Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 보조금 17-CE14-0022 (i-스트레스)에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 2016-0022년 프랑스 농무부의 승인 후 수행되었다. 모든 단계는 조직 배양 후드 내부에서 수행됩니다.
1. 장 내장을 배양하기 위한 시약 및 재료 준비
<ol><li>성장 배양 배지를 준비하려면 1x 글루타민, 1배 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액, HEPES 10mMM, 뮤린 EGF 50ng/mL, 뮤린 노긴 500 ng/mL(R-Spond)의 20 μg/mL(R-Spond1)를 혼합하여 R-Spond 1의 암조를 준비 한다. ...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

이 작품은 뮤직 제주네아네아의 토굴을 분리하고, 3D 오르간노이드로 배양하고, ROS에 민감한 플루오로겐성 프로브를 전체 오르가노이드의 질적 현미경 영상과 결합하여 오르가노이드 변화 후 단일 세포에 대한 유동 세포측정을 사용하여 분석하는 단계별 프로토콜을 제공한다.
이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 암호화 추출 프로시저입니다. 실제로, 토굴 준비의 품질은 성공?...

반응성 산소 종 (ROS) 세포 대사의 자연 부산물. 또한 초산화화물 음이온 및 과산화수소를 생성하는 멤브레인 바인딩 NADPH-Oxidases (NOX) 및 듀얼 옥시다제 (DUOX)와 같은 특수 효소 복합체에 의해 적극적으로 생성 될 수 있습니다. 항산화 효소와 ROS 청소부를 발현함으로써 세포는 레독스 균형을 미세조정하여 조직 항상성을 보호할 수 있습니다2. ROS는 세포에 매우 독성이 있고 DNA, 단백질 및 지질을 손상시킬 수 있지만 중요한 신호 분자2입니다. 장 상피에서, 중간 정도의 ROS 수준은 줄기 및 전구 세포 증식에 필요합니다3; 높은 ROS 수준은 그들의 apoptosis4로 이끌어 내는. 만성 산화 스트레스는 염증성 장 질환이나 암과 같은 많은 위장 질환과 관련이 있습니다. 예를 들어, Wnt 구동 장암의 마우스 모델에서 NADPH-산화제의 활성화를 통한 ROS 생산이 상승하여 암세포 과확산5,6에 요구되는 것으로 나타났다. 장 세포, 특히 줄기 세포가 산화 스트레스를 관리하는 방법과 세포 환경이이 용량에 미치는 영향을 정의하는 것은이 질병의 병인을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다7.
조직에서, 다른 세포 모형은 그들의 기능 및 물질 대사 및 산화제 와 항 산화 분자의 다양한 수준의 표현에 따라 다를 수 있는 기저 산화 상태를 제시4,7. 생체 내에서 ROS를 모니터링하는 것은 매우 어렵습니다. 그들의 redox 상태에 따라 형광을 방출하는 세포 투과성 염료는 살아있는 세포 및 동물에 있는 세포 ROS를 구상하고 측정하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 그들의 효능은 살아있는 조직 내부의 확산과 그들의 급속한 판독에 따라 달라 집니다., 동물 모델에서 사용 하기 어려운 만들기8.
과거에는, ROS 생성에 화합물의 효과의 연구는 세포주를 사용하여 수행되었지만, 이것은 생체 내 상황을 반영하지 않을 수 있다. Clevers9의 그룹에 의해 개발된 장 기관지성 모델은 장 1차 세포의 성장을 가능하게 합니다. 행렬에서 장 토굴의 문화, 정의 된 성장 인자의 존재, 3 차원 구조로 이어질, 라는 오가노이드 (미니 창자), 이는 내부 루멘을 안감 다른 상피 혈통에서 세포와, 그리고 소장 줄기 세포는 작은 crypts 같은 돌출에 거주.
여기서, 본 모델을 활용하면, 단세포 배양 배지에 상업적으로 이용 가능한 ROS 에 민감한 염료를 첨가함으로써 단세포 분해능에서 1차 장 세포에서 산화적 스트레스를 연구하는 간단한 방법이 기재된다.
플레이트 판독기는 종종 총 인구에서 ROS 생산을 감지하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 유동 세포 분석 또는 이미징 분석체를 사용하여 유전자 변형 세포 또는 특정 항체 염색을 가진 특정 세포 유형에서 ROS를 검출합니다. 이 작품은 유동 세포측정에 의한 공초점 화상 진찰 및 정량화에 의한 마우스 장 기관가성 배양 및 ROS 시각화를 포함합니다. Lgr5-GFP 마우스 유래 소장 오르가노이드를 사용하여, 상이한 치료법에 따라 장 줄기 세포에서 산화 스트레스의 수준을 구체적으로 분석할 수 있다. 이러한 프로토콜은 선택된 화합물로 오르가노이드를 자극한 후 ROS 균형에 미생물-유래 무라밀-디펩티드(MDP)10과 같은 외인성 분자의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

반응성 산소 종 (ROS)은 장 집상성에서 필수적인 역할을합니다. ROS는 세포 대사의 천연 부산물입니다. 그들은 항균 반응 및 상처 치유에 관여로 점막 수준에서 감염 또는 부상에 대 한 응답으로 생산 됩니다. 그(것)들은 또한 세포 성장 및 분화를 포함하여 몇몇 통로를 통제하는 중요한 이차 메신저입니다. 다른 한편으로는, 과도한 ROS 수준은 산화 스트레스로 이끌어 내고, 이는 세포에 대한 해로운 일 수 있고 만성 염증 또는 암 같이 장 질병을 선호할 수 있습니다. 이 작품은 상업적으로 이용 가능한 불소 성 프로브를 사용하여 살아있는 화상 진찰 및 유동 세포측정에 의하여 장 내 뮤뇨 오르가노이드에서 ROS를 검출하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 프로토콜은 장 가구형에서 레독스 균형을 조절하고 특정 장 세포 유형에서 ROS 수준을 검출하는 화합물의 효과를 분석하며, 여기에 GFP로 유전적으로 표지된 장 줄기 세포의 분석에 의해 예시된다. 이 프로토콜은 다른 형광 프로브와 함께 사용될 수 있다.

설명된 프로토콜의 개념 증명으로서, 장줄기 세포가 바커 등에서 확립한 모자이크 GFP 발현을 표시하는 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 마우스 라인에서 얻은 토굴은 처음에 장 줄기 세포를 특성화하고 GFP 발현에 기초하여 이러한 세포를 매핑할 수 있도록 사용되었다. 모델은 상이한 처리시 특정 세포 유형 집단에서 ROS 수준을 비교하기 위하여 제공됩니다. ROS 억제제(NAC)가 사용되었고, 유도제(...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

이 방법은 형광성 프로브를 사용하여 유기체로 시험관에서 재배된 살아있는 1차 세포에서 세포 ROS 수준을 평가하기 위한 세포 생물학 분야에서 귀중한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 ROS가 현미경 검사법에 의해 온전한 장 오르가노이드로 질적으로 시각화되고 96웰 플레이트를 사용하여 혈류 세포측정에 의해 해리된 세포에서 정량적으로 분석될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 오르가노이드 모델에 적용될 수 있으며 대체 형광 센서를 사용하여 다른 세포 경로를 분석할 수 있습니다.이 프로토콜을 처음으로 적용하기 전에 실험자는 오르가노이드 문화와 패시징에 익숙해져야합니다. 우리의 프로토콜은 선별 접근에 잘 적응되어 있지만 초보자는 몇 가지 샘플로 시작해야합니다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실의 엔지니어인 소피 둘라우로이(Sophie Dulauroy)가 될 것입니다.8-10주 된 Lgr5-GFP 마우스를 희생한 후 십이지장과 일루 사이에 있는 제주의 5~8cm를 모아 얼음에 항생제로 보충된 차가운 DPBS에 배치한다. 다음으로, 항생제를 함유한 감기 DPBS의 5~10밀리리터로 세척하여 장 내 함량을 청소한다. 그런 다음 볼 팁 가위를 사용하여 장내를 세로로 열고 집게를 사용하여 항생제로 차가운 DPBS를 함유 한 페트리 접시로 조직을 옮깁니다.접시 안에 있는 조직을 흔들어 헹구세요. 다음으로, 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 원자를 포부로 잡고 차가운 10 밀리리터EDTA의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮춥시다. 튜브를 세 번 반전하고 10 분 동안 얼음에 배양하십시오.인큐베이션 후, DPBS와 소용돌이의 10 밀리리터를 포함하는 튜브에서 조직을 2 분 동안 전송합니다. 페트리 접시에 분획 10 마이크로리터를 즉시 추가하고 현미경을 사용하여 분수의 품질을 평가합니다. DPBS에서 각 전송 사이에 2분 동안 소용돌이를 가하는 튜브가 포함된 두 번의 전송 후, 이전에 설명한 대로 5분 동안 EDTA의 내장을 얼음 위에 배양합니다.DPBS를 함유한 튜브에서 3회 연속 이송한 후, 선택한 튜브를 세 번 반전하고 70미크론 세포 여과기를 통해 필터링하여 최적의 분획을 50 밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 지하실을 회전시키고, 상체를 버리고, 차가운 DMEM F12의 5 밀리리터를 추가하기 전에 기계적으로 펠릿을 방해합니다. 현미경의 밑에 수동으로 10 마이크로 리터 알리쿼트에 존재하는 토굴의 수를 계산합니다.계산 후, 다시 토굴을 회전하고 신중하게 상체를 제거합니다. 그런 다음 기계적으로 펠릿을 방해하고 마이크로 리터 당 90 개의 지하실의 농도를 얻기 위해 튜브에 성장 배양 매체를 추가합니다. 다음으로, 희석되지 않은 지하 멤브레인 매트릭스 또는 BMM의 두 볼륨을 추가하여 마이크로리터당 30개의 토굴의 최종 농도를 얻고 거품을 혼합에 도입하지 않고 서스펜션을 위아래로 조심스럽게 피펫합니다.유동 세포측정 분석을 위해, 소굴의 10 마이크로리터 BMM 믹스는 미리 따뜻워진 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰의 중심에 돔으로 혼합됩니다. 그리고 이미징을 위해, 미리 따뜻워진 마이크로 슬라이드 8웰 챔버에서 얇은 층으로 믹스의 10 마이크로리터를 증착한다. BMM이 실온에서 5분 동안 고화할 수 있도록 허용한 후, 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 인큐베이터에 놓습니다.15분 후, BMM을 분리하지 않도록 주의하여 각 우물에 250 마이크로리터의 성장 매체를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다. 공초점 현미경 검사법에 의해 산화 스트레스를 시각화하려면, 오가노이드로 도금 된 마이크로 슬라이드 8 웰 챔버의 해당 우물에 n-아세틸시스테인 스톡 솔루션의 마이크로 리터 를 추가합니다. 1시간 동안 인큐베이션을 한 후, 해당 우물에 테르트 부틸 하이드로퍼산화물 스톡 솔루션 1마이크로리터를 추가하고 30분 동안 배양합니다.다음으로, 1.25 밀리머 희석제의 마이크로리터를 잘 합산한 다음 밀리리터 Hoechst 용액당 1.25 밀리그램의 마이크로리터를 첨가합니다. 또 다른 30 분 인큐베이션 후, BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 부드럽게 페놀 레드없이 따뜻한 DMEM의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 불소 발생 프로브를 감지하는 저혈 챔버 및 가스 공급이 장착된 공초점 현미경을 사용하여 유기체를 이미지합니다.양수 제어를 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 음수 제어에서 더 낮은지 확인합니다. 다음으로, 접제를 사용하여 슬라이드를 스크린하여 GFP를 표현하는 오르가노이드를 식별하고 레이저 강도를 조정합니다. 25 마이크로미터의 z 스택을 설정하고 세포의 한 층을 보여주는 오르가노이드의 단면을 얻기 위해 전체 오르가노이드의 스티치 이미지를 얻기 위해 위치를 정의합니다.오르가노이드를 함유한 96웰 라운드 하단 플레이트의 네거티브 컨트롤 웰에 n-아세틸시스테인 스톡 용액의 마이크로리터 1개를 추가합니다. 1시간 동안 인큐베이션한 후 해당 우물에 마이크로리터 테르트 부틸 하이드로퍼산화물 스톡 솔루션 1개를 추가하고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 연결된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 원형 하단 플레이트로 전송합니다.이 접시를 따로 두십시오. 다음으로, 트립신의 100 마이크로 리터를 추가하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여, 피펫을 위아래로 다섯 번 사용하여 BMM을 파괴합니다. 짧은 5 분 잠복 후, 두 번째 시간 위아래로 파이프팅하여 오르가노이드를 분리합니다.접시를 회전하고 접시를 반전하여 상체를 폐기합니다. 이전에 다른 96웰 플레이트에서 수집한 배지를 해당 우물에 다시 넣고 5번 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 불소 질 프로브의 마이크로리터 1개를 추가하고 30분 동안 배양합니다.그런 다음 플레이트를 다시 회전시키고 DAPI 용액의 250 마이크로리터로 세포를 다시 분리합니다. 흐름 세포측정관에서 샘플을 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 단염색한 샘플을 사용하여 각 불소에 대한 스테인드 컨트롤 및 레이저 전압에서 전방 및 측면 분산 전압 설정을 최적화합니다.그런 다음 적절한 게이팅 전략을 사용하여 최소 20, 000 이벤트를 수집합니다. ROS 염색 및 오르가노이드의 대표적인 공초점 이미지는 NAC 억제제의 존재에서, 오르가노이드의 루멘에 포함 된 죽은 세포로부터의 신호만 볼 수 있음을 보여 주었다. 비처리 된 오르가노이드에서, 기저 ROS 수준은 특히 GFP 양성 세포에서 볼 수 있으며, 줄기 세포가 분화 된 세포보다 더 높은 ROS를 생성한다는 것을 증명합니다.GFP 양성 세포는 형광 탐사선이 존재하여 유도체와 함께 보다 중요한 세포질 신호를 제시하며, 치료 후 줄기 세포에서 특히 ROS 수치가 증가한다는 것을 입증한다. 장 기관가노이드에서 ROS 생산의 유동 세포 분석은 저해기로 자극 후 기저 ROS 수치가 감소하고 유도제와 도전 후에 증가한다는 것을 보여줍니다. 억제제로 전처리된 다음 유도제로 자극한 세포는 유도제만으로는 자극받은 세포보다 낮은 수준을 제시합니다.GFP 양성으로 게이트된 줄기 세포에 대한 유사한 분석은 억제제 치료 시 ROS 레벨의 3.5배 감소와 비자극세포에 대한 유도제 치료에 따른 4배 증가를 나타낸다. 이 절차를 시도할 때 사용자는 organoid 조작 및 해리 중에 세포 스트레스를 제한하는 것을 기억해야 합니다. 또한 ROS를 분석할 때 항상 양수 및 음수 컨트롤을 포함해야 합니다.이 절차에 이어, 분석은 ROS 조절에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해 고정 된 그대로 유기체, 세포 정렬 및 유전자 발현 분석에 대한 면역 형광 염색에 의해 보완 될 수있다. 이 비디오를 시청한 후에는 뮤린 장 오르가노이드를 재배하고, 그대로 유기체에 대한 실시간 이미징 분석을 수행하고, 유동 세포측정 분석을 위한 장 기관을 처리하는 방법을 알아야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

연구

생물학

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

렌티 바이러스 형질 도입 및 장내 Organoids의 다운 스트림 분석을위한 프로토콜

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

시험관 내 E3 유비퀴틴 리가제 기능 분석

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Chemiluminescence Assay를 통한 벼의 면역 반응에서 활성 산소 종 생산의 실시간 검출

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

확립된 쥐 콜로노이드에 대한 시험관 내 장 염증의 상피 효과 연구

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...