Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

この研究は、フランス国立研究機関(ANR)の助成金17-CE14-0022(i-Stress)によって支援されました。

すべての動物実験は、パスツール使用委員会およびフランス農業省第2016-0022号の承認後に実施された。すべてのステップは、組織培養フード内で実行される。
1. 腸管オルガノイドを培養するための試薬及び材料の調製
<ol><li>増殖培養培地を調製するには、1xグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)溶液、10mMのHEPES、50ng/mLのマウスEGF、20μg/mLのマウスノギン500ng...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

この研究は、マウスの空腸陰窩を単離し、それらを3Dオルガノイドに培養し、ROS感受性蛍光発生プローブとオルガノイド全体の定性顕微鏡イメージングおよびオルガノイド解離後の単一細胞に対するフローサイトメトリーを用いた定量的ROS測定と組み合わせることによって、オルガノイド中のROSを分析するための段階的なプロトコルを提供する。
この方法の最初の重要な...

活性酸素種(ROS)は、細胞代謝の天然の副産物である。また、膜結合型NADPH-オキシダーゼ(NOX)やデュアルオキシダーゼ(DUOX)などの特殊な酵素複合体によっても積極的に生成でき、スーパーオキシドアニオンと過酸化水素を生成します1。抗酸化酵素とROSスカベンジャーを発現させることにより、細胞は酸化還元バランスを微調整し、組織の恒常性を保護することができます2。ROSは細胞に対して非常に毒性が高く、DNA、タンパク質、脂質に損傷を与える可能性がありますが、それらは重要なシグナル伝達分子です2。腸上皮では、幹および前駆細胞の増殖に中等度のROSレベルが必要です3。高いROSレベルは、アポトーシスにつながります4。慢性酸化ストレスは、炎症性腸疾患や癌などの多くの胃腸疾患に関連しています。一例として、Wnt駆動型腸癌のマウスモデルにおいて、NADPHオキシダーゼの活性化によるROS産生の上昇が癌細胞の過剰増殖に必要であることが判明した5,6。腸細胞、特に幹細胞、幹細胞が酸化ストレスをどのように管理し、細胞環境がこの能力にどのように影響するかを定義することは、この病気の病因をよりよく理解するために不可欠です7。
組織において、異なる細胞型は、その機能および代謝、ならびに様々なレベルの酸化分子および抗酸化分子の発現に応じて変化し得る基礎酸化状態を提示する4,7。インビボでのROSモニタリングは非常に困難です。酸化還元状態に応じて蛍光を発する細胞透過性色素は、生細胞や動物における細胞ROSを可視化・測定するために開発されている。しかし、その有効性は、生体組織内での拡散と迅速な読み出しに依存しているため、動物モデルでの使用が困難です8。
過去には、ROS生成に対する化合物の効果の研究は細胞株を用いて行われていたが、これはin vivoの状況を反映していない可能性がある。Clevers9のグループによって開発された腸オルガノイドモデルは、腸の初代細胞のエクスビボでの増殖を可能にする。定義された成長因子の存在下でのマトリックス中の腸陰窩の培養は、オルガノイド(ミニ腸)と呼ばれる三次元構造をもたらし、異なる上皮系統からの細胞が内部管腔を裏打ちし、腸幹細胞が小さな陰窩様突起に存在する陰窩絨毛組織を再現する。
ここでは、このモデルを利用して、市販のROS感受性色素をオルガノイド培地に添加することにより、初代腸管細胞の酸化ストレスを単一細胞分解能で調べる簡便な方法について説明する。
プレートリーダーは、全集団におけるROS産生を検出するためによく使用されます。このプロトコルは、フローサイトメトリーまたはイメージングアッセイを使用して、遺伝子改変細胞または特定の抗体染色を用いて特定の細胞型におけるROSを検出する。この研究は、マウス腸管オルガノイド培養と共焦点イメージングによるROS可視化、フローサイトメトリーによる定量化を含む。Lgr5-GFPマウス由来小腸オルガノイドを用いて、異なる治療を受けた際の腸管幹細胞における酸化ストレスのレベルを特異的に解析することができる。このプロトコルは、選択した化合物でオルガノイドを刺激した後、微生物叢由来のムラミルジペプチド(MDP)10などの外因性分子がROSバランスに及ぼす影響をテストするために適合させることができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

活性酸素種(ROS)は、腸の恒常性維持に不可欠な役割を果たす。ROSは細胞代謝の天然の副産物である。それらは、抗菌応答および創傷治癒に関与するので、粘膜レベルでの感染または傷害に応答して産生される。それらはまた、重要な二次メッセンジャーであり、細胞の成長および分化を含むいくつかの経路を調節する。一方、過剰なROSレベルは酸化ストレスをもたらし、これは細胞にとって有害であり、慢性炎症または癌のような腸疾患に有利であり得る。この研究は、市販の蛍光発生プローブを用いたライブイメージングおよびフローサイトメトリーによって腸内マウスオルガノイド中のROSを検出する簡単な方法を提供する。ここでのプロトコールは、GFPで遺伝的に標識された腸幹細胞の分析によってここに例示される、腸オルガノイドにおける酸化還元バランスを調節し、特定の腸細胞型におけるROSレベルを検出する化合物の効果をアッセイすることを記載する。このプロトコルは、他の蛍光プローブと共に使用され得る。

記載されたプロトコールの概念実証として、腸幹細胞がモザイクGFP発現を示すLgr5-eGFP-IRES-CreERT2マウス系統から得られた陰窩が使用され、これはBarkerらによって確立され、腸幹細胞10 を最初に特徴付け、それらのGFP発現に基づいてこれらの細胞をマッピングすることを可能にする。これにより、異なる治療時に特定の細胞型集団におけるROSレベルを比較するためのモデルが提...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

本プロトコールは、定性的イメージングおよび定量的サイトメトリーアッセイを用いて腸マウスオルガノイド中の活性酸素種(ROS)を検出する方法を記載する。この研究は、選択された化合物がROSに及ぼす影響を試験するために、他の蛍光プローブに拡張される可能性があります。

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

この方法は、蛍光発生プローブを用いてオルガノイドとしてインビトロで培養した生きた初代細胞における細胞ROSレベルを評価するための細胞生物学の分野において貴重なツールである。この技術の主な利点は、顕微鏡検査によって無傷の腸内オルガノイドにおいてROSを定性的に可視化し、96ウェルプレートを用いたフローサイトメトリーによって解離細胞において定量的に分析できることである。この方法は、他のオルガノイドモデルに適用することができ、代替蛍光センサを使用して、異なる細胞経路を解析することができる。このプロトコルを初めて適用する前に、実験者はオルガノイドの培養と継代に精通している必要があります。私たちのプロトコルはスクリーニングアプローチによく適応していますが、初心者はいくつかのサンプルから始めるべきです。手順を実演するのは、研究室のエンジニアであるSophie Dulauroyです。生後8~10週のLgr5-GFPマウスを犠牲にした後、十二指腸と回腸の間の空腸包接領域を5~8センチ採取し、抗生物質を添加した冷たいDPBSに氷上に置きます。次に、抗生物質を含む5〜10ミリリットルの冷たいDPBSで洗い流すことによって腸内容物をきれいにする。次に、ボールチップハサミを使用して、腸を縦方向に開き、鉗子を使用して、抗生物質を含む冷たいDPBSを含むペトリ皿に組織を移す。皿の中のティッシュを振ってすすいでください。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して吸引して腸をつかみ、10ミリリットルの冷たい10ミリモルEDTAを含む15ミリリットルのチューブに移します。チューブを3回反転させ、氷上で10分間インキュベートする。インキュベーション後、10ミリリットルのDPBSおよび渦を含むチューブに組織を2分間移す。直ちに10マイクロリットルの画分をペトリ皿に加え、顕微鏡を使用して画分の品質を評価する。DPBS含有チューブで2回の移送を行った後、各移送の間に2分間ボルテックスをかけ、以前に実証したように、EDTA中で腸を氷上で5分間インキュベートする。DPBSを含むチューブで3回連続して移送した後、各移送の間に3分間のボルテックス処理を行い、選択したチューブを3回反転させ、70ミクロンのセルストレーナーでフィルタリングすることにより、最良の画分を50ミリリットルのチューブに結合します。その後、陰窩を回転させ、上清を捨て、ペレットを機械的に破壊してから、5ミリリットルの冷たいDMEM F12を加える。顕微鏡下で10マイクロリットルのアリコートに存在する陰窩の数を手動で数えます。カウント後、再びクリプトを回転させ、上清を慎重に取り除きます。次いで、ペレットを機械的に破砕し、増殖培地をチューブに加え、マイクロリットル当たり90クリプトの濃度を得た。次に、希釈されていない基底膜マトリックスまたはBMMを2倍量加えて、マイクロリットルあたり30クリプトの最終濃度を得、混合物に気泡を導入せずに懸濁液を上下に慎重にピペットします。フローサイトメトリー分析のために、プレート10マイクロリットルの陰窩BMMは、予め加温された丸底96ウェルプレートの各ウェルの中央にドームとして混合する。そしてイメージングのために、予め加温されたマイクロスライド8ウェルチャンバーに10マイクロリットルの混合物を薄層として堆積させる。BMMを室温で5分間固化させた後、プレートを摂氏37度および二酸化炭素5%のインキュベーターに入れる。15分後、BMMが剥離しないように注意しながら、各ウェルに250マイクロリットルの成長培地を加え、プレートをインキュベーターに入れた。共焦点顕微鏡によって酸化ストレスを視覚化するために、オルガノイドで播種されたマイクロスライド8ウェルチャンバーの対応するウェルに1マイクロリットルのn-アセチルシステインストック溶液を加える。1時間のインキュベーションの後、対応するウェルに1マイクロリットルのtert-ブチルヒドロペルオキシド原液を加え、さらに30分間インキュベートする。次に、ウェル当たり1.25ミリモル希釈の蛍光発生プローブを1マイクロリットル加え、続いて1ミリリットル当たり1.25ミリグラムのヘキスト溶液を1マイクロリットル加える。さらに30分間のインキュベーションの後、BMMを乱すことなく培地を除去し、フェノールレッドを含まない250マイクロリットルの温かいDMEMを静かに加える。蛍光発生プローブを検出する熱チャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を用いてオルガノイドを画像化する。ポジティブコントロールを使用して、ROS信号のレーザー強度と時間露出を設定し、この信号がネガティブコントロールで低くなっていることを確認します。次に、接眼レンズを用いて、スライドをスクリーニングしてGFPを発現するオルガノイドを同定し、レーザー強度を調整する。25マイクロメートルのzスタックをセットアップし、位置を定義してオルガノイド全体のステッチ画像を取得し、細胞の1層を示すオルガノイドのセクションを取得します。オルガノイドを含む96ウェル丸底プレートの陰性対照ウェルに1マイクロリットルのnアセチルシステインストック溶液を加える。1時間のインキュベーションの後、対応するウェルに1マイクロリットルのtert-ブチルヒドロペルオキシド原液を加え、30分間インキュベートする。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、取り付けられたBMMを乱すことなく培地を取り出し、別の96ウェル丸底プレートに移します。このプレートは脇に置いておきます。次に、100マイクロリットルのトリプシンを添加し、マルチチャンネルピペットを使用して、ピペットを5回上下させてBMMを破壊する。短い5分間のインキュベーションの後、2回目に上下にピペッティングすることによってオルガノイドを解離させる。プレートを回転させ、プレートを反転させて上澄みを捨てる。別の96ウェルプレートに以前に集めた培地を対応するウェルに戻し、上下に5回ピペッティングして細胞を再懸濁する。次に、1マイクロリットルの蛍光発生プローブを添加し、30分間インキュベートする。その後、プレートを再び回転させ、細胞を250マイクロリットルのDAPI溶液で再懸濁する。サンプルをフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に保持します。モノステインされたサンプルを使用して、各蛍光色素分子の染色されていないコントロールおよびレーザー電圧の順方向散乱電圧および側方散乱電圧設定を最適化します。次に、適切なゲーティング戦略を使用して、少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。ROS染色およびオルガノイドの代表的な共焦点画像は、NAC阻害剤の存在下では、オルガノイドの内腔に含まれる死細胞からのシグナルのみが見えることを示した。非処理オルガノイドでは、特にGFP陽性細胞において基礎ROSレベルが見られ、幹細胞が分化細胞よりも高いROSを産生することを証明している。GFP陽性細胞は、蛍光発生プローブの存在下でインデューサーと共により有意な細胞質シグナルを提示し、特に治療後の幹細胞においてROSレベルが増加することを実証している。腸内オルガノイドにおけるROS産生のフローサイトメトリー分析は、インヒビターによる刺激後に基礎ROSレベルが低下し、インデューサーによるチャレンジ後に増加することを示している。インヒビターで前処理し、次いでインデューサーで刺激された細胞は、インデューサー単独で刺激されたものよりも低いレベルが存在する。GFP陽性としてゲーティングされた幹細胞に関する同様の解析では、阻害剤処理時にROSレベルが3.5倍低下し、非刺激細胞に対してインデューサー処理時に4倍の増加が示されています。この手順を試みるとき、ユーザーはオルガノイドの操作と解離の間に細胞ストレスを制限することを忘れないでください。さらに、ROSを分析する際には、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを常に含める必要があります。この手順に続いて、固定されたインタクトなオルガノイドに対する免疫蛍光染色、細胞選別、および遺伝子発現解析によって解析を補完し、ROS調節に関するさらなる洞察を得ることができます。このビデオを見た後、マウスの腸内オルガノイドを成長させる方法、無傷のオルガノイドのライブイメージング分析を実行する方法、およびフローサイトメトリー分析のために腸内器官を処理する方法を知っている必要があります。

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

全身酸化ストレスの間接的な指標として、コメットアッセイ

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

化学発光アッセイによるイネの免疫応答における活性酸素種産生のリアルタイム検出

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...