Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av French National Research Agency (ANR) grant 17-CE14-0022 (i-Stress).

Alle dyreforsøk ble utført etter godkjenning av Institut Pasteur Use Committee og av det franske landbruksdepartementet nr. Alle trinnene utføres inne i en vevskulturhette.
1. Fremstilling av reagenser og materialer for dyrking av intestinale organoider
<ol><li>For å forberede vekstkulturmediet blander du avansert DMEM/F-12 supplert med 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin (P/S)-løsning, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murine EGF, 20 μg/ml murine Noggin 500 ng/ml mus R-Spondin1 (se ta...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Dette arbeidet gir en trinnvis protokoll for å isolere murine jejunale krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved å kombinere en ROS-sensitiv fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopiavbildning av hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjelp av strømningscytometri på enkeltceller etter organoid dissosiasjon.
Det første kritiske trinnet i denne metoden er krypteruttrekkingsprosedyren. Faktisk er kvaliteten på krypterpreparat nøkkelen til vellykket organo...

Reaktive oksygenarter (ROS) er naturlige biprodukter av cellulær metabolisme. De kan også produseres aktivt av spesialiserte enzymatiske komplekser som membranbundet NADPH-Oxidases (NOX) og Dual Oxidases (DUOX), som genererer superoksid anion og hydrogenperoksid1. Ved å uttrykke antioksidantenzymer og ROS-scavengers, kan cellene finjustere sin redoksbalanse, og dermed beskytte vev homeostase2. Selv om ROS kan være svært giftig for cellene og skade DNA, proteiner og lipider, er de avgjørende signalmolekyler2. I tarmepitelet er det nødvendig med moderate ROS-nivåer for stam- og stamcelleproliferasjon3; høye ROS-nivåer fører til apoptose4. Kronisk oksidativt stress er knyttet til mange gastrointestinale sykdommer, som inflammatoriske tarmsykdommer eller kreft. Som et eksempel, i en musemodell av Wnt-drevet tarmkreft, ble forhøyet ROS-produksjon gjennom aktivering av NADPH-oksider funnet å være nødvendig for kreftceller hyperproliferasjon5,6. Å definere hvordan tarmceller, spesielt stamceller, styrer oksidativt stress og hvordan det cellulære miljøet kan påvirke denne kapasiteten, er avgjørende for å forstå etiologien til denne sykdommen bedre7.
I et vev presenterer forskjellige celletyper en basal oksidativ tilstand som kan variere i henhold til deres funksjon og metabolisme og uttrykket av forskjellige nivåer av oksidant- og antioksidantmolekyler4,7. Overvåking av ROS in vivo er veldig utfordrende. Cellegjennomtrengelige fargestoffer som avgir fluorescens i henhold til deres redokstilstand, er utviklet for å visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Imidlertid avhenger deres effekt av deres diffusjon inne i levende vev og deres raske avlesning, noe som gjør dem vanskelige å bruke i dyremodeller8.
Tidligere ble studien av effekten av forbindelser på ROS-generering gjort ved hjelp av cellelinjer, men dette gjenspeiler kanskje ikke in vivo-situasjonen . Den intestinale organoidmodellen, utviklet av gruppen Clevers9, muliggjør veksten av intestinale primære celler ex vivo. Kultur av tarmkrypter i matriser, i nærvær av definerte vekstfaktorer, fører til tredimensjonale strukturer, kalt organoider (mini-gut), som reproduserer krypt-villus-organisasjonen, med celler fra de forskjellige epiteliale avstamningene som foringer en intern lumen, og tarmstammecellene som ligger i små krypterlignende fremspring.
Her, ved å dra nytte av denne modellen, beskrives en enkel metode for å studere oksidativt stress i primære tarmceller ved encellet oppløsning ved å legge til et kommersielt tilgjengelig ROS-sensitivt fargestoff i organoidkulturmediet.
Platelesere brukes ofte til å oppdage ROS-produksjon i en total befolkning. Denne protokollen bruker strømningscytometri eller bildeanalyse for å oppdage ROS i en bestemt celletype med genetisk modifiserte celler eller spesifikk antistofffarging. Dette arbeidet innebærer mus intestinal organoid kultur og ROS visualisering ved konfikal avbildning og kvantifisering ved strømning cytometri. Ved hjelp av Lgr5-GFP mus-avledede små intestinale organoider, er det mulig å spesifikt analysere nivået av oksidativt stress i tarmstammeceller ved forskjellige behandlinger. Denne protokollen kan tilpasses for å teste påvirkningen av eksogene molekyler, for eksempel mikrobiota-avledet muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, etter å ha stimulert organoider med de valgte forbindelsene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter av cellemetabolisme. De produseres som respons på infeksjon eller skade på slimhinnenivå, da de er involvert i antimikrobielle responser og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, som regulerer flere veier, inkludert cellevekst og differensiering. På den annen side fører overdreven ROS-nivåer til oksidativt stress, noe som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsykdommer som kronisk betennelse eller kreft. Dette arbeidet gir en enkel metode for å oppdage ROS i tarm murin organoider ved levende avbildning og strømning cytometri, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen av effekten av forbindelser som modulerer redoksbalansen i tarmorganoider og oppdager ROS-nivåer i spesifikke tarmcelletyper, eksemplifisert her ved analyse av tarmstammecellene genetisk merket med GFP. Denne protokollen kan brukes med andre fluorescerende sonder.

Som et konseptbevis for den beskrevne protokollen ble kryptene hentet fra lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muselinje brukt der tarmstammeceller viser mosaikk GFP-uttrykk, som ble etablert av Barker et al., for å karakterisere tarmstammeceller10 i utgangspunktet og tillate å kartlegge disse cellene basert på deres GFP-uttrykk. En modell er dermed gitt for å sammenligne ROS-nivåer i en bestemt celletypepopulasjon med forskjellige behandlinger. En ROS-hemmer (NAC) ble brukt, og en induser (tBHP), kjent fo...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å oppdage reaktive oksygenarter (ROS) i tarm murin organoider ved hjelp av kvalitativ avbildning og kvantitative cytometrianalyser. Dette arbeidet kan potensielt utvides til andre fluorescerende sonder for å teste effekten av utvalgte forbindelser på ROS.

Analysere oksidativt stress i murine intestinale organoider ved hjelp av reaktive oksygenarter-sensitiv fluorogen sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Denne metoden er et verdifullt verktøy innen cellulær biologi for å vurdere cellulære ROS-nivåer i levende primærceller dyrket in vitro som organoider ved hjelp av en fluorogen sonde. Den største fordelen med denne teknikken er at ROS kan visualiseres kvalitativt i intakte tarmorganoider ved mikroskopi og kvantitativt analysert i dissosierte celler ved strømningscytometri ved hjelp av 96-brønnsplater. Denne metoden kan brukes på andre organoidmodeller, og alternative fluorescerende sensorer kan brukes til å analysere forskjellige cellulære veier.Før du bruker denne protokollen for første gang, bør eksperimentatoren bli kjent med organoidkulturen og passivingen. Selv om protokollen vår er godt tilpasset screeningtilnærminger, bør nybegynnere starte med noen få prøver. Sophie Dulauroy, en ingeniør fra laboratoriet, demonstrerer prosedyren.Etter å ha ofret en 8-til-10-ukers gammel Lgr5-GFP-mus, samle fem til åtte centimeter av jejunum som omfatter regionen mellom tolvfingertarmen og ileum, og legg den i kald DPBS supplert med antibiotika på is. Deretter rengjør tarminnholdet ved å skylle med fem til 10 milliliter kald DPBS som inneholder antibiotika. Deretter bruker du ballspiss saks, åpner tarmen langsgående og bruker tang, overfører vevet til en Petri-tallerken som inneholder kald DPBS med antibiotika.Rist vevet inne i parabolen for å skylle det. Deretter tar du tak i tarmen ved aspirasjon ved hjelp av en pasteurpipette i plast og overfører den til et 15 milliliter rør som inneholder 10 milliliter kalde 10 millimolar EDTA. Snu røret tre ganger og inkuber det på is i 10 minutter.Etter inkubasjonen, overfør vevet i et rør som inneholder 10 milliliter DPBS og virvel i to minutter. Tilsett umiddelbart 10 mikroliter av fraksjonen i en Petri-tallerken og bruk et mikroskop for å vurdere kvaliteten på fraksjonen. Etter to overføringer i DPBS som inneholder rør med to minutters virvel mellom hver overføring, inkuber tarmen i EDTA på is i fem minutter som vist tidligere.Etter tre påfølgende overføringer i rør som inneholder DPBS med tre minutters virveling mellom hver overføring, kombinerer du de beste fraksjonene i et 50 milliliterrør ved å invertere de valgte rørene tre ganger og filtrere gjennom en 70 mikroncellesil. Deretter snurrer du kryptene, kaster supernatanten og forstyrrer pellet mekanisk før du legger til fem milliliter kald DMEM F12. Tell antall krypter som finnes i en 10 mikroliter aliquot manuelt under et mikroskop.Etter telling, spinn kryptene igjen og fjern forsiktig supernatanten. Deretter forstyrrer pellet mekanisk og legger til vekstkulturmedium til røret for å oppnå en konsentrasjon på 90 krypter per mikroliter. Deretter legger du til to volumer ufortynnet kjellermembranmatrise eller BMM for å få en endelig konsentrasjon på 30 krypter per mikroliter og forsiktig pipette suspensjonen opp og ned uten å introdusere luftbobler i blandingen.For strømningscytometrianalyse blandes plate 10 mikroliter av kryptene BMM som en kuppel i midten av hver brønn i en forvarmet rund bunn 96-brønnsplate. Og for avbildning, avsett 10 mikroliter av blandingen som et tynt lag i et forvarmet mikroslide åttebrønnskammer. Etter å ha latt BMM størkne ved romtemperatur i fem minutter, plasser platene i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Etter 15 minutter, tilsett 250 mikroliter vekstmedium i hver brønn, pass på at du ikke løsner BMM, og legg platen i inkubatoren. For å visualisere oksidativt stress ved konfikal mikroskopi, tilsett en mikroliter n-acetylcysteine lagerløsning i de tilsvarende brønnene i mikroslidet åtte brønns kammer belagt med organoider. Etter en times inkubasjon, tilsett en mikroliter tert-butylhydroksydbestandsløsning i de tilsvarende brønnene og inkuber i ytterligere 30 minutter.Deretter legger du til en mikroliter av 1,25 millimolar fortynning av den fluorogene sonden per brønn, etterfulgt av en mikroliter på 1,25 milligram per milliliter Hoechst-løsning. Etter ytterligere 30 minutters inkubasjon, fjern mediet uten å forstyrre BMM og tilsett forsiktig 250 mikroliter varm DMEM uten fenolrød. Bilde organoidene ved hjelp av et konfokalt mikroskop utstyrt med ettermisk kammer og gassforsyning som oppdager den fluorogene sonden.Bruk den positive kontrollen til å sette opp laserintensiteten og tidseksponeringen for ROS-signalet, og kontroller at dette signalet er lavere i den negative kontrollen. Deretter screener du lysbildet med et okular for å identifisere organoidene som uttrykker GFP og justerer laserintensiteten. Sett opp en z-stabel med 25 mikrometer og definer posisjoner for å få et sydd bilde av hele organoiden for å få en del av organoidene som viser ett lag med celler.Tilsett en mikroliter av n-acetylcysteine-lagerløsningen i de negative kontrollbrønnene til den 96-brønns runde bunnplaten som inneholder organoidene. Etter en times inkubasjon, tilsett en mikroliter tert-butylhydroksydbestandsløsning i de tilsvarende brønnene og inkuber i 30 minutter. Deretter bruker du en flerkanals pipette, fjerner mediet uten å forstyrre den vedlagte BMM og overfører det til en annen 96-brønns rund bunnplate.Hold platen til side. Deretter legger du til 100 mikroliter trypsin og bruker en flerkanals pipette, pipette opp og ned fem ganger for å ødelegge BMM. Etter en kort fem minutters inkubasjon, dissosier organoidene ved å pipettere opp og ned en gang til.Snurr platen og kast supernatanten ved å snu platen. Tilsett mediet som tidligere er samlet inn i en annen 96-brønnsplate tilbake i de tilsvarende brønnene og resuspender cellene ved å pipettere opp og ned fem ganger. Deretter legger du til en mikroliter av den fluorogene sonden og inkuberer i 30 minutter.Deretter snurrer du platen igjen og bruker cellene på nytt med 250 mikroliter DAPI-oppløsning. Overfør prøvene i strømningscytometrirør og hold rørene på is. Optimaliser innstillingene for fremover- og sidespredningsspenning på ubegrunnet kontroll og laserspenninger for hver fluorofor ved hjelp av monostained prøver.Deretter bruker du en passende gatingstrategi, samle minst 20 000 hendelser. Representative konfektbilder av ROS-farging og organoider viste at i nærvær av NAC-hemmeren er bare signalet fra de døde cellene i organoidens lumen synlig. I den ikke-behandlede organoiden kan basale ROS-nivåer ses, spesielt i GFP-positive celler, som viser at stamceller produserer høyere ROS enn differensierte celler.GFP-positive celler presenterer et mer signifikant cytoplasmisk signal med induseren i nærvær av den fluorogene sonden, noe som viser at ROS-nivåene øker spesielt i stamceller etter behandling. Flow cytometrianalyse av ROS-produksjon i tarmorganoidene viser at basale ROS-nivåer reduseres etter stimulering med inhibitor og øker etter utfordring med induser. Celler som er forbehandlet med inhibitor og deretter stimulert med induser, presenterer lavere nivåer enn de som stimuleres med induser alene.En lignende analyse av stamceller inngjerdet som GFP-positiv viser en 3,5 ganger reduksjon i ROS-nivå ved inhibitorbehandling og en firedobling ved induserbehandling over ikke-stimulerte celler. Når du prøver denne prosedyren, bør brukerne huske å begrense cellestress under organoid manipulasjon og dissosiasjon. I tillegg bør positive og negative kontroller alltid inkluderes når du analyserer ROS.Etter denne prosedyren kan analysen suppleres med immunfluorescensfarging på faste intakte organoider, cellesortering og genuttrykksanalyse for å få ytterligere innsikt i ROS-regulering. Etter å ha sett denne videoen, bør du vite hvordan du kan vokse murin intestinale organoider, utføre levende avbildningsanalyse av intakte organoider og behandle tarmorganer for strømningscytometrianalyse.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Oppdager, visualisere og kvantifisere generasjon av reaktive oksygen arter i en Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse av oksidativt stress i sebrafisk embryo

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

En protokoll for Lentiviral Transduksjon og Nedstrøms Analyse av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Måling Oksidativt stress Resistance of<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brønners mikrotiterplater

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay som et indirekte mål på Systemisk Oksidativt stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Culturing av organoider fra Intestinal Villi Epithelium Gjennomgår Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Introduksjon Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Sanntidsdeteksjon av reaktiv oksygenartsproduksjon i immunrespons i ris med en kjemiluminescensanalyse

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-dyrking av organoider fra murintestinale krypter og en enkelt stamcelle for organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studere epiteleffekter av tarmbetennelse in vitro på etablerte murinkolonoider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...