinali murini utilizzando la sonda fluorogenica sensibile alle specie reattive dell'ossigeno

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Questo metodo è uno strumento prezioso nel campo della biologia cellulare per valutare i livelli di ROS cellulari in cellule primarie viventi coltivate in vitro come organoidi utilizzando una sonda fluorogenica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i ROS possono essere visualizzati qualitativamente in organoidi intestinali intatti al microscopio e analizzati quantitativamente in cellule dissociate mediante citometria a flusso utilizzando piastre a 96 pozzetti. Questo metodo può essere applicato ad altri modelli di organoidi e sensori fluorescenti alternativi potrebbero essere utilizzati per analizzare diversi percorsi cellulari.Prima di applicare questo protocollo per la prima volta, lo sperimentatore dovrebbe familiarizzare con la coltura organoide e il passaging. Sebbene il nostro protocollo sia ben adattato agli approcci di screening, i principianti dovrebbero iniziare con alcuni campioni. A dimostrare la procedura sarà Sophie Dulauroy, un ingegnere del laboratorio.Dopo aver sacrificato un topo Lgr5-GFP di 8-10 settimane, raccogliere da cinque a otto centimetri del digiuno che comprende la regione compresa tra il duodeno e l'ileo e metterlo in DPBS freddo integrato con antibiotici sul ghiaccio. Quindi, pulire il contenuto intestinale lavando con cinque a 10 millilitri di DPBS freddo contenente antibiotici. Quindi usando le forbici a punta di palla, apri l'intestino longitudinalmente e usando una pinza, trasferisci il tessuto in una capsula di Petri contenente DPBS freddo con antibiotici.Agitare il fazzoletto all'interno del piatto per risciacquarlo. Quindi, afferrare l'intestino per aspirazione utilizzando una pipetta Pasteur di plastica e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di EDTA freddo da 10 millimolari. Capovolgere il tubo tre volte e incubarlo sul ghiaccio per 10 minuti.Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto in un tubo contenente 10 millilitri di DPBS e vortice per due minuti. Aggiungere immediatamente 10 microlitri della frazione in una capsula di Petri e utilizzare un microscopio per valutare la qualità della frazione. Dopo due trasferimenti in tubi contenenti DPBS con vortice di due minuti tra ogni trasferimento, incubare l'intestino in EDTA su ghiaccio per cinque minuti, come dimostrato in precedenza.Dopo tre trasferimenti successivi in tubi contenenti DPBS con vortice di tre minuti tra ogni trasferimento, combinare le migliori frazioni in un tubo da 50 millilitri invertendo i tubi selezionati tre volte e filtrando attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Quindi ruotare le cripte, scartare il surnatante e interrompere meccanicamente il pellet prima di aggiungere cinque millilitri di DMEM F12 freddo. Contare manualmente al microscopio il numero di cripte presenti in un'aliquota di 10 microliti.Dopo aver contato, ruotare di nuovo le cripte e rimuovere con cura il surnatante. Quindi interrompere meccanicamente il pellet e aggiungere il terreno di coltura di crescita al tubo per ottenere una concentrazione di 90 cripte per microlitro. Quindi, aggiungere due volumi di matrice di membrana basale non diluita o BMM per ottenere una concentrazione finale di 30 cripte per microlitro e pipettare con cura la sospensione su e giù senza introdurre bolle d'aria nella miscela.Per l'analisi della citometria a flusso, la piastra 10 microlitri delle cripte BMM si mescola come una cupola al centro di ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rotondi preriscaldata. E per l'imaging, depositare 10 microlitri della miscela come strato sottile in una camera a otto pozzetti microslide preriscaldata. Dopo aver lasciato che il BMM si solidificasse a temperatura ambiente per cinque minuti, posizionare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Dopo 15 minuti, aggiungere 250 microlitri di terreno di coltura in ciascun pozzetto, facendo attenzione a non staccare il BMM e posizionare la piastra nell'incubatrice. Per visualizzare lo stress ossidativo mediante microscopia confocale, aggiungere un microlitro di soluzione madre di n-acetilcisteina nei corrispondenti pozzetti della camera a otto pozzetti microslide placcata con organoidi. Dopo un'incubazione di un'ora, aggiungere un microlitro di soluzione madre di idroperossido di terz-butile nei pozzetti corrispondenti e incubare per altri 30 minuti.Quindi, aggiungere un microlitro della diluizione 1,25 millimolare della sonda fluorogenica per pozzetto, seguito da un microlitro di 1,25 milligrammi per millilitro soluzione di Hoechst. Dopo un'altra incubazione di 30 minuti, rimuovere il mezzo senza disturbare il BMM e aggiungere delicatamente 250 microlitri di DMEM caldo senza rosso fenolo. Immagina gli organoidi usando un microscopio confocale dotato di una camera termica e di un'alimentazione di gas che rileva la sonda fluorogenica.Utilizzando il controllo positivo, impostare l'intensità del laser e l'esposizione temporale per il segnale ROS e verificare che questo segnale sia inferiore nel controllo negativo. Successivamente, utilizzando un oculare, schermare la diapositiva per identificare gli organoidi che esprimono GFP e regolare l'intensità del laser. Impostare una z-stack di 25 micrometri e definire le posizioni per ottenere un'immagine cucita dell'intero organoide per ottenere una sezione degli organoidi che mostra uno strato di cellule.Aggiungere un microlitro della soluzione madre di n-acetilcisteina nei pozzetti di controllo negativi della piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti contenente gli organoidi. Dopo un'incubazione di un'ora, aggiungere una soluzione madre di idroperossido di terz-butile microlitro nei pozzetti corrispondenti e incubare per 30 minuti. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere il mezzo senza disturbare il BMM collegato e trasferirlo su un'altra piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti.Tieni da parte questo piatto. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tripsina e utilizzando una pipetta multicanale, pipetta su e giù cinque volte per distruggere il BMM. Dopo una breve incubazione di cinque minuti, dissociare gli organoidi pipettando su e giù una seconda volta.Ruotare il piatto e scartare il surnatante invertendo il piatto. Aggiungere il mezzo precedentemente raccolto in un'altra piastra a 96 pozzetti nei pozzetti corrispondenti e risospesciare le cellule tubando su e giù cinque volte. Quindi, aggiungere un microlitro della sonda fluorogenica e incubare per 30 minuti.Quindi ruotare nuovamente la piastra e risospescere le celle con 250 microlitri di soluzione DAPI. Trasferire i campioni in provette citometriche a flusso e mantenere i tubi sul ghiaccio. Ottimizza le impostazioni della tensione di dispersione anteriore e laterale sul controllo non macchiato e sulle tensioni laser per ciascun fluoroforo utilizzando campioni monocolorati.Quindi, utilizzando una strategia di gating appropriata, raccogliere un minimo di 20.000 eventi. Immagini confocali rappresentative di colorazione ROS e organoidi hanno mostrato che in presenza dell'inibitore NAC, è visibile solo il segnale proveniente dalle cellule morte contenute nel lume dell'organoide. Nell'organoide non trattato, i livelli basali di ROS possono essere visti, in particolare nelle cellule GFP positive, dimostrando che le cellule staminali producono ROS più alti rispetto alle cellule differenziate.Le cellule GFP positive presentano un segnale citoplasmatico più significativo con l'induttore in presenza della sonda fluorogenica, dimostrando che i livelli di ROS aumentano in particolare nelle cellule staminali dopo il trattamento. L'analisi citometrica a flusso della produzione di ROS negli organoidi intestinali mostra che i livelli basali di ROS diminuiscono dopo la stimolazione con inibitore e aumentano dopo la sfida con l'induttore. Le cellule pretrattate con inibitore e poi stimolate con induttore presentano livelli inferiori rispetto a quelle stimolate con il solo induttore.Un'analisi simile sulle cellule staminali gated come GFP positive mostra una diminuzione di 3,5 volte del livello di ROS dopo il trattamento con inibitori e un aumento di quattro volte dopo il trattamento con induttore rispetto alle cellule non stimolate. Quando si tenta questa procedura, gli utenti dovrebbero ricordare di limitare lo stress cellulare durante la manipolazione organoide e la dissociazione. Inoltre, i controlli positivi e negativi dovrebbero sempre essere inclusi durante l'analisi dei ROS.Seguendo questa procedura, l'analisi può essere integrata dalla colorazione a immunofluorescenza su organoidi intatti fissi, dallo smistamento cellulare e dall'analisi dell'espressione genica per ottenere ulteriori informazioni sulla regolazione dei ROS. Dopo aver guardato questo video, dovresti sapere come coltivare organoidi intestinali murini, eseguire analisi di imaging dal vivo di organoidi intatti ed elaborare organi intestinali per l'analisi della citometria a flusso.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Individuare, visualizzare e quantificare la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno in un modello di sistema di Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Misura Stress ossidativo Resistenza<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96 pozzetti micropiastre

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Coltivazione di Organoidi dall'Epitelio Villi Intestinale sottoposti a Dedifferenziazione

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Rilevamento in tempo reale della produzione di specie reattive dell'ossigeno nella risposta immunitaria nel riso con un saggio di chemiluminescenza

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...