Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

Todos os experimentos em animais foram realizados após aprovação do Comitê de Uso do Institut Pasteur e do Ministério da Agricultura francês nº 2016-0022. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capa de cultura de tecido.
1. Preparação de reagentes e materiais para cultivo de organoides intestinais
<ol><li>Para preparar o meio de cultura de crescimento, misturar solução avançada DMEM/F-12 suplementada com 1x glutamina, 1x penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Este trabalho fornece um protocolo passo-a-passo para isolar criptas jejunal murinas, cultuá-las em organoides 3D e analisar ROS em organoides, combinando uma sonda fluorogênica sensível à ROS com imagens de microscopia qualitativa de organoides inteiros e medição quantitativa de ROS usando citometria de fluxo em células únicas após a dissooididade organoidativa.
O primeiro passo crítico neste método é o procedimento de extração de criptas. De fato, a qualidade da preparação da...

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles também podem ser produzidos ativamente por complexos enzimáticos especializados, como os NADPH-Oxidases (NOX) e Dual Oxidases (DUOX), que geram ânion de superóxido e peróxido de hidrogênio1. Ao expressar enzimas antioxidantes e catadores ros, as células podem ajustar finamente seu equilíbrio redox, protegendo assim a homeostase tecidual2. Embora o ROS possa ser altamente tóxico para as células e danificar DNA, proteínas e lipídios, eles são moléculas de sinalização cruciais2. No epitélio intestinal, são necessários níveis de ROS moderados para a proliferação de células-tronco e progenitoras3; altos níveis de ROS levam à sua apoptose4. O estresse oxidativo crônico está ligado a muitas doenças gastrointestinais, como doenças inflamatórias intestinais ou câncer. Como exemplo, em um modelo de camundongo de câncer intestinal orientado por Wnt, a produção elevada de ROS através da ativação de NADPH-oxidases foi considerada necessária para as células cancerosas hiperproliferation5,6. Definir como as células intestinais, em particular as células-tronco, as células-tronco gerenciam o estresse oxidativo e como o ambiente celular pode impactar essa capacidade é essencial para entender melhor a etiologia dessa doença7.
Em um tecido, diferentes tipos celulares apresentam um estado oxidativo basal que pode variar de acordo com sua função e metabolismo e a expressão de diferentes níveis de moléculas oxidantes e antioxidantes4,7. Monitorar a ROS in vivo é muito desafiador. Corantes permeáveis celulares que emitem fluorescência de acordo com seu estado redox foram desenvolvidos para visualizar e medir ros celular em células vivas e animais. No entanto, sua eficácia depende de sua difusão dentro de tecidos vivos e sua leitura rápida, tornando-os difíceis de usar em modelos animais8.
No passado, o estudo do efeito dos compostos na geração ROS foi feito utilizando linhas celulares, mas isso pode não refletir a situação in vivo . O modelo organoide intestinal, desenvolvido pelo grupo de Clevers9, permite o crescimento de células primárias intestinais ex vivo. A cultura de criptas intestinais em matrizes, na presença de fatores de crescimento definidos, leva a estruturas tridimensionais, chamadas organoides (mini-intestino), que reproduzem a organização cript-villus, com células das diferentes linhagens epiteliais que revestem um lúmen interno, e as células-tronco intestinais residentes em pequenas saliências como criptas.
Aqui, aproveitando este modelo, um método simples é descrito para estudar o estresse oxidativo em células intestinais primárias na resolução unicelular, adicionando um corante sensível a ROS comercialmente disponível no meio da cultura organoide.
Leitores de placas são frequentemente usados para detectar a produção de ROS em uma população total. Este protocolo usa citometria de fluxo ou ensaio de imagem para detectar ROS em um determinado tipo de célula com células geneticamente modificadas ou coloração específica de anticorpos. Este trabalho envolve a cultura organoide intestinal do camundongo e a visualização ros por imagem confocal e quantificação por citometria de fluxo. Usando organoides intestinais pequenos derivados de camundongos LGR5-GFP, é possível analisar especificamente o nível de estresse oxidativo em células-tronco intestinais em diferentes tratamentos. Este protocolo pode ser adaptado para testar a influência de moléculas exógenas, como o muramyl-dipeptida derivado da microbiota (MDP)10, no equilíbrio ROS, após estimular organoides com os compostos selecionados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

As espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis essenciais na homeostase intestinal. Ros são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles são produzidos em resposta à infecção ou lesão no nível mucosa, pois estão envolvidos em respostas antimicrobianas e cicatrização de feridas. Eles também são mensageiros secundários críticos, regulando vários caminhos, incluindo crescimento celular e diferenciação. Por outro lado, os níveis excessivos de ROS levam ao estresse oxidativo, que pode ser deletério para as células e favorecer doenças intestinais como inflamação crônica ou câncer. Este trabalho fornece um método simples para detectar ROS nos organoides murina intestinais por imagem viva e citometria de fluxo, usando uma sonda fluorogênica comercialmente disponível. Aqui o protocolo descreve o ensaio do efeito de compostos que modulam o equilíbrio redox em organoides intestinais e detectam níveis de ROS em tipos específicos de células intestinais, exemplificados aqui pela análise das células-tronco intestinais geneticamente rotuladas com GFP. Este protocolo pode ser usado com outras sondas fluorescentes.

Como prova do conceito do protocolo descrito, foram utilizadas as criptas obtidas da linha de camundongos Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, na qual as células-tronco intestinais exibem a expressão GFP do mosaico, que foi estabelecida por Barker et al., para caracterizar células-tronco intestinais10 inicialmente e permitir mapear essas células com base em sua expressão GFP. Assim, é fornecido um modelo para comparar os níveis de ROS em uma população específica do tipo celular em diferentes tratamen...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Este método é uma ferramenta valiosa no campo da biologia celular para avaliar os níveis de ROS celulares em células primárias vivas cultivadas in vitro como organoides usando uma sonda fluorogênica. A principal vantagem dessa técnica é que o ROS pode ser qualitativamente visualizado em organoides intestinais intactos por microscopia e analisado quantitativamente em células dissociadas por citometria de fluxo usando placas de 96 poços. Este método pode ser aplicado a outros modelos organoides e sensores fluorescentes alternativos podem ser usados para analisar diferentes vias celulares.Antes de aplicar este protocolo pela primeira vez, o experimentador deve se familiarizar com a cultura organoide e a passagem. Embora nosso protocolo esteja bem adaptado às abordagens de triagem, os iniciantes devem começar com algumas amostras. Demonstrando o procedimento estará Sophie Dulauroy, engenheira do laboratório.Depois de sacrificar um rato Lgr5-GFP de 8 a 10 semanas de idade, colete de cinco a oito centímetros da região de jejunum entre o duodeno e o íleo, e coloque-o em DPBS frio suplementado com antibióticos no gelo. Em seguida, limpe o conteúdo intestinal lavando com cinco a 10 mililitros de DPBS frios contendo antibióticos. Em seguida, usando uma tesoura de ponta de bola, abra o intestino longitudinalmente, e usando fórceps, transfira o tecido para uma placa de Petri contendo DPBS frios com antibióticos.Agite o tecido dentro do prato para enxaguar. Em seguida, pegue o intestino por aspiração usando uma pipeta pasteur de plástico e transfira-o para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de EDTA fria de 10 mililitros. Inverta o tubo três vezes e incuba-o no gelo por 10 minutos.Após a incubação, transfira o tecido em um tubo contendo 10 mililitros de DPBS e vórtice por dois minutos. Adicione imediatamente 10 microlitros da fração em uma placa de Petri e use um microscópio para avaliar a qualidade da fração. Após duas transferências em DPBS contendo tubos com vórtice de dois minutos entre cada transferência, incubar o intestino em EDTA no gelo por cinco minutos, como demonstrado anteriormente.Após três transferências sucessivas em tubos contendo DPBS com vórtice de três minutos entre cada transferência, combine as melhores frações em um tubo de 50 mililitros invertendo os tubos selecionados três vezes e filtrando através de um coador de células de 70 mícrons. Em seguida, gire as criptas, descarte o supernasce e interrompa a pelota mecanicamente antes de adicionar cinco mililitros de DMEM F12 frio. Conte o número de criptas presentes em uma alíquota de 10 microliter manualmente sob um microscópio.Após a contagem, gire as criptas novamente e remova cuidadosamente o supernatante. Em seguida, interrompa mecanicamente a pelota e adicione cultura de crescimento ao tubo para obter uma concentração de 90 criptas por microliter. Em seguida, adicione dois volumes de matriz de membrana de porão não diluída ou BMM para obter uma concentração final de 30 criptas por microliter e pipetar cuidadosamente a suspensão para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.Para análise da citometria de fluxo, a placa 10 microliters das criptas BMM mistura como uma cúpula no centro de cada poço de uma placa de fundo de 96 poços pré-aquecida. E para a imagem, deposite 10 microliters da mistura como uma camada fina em uma câmara de oito poços de microslide pré-aquecida. Depois de permitir que o BMM se solidifique à temperatura ambiente por cinco minutos, coloque as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após 15 minutos, adicione 250 microliters de meio de crescimento em cada poço, tomando cuidado para não desprender o BMM, e coloque a placa na incubadora. Para visualizar o estresse oxidativo por microscopia confocal, adicione um microliter de solução de estoque de n-acetilcisteína nos poços correspondentes da câmara de oito poços de microslídeo banhada com organoides. Após uma incubação de uma hora, adicione um microliter de solução de estoque de hidroperóxido de tert-butyl nos poços correspondentes e incubar por mais 30 minutos.Em seguida, adicione um microliter da diluição de 1,25 milimilha da sonda fluorogênica por poço, seguido por um microliter de 1,25 miligramas por solução hoechst mililitro. Após outra incubação de 30 minutos, remova o meio sem perturbar o BMM e adicione suavemente 250 microliters de DMEM quente sem vermelho fenol. Imagem os organoides usando um microscópio confocal equipado com uma câmara e fornecimento de gás que detecta a sonda fluorogênica.Usando o controle positivo, configure a intensidade do laser e a exposição de tempo para o sinal ROS, e verifique se este sinal é menor no controle negativo. Em seguida, usando uma ocular, trie o slide para identificar os organoides expressando GFP e ajustar a intensidade do laser. Configure uma pilha z de 25 micrômetros e defina posições para obter uma imagem costurada de todo o organoide para obter uma seção dos organoides mostrando uma camada de células.Adicione um microliter da solução de estoque de n-acetilcisteína nos poços de controle negativos da placa inferior redonda de 96 poços contendo os organoides. Após uma incubação de uma hora, adicione uma solução de estoque de hidroperóxido de tert-butído de microliter nos poços correspondentes e incubar por 30 minutos. Em seguida, usando uma pipeta multicanal, remova o meio sem perturbar o BMM anexado e transfira-o para outra placa inferior redonda de 96 poços.Mantenha este prato de lado. Em seguida, adicione 100 microliters de trippsina e usando uma pipeta multicanal, pipeta para cima e para baixo cinco vezes para destruir o BMM. Depois de uma curta incubação de cinco minutos, dissociar os organoides pipetting para cima e para baixo uma segunda vez.Gire a placa e descarte o supernaspente invertendo a placa. Adicione o meio coletado anteriormente em outra placa de 96 poços de volta aos poços correspondentes e resuspenque as células pipetando para cima e para baixo cinco vezes. Em seguida, adicione um microliter da sonda fluorogênica e incubar por 30 minutos.Em seguida, gire a placa novamente e resuspenque as células com 250 microliters de solução DAPI. Transfira as amostras em tubos de citometria de fluxo e mantenha os tubos no gelo. Otimize as configurações de tensão de dispersão dianteira e lateral em tensões de controle e laser não manchadas para cada fluoróforo usando amostras monotiadas.Em seguida, usando uma estratégia de gating apropriada, coletar um mínimo de 20.000 eventos. Imagens confocal representativas de manchas de ROS e organoides mostraram que, na presença do inibidor do NAC, apenas o sinal das células mortas contidas no lúmen do organoide é visível. No organoide não tratado, os níveis basais de ROS podem ser vistos, particularmente nas células positivas do GFP, provando que as células-tronco produzem ROS maior do que as células diferenciadas.As células positivas de GFP apresentam um sinal citoplasmado mais significativo com o indutor na presença da sonda fluorogênica, demonstrando que os níveis de ROS aumentam particularmente em células-tronco após o tratamento. A análise da citometria de fluxo da produção de ROS nos organoides intestinais mostra que os níveis de ROS basais diminuem após a estimulação com o inibidor e aumentam após desafio com indutor. As células pré-tratadas com inibidor e estimuladas com indutor apresentam níveis mais baixos do que aquelas estimuladas apenas com indutor.Uma análise semelhante em células-tronco fechadas como GFP positivo mostra uma redução de 3,5 vezes no nível ros após o tratamento inibidor e um aumento de quatro vezes após o tratamento de indutores sobre células não estimuladas. Ao tentar esse procedimento, os usuários devem lembrar-se de limitar o estresse celular durante a manipulação e dissociação organoides. Além disso, controles positivos e negativos devem ser sempre incluídos ao analisar ros.Após este procedimento, a análise pode ser complementada pela coloração da imunofluorescência em organoides intactos fixos, classificação celular e análise de expressão genética para obter insights adicionais sobre a regulação ros. Depois de assistir a este vídeo, você deve saber como cultivar organoides intestinais murinas, realizar análises de imagem ao vivo de organoides intactos e processar órgãos intestinais para análise de citometria de fluxo.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Biologia

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Medição de resistência de Estresse Oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Em placas de 96 poços de microtitulação

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Culturação 3D de Organoides do Epitélio Intestinal Villi passando por Dediferente

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Análise da Função Ligase E3 Ubiquitin

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...