Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом Французского национального исследовательского агентства (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).

Все эксперименты на животных проводились после одобрения Комитетом по использованию Института Пастера и Министерством сельского хозяйства Франции No 2016-0022. Все этапы выполняются внутри вытяжки для культивирования тканей.
1. Подготовка реагентов и материалов для культиви...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Эта работа предоставляет пошаговый протокол для выделения мышиных точевидных крипт, культивирования их в 3D-органоиды и анализа АФК в органоидах путем объединения ФТОРогенного зонда, чувствительного к АФК, с качественной микроскопической визуализацией целых органоидов и количествен?...

Активные формы кислорода (АФК) являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они также могут активно продуцироваться специализированными ферментативными комплексами, такими как мембранно-связанные NADPH-оксидазы (NOX) и двойные оксидазы (DUOX), которые генерируют супероксид анион и перекись водорода1. Экспрессируя антиоксидантные ферменты и поглотители АФК, клетки могут тонко настраивать свой окислительно-восстановительный баланс, тем самым защищая тканевый гомеостаз2. Хотя АФК может быть очень токсичным для клеток и повреждать ДНК, белки и липиды, они являются важнейшими сигнальными молекулами2. В кишечном эпителии для пролиферации стволовых и прогениторных клеток требуются умеренные уровни АФК3; высокие уровни АФК приводят к их апоптозу4. Хронический окислительный стресс связан со многими желудочно-кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника или рак. Например, в мышиной модели Wnt-управляемого рака кишечника было обнаружено, что повышенная продукция АФК посредством активации NADPH-оксидаз необходима для гиперпролиферации раковых клеток5,6. Определение того, как кишечные клетки, в частности стволовые клетки, стволовые клетки управляют окислительным стрессом и как клеточная среда может влиять на эту способность, имеет важное значение для лучшего понимания этиологии этого заболевания7.
В ткани различные типы клеток представляют базальное окислительное состояние, которое может варьироваться в зависимости от их функции и метаболизма, а также экспрессии различных уровней молекул окислителя и антиоксиданта4,7. Мониторинг ROS in vivo очень сложен. Клеточные проницаемые красители, которые излучают флуоресценцию в соответствии с их окислительно-восстановительным состоянием, были разработаны для визуализации и измерения клеточного АФК в живых клетках и животных. Однако их эффективность зависит от их диффузии внутри живых тканей и их быстрого считывания, что затрудняет их использование на животных моделях8.
В прошлом изучение влияния соединений на генерацию АФК проводилось с использованием клеточных линий, но это может не отражать ситуацию in vivo . Кишечная органоидная модель, разработанная группой Clevers9, обеспечивает рост первичных клеток кишечника ex vivo. Культивирование кишечных крипт в матрицах, в присутствии определенных факторов роста, приводит к трехмерным структурам, называемым органоидами (мини-кишечник), которые воспроизводят крипто-ворсинчатую организацию, с клетками из разных эпителиальных линий, выстилающих внутренний просвет, и кишечными стволовыми клетками, находящимися в небольших криптоподобных выступах.
Здесь, используя преимущества этой модели, описан простой метод изучения окислительного стресса в первичных клетках кишечника с одноклеточным разрешением путем добавления коммерчески доступного АФК-чувствительного красителя в органоидную культуральную среду.
Пластинчатые считыватели часто используются для обнаружения производства АФК в общей популяции. Этот протокол использует проточную цитометрию или визуальный анализ для обнаружения АФК в определенном типе клеток с генетически модифицированными клетками или специфическим окрашиванием антител. Эта работа включает в себя культуру органоидов кишечника мышей и визуализацию АФК путем конфокальной визуализации и количественной оценки с помощью проточной цитометрии. Используя органоиды тонкого кишечника, полученные от мышей Lgr5-GFP, можно специально проанализировать уровень окислительного стресса в кишечных стволовых клетках при различных методах лечения. Этот протокол может быть адаптирован для проверки влияния экзогенных молекул, таких как мурамил-дипептид (MDP)10, полученных из микробиоты, на баланс АФК, после стимуляции органоидов выбранными соединениями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Активные формы кислорода (АФК) играют важную роль в кишечном гомеостазе. АФК являются естественными побочными продуктами клеточного метаболизма. Они производятся в ответ на инфекцию или травму на уровне слизистой оболочки, поскольку они участвуют в антимикробных реакциях и заживлении ран. Они также являются критическими вторичными мессенджерами, регулирующими несколько путей, включая рост и дифференцировку клеток. С другой стороны, чрезмерные уровни АФК приводят к окислительному стрессу, который может быть вредным для клеток и способствовать кишечным заболеваниям, таким как хроническое воспаление или рак. Эта работа обеспечивает простой метод обнаружения АФК в органоидах кишечных мышей с помощью живой визуализации и проточной цитометрии с использованием коммерчески доступного фторогенного зонда. Здесь протокол описывает анализ влияния соединений, которые модулируют окислительно-восстановительный баланс в кишечных органоидах и обнаруживают уровни АФК в определенных типах клеток кишечника, примером чего является анализ кишечных стволовых клеток, генетически меченных GFP. Этот протокол может использоваться с другими флуоресцентными зондами.

В качестве доказательства концепции описываемого протокола использовались крипты, полученные из мышиной линии Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, в которой кишечные стволовые клетки отображают мозаичную экспрессию GFP, которая была установлена Barker et al., чтобы изначально охарактеризовать кишечные стволовые...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Настоящий протокол описывает способ обнаружения активных форм кислорода (АФК) в органоидах кишечного мыша с использованием качественной визуализации и количественных анализов цитометрии. Эта работа может быть потенциально распространена на другие флуоресцентные зонды для проверки влияния выбранных соединений на АФК.

Анализ окислительного стресса в кишечных органоидах мышей с использованием фторогенного зонда, чувствительного к активным формам кислорода

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Этот метод является ценным инструментом в области клеточной биологии для оценки клеточных уровней АФК в живых первичных клетках, культивируемых in vitro в качестве органоидов с использованием фторогенного зонда. Основным преимуществом данной методики является то, что АФК можно качественно визуализировать в интактных органоидах кишечника с помощью микроскопии и количественно проанализировать в диссоциированных клетках методом проточной цитометрии с использованием 96-луночных пластин. Этот метод может быть применен к другим органоидным моделям, а альтернативные флуоресцентные датчики могут быть использованы для анализа различных клеточных путей.Прежде чем применять этот протокол в первый раз, экспериментатор должен ознакомиться с органоидной культурой и пассажем. Хотя наш протокол хорошо адаптирован к подходам к скринингу, новичкам следует начать с нескольких образцов. Продемонстрировать процедуру продемонстрирует Софи Дюлоруа, инженер из лаборатории.Пожертвовав 8-10-недельной мышью Lgr5-GFP, соберите от пяти до восьми сантиметров тощей кишки, охватывающей область между двенадцатиперстной кишкой и подвздошной кишкой, и поместите ее в холодный DPBS, дополненный антибиотиками на льду. Затем очистите кишечное содержимое, промыв пять-10 миллилитров холодных DPBS, содержащих антибиотики. Затем с помощью шариковых ножниц открыть кишечник продольно и с помощью щипцов перенести ткань в чашку Петри, содержащую холодные DPBS с антибиотиками.Встряхните ткань внутри блюда, чтобы промыть его. Затем захватите кишечник путем аспирации с помощью пластиковой пипетки Пастера и перенесите ее в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров холодной 10-миллимолярной ЭДТА. Переверните трубку три раза и высиживайте ее на льду в течение 10 минут.После инкубации переложите ткань в пробирку, содержащую 10 миллилитров DPBS и вихрь в течение двух минут. Сразу же добавьте 10 микролитров фракции в чашку Петри и используйте микроскоп для оценки качества фракции. После двух переносов в DPBS, содержащих трубки с двухминутным вихрем между каждым переносом, инкубируйте кишечник в ЭДТА на льду в течение пяти минут, как было показано ранее.После трех последовательных переносов в трубках, содержащих DPBS с трехминутным вихрем между каждым переносом, объедините лучшие фракции в 50-миллилитровую трубку, трижды инвертируя выбранные трубки и фильтруя через 70-микронный клеточный сетчатый фильтр. Затем раскрутите крипты, выбросьте супернатант и механически разрушите гранулу, прежде чем добавить пять миллилитров холодного DMEM F12. Подсчитайте количество крипт, присутствующих в 10-микролитровой аликвоте, вручную под микроскопом.После подсчета снова раскрутите склепы и аккуратно удалите супернатант. Затем механически разрушают гранулу и добавляют в трубку культуральную среду для роста, чтобы получить концентрацию 90 крипт на микролитр. Затем добавьте два объема неразбавленной матрицы базальной мембраны или BMM, чтобы получить конечную концентрацию 30 крипт на микролитр и аккуратно пипеткой суспензию вверх и вниз, не вводя пузырьки воздуха в смесь.Для анализа проточной цитометрии пластину 10 микролитров криптЫ BMM смешивают в качестве купола в центре каждой скважины предварительно нагретой круглодонной 96-луночной пластины. А для визуализации нанесите 10 микролитров смеси тонким слоем в предварительно нагретую восьмилуночную камеру микрополощи. Дав BMM затвердеть при комнатной температуре в течение пяти минут, поместите пластины в инкубатор при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа.Через 15 минут добавьте в каждую лунку по 250 микролитров питательной среды, следя за тем, чтобы не отсоединить БММ, и поместите пластину в инкубатор. Для визуализации окислительного стресса с помощью конфокальной микроскопии добавляют один микролитр раствора n-ацетилцистеина в соответствующие скважины микрослайдной восьмилуночной камеры, покрытой органоидами. После часовой инкубации добавляют один микролитр раствора трет-бутилгидропероксида в соответствующие лунки и инкубируют еще 30 минут.Далее добавляют один микролитр 1,25-миллимолярного разведения фторогенного зонда на лунку, а затем один микролитр 1,25 миллиграмма на миллилитр раствора Хохста. После еще одной 30-минутной инкубации удалите среду, не нарушая BMM, и осторожно добавьте 250 микролитров теплого DMEM без фенолового красного цвета. Визуализируйте органоиды с помощью конфокального микроскопа, оснащенного термической камерой и газоснабжением, который обнаруживает флюорогенный зонд.Используя положительный контроль, настройте интенсивность лазера и временную экспозицию для сигнала ROS и проверьте, что этот сигнал ниже в отрицательном контроле. Затем, используя окуляр, экранируйте слайд, чтобы идентифицировать органоиды, экспрессирующие GFP, и отрегулировать интенсивность лазера. Настройте z-стек из 25 микрометров и определите положения, чтобы получить сшитое изображение всего органоида, чтобы получить участок органоидов, показывающий один слой клеток.Добавьте один микролитр раствора n-ацетилцистеина в отрицательные контрольные скважины 96-луночной круглой донной пластины, содержащей органоиды. После часовой инкубации добавляют один микролитр раствора трет-бутилгидропероксида в соответствующие лунки и инкубируют в течение 30 минут. Затем, используя многоканальную пипетку, удалите среду, не нарушая прикрепленный BMM, и перенесите ее на другую 96-луночную круглую нижнюю пластину.Держите эту тарелку в стороне. Затем добавьте 100 микролитров трипсина и, используя многоканальную пипетку, пипетку вверх и вниз пять раз, чтобы уничтожить BMM. После короткой пятиминутной инкубации диссоциируют органоиды, пипетируя вверх и вниз во второй раз.Раскрутите пластину и выбросьте супернатант, перевернув пластину. Добавьте среду, ранее собранную в другой 96-луночной пластине, обратно в соответствующие скважины и повторно суспендируйте ячейки, пипетируя вверх и вниз пять раз. Затем добавьте один микролитр фторогенного зонда и инкубируйте в течение 30 минут.Затем снова раскрутите пластину и повторно суспендируйте ячейки 250 микролитрами раствора DAPI. Перенесите образцы в проточные цитометрические трубки и держите трубки на льду. Оптимизируйте настройки напряжения прямого и бокового рассеяния на неиспорченных контрольных и лазерных напряжениях для каждого флуорофора с помощью моноисокнистых образцов.Затем, используя соответствующую стратегию захвата, соберите минимум 20 000 событий. Репрезентативные конфокальные изображения окрашивания АФК и органоидов показали, что в присутствии ингибитора NAC виден только сигнал от мертвых клеток, содержащихся в просвете органоида. В необработанном органоиде можно увидеть базальные уровни АФК, особенно в клетках, положительных на GFP, доказывая, что стволовые клетки производят более высокий АФК, чем дифференцированные клетки.GFP-положительные клетки представляют более значительный цитоплазматический сигнал с индуктором в присутствии фторогенного зонда, демонстрируя, что уровни АФК особенно увеличиваются в стволовых клетках после лечения. Анализ проточной цитометрии продукции АФК в органоидах кишечника показывает, что базальные уровни АФК снижаются после стимуляции ингибитором и увеличиваются после вызова индуктором. Клетки, предварительно обработанные ингибитором, а затем стимулируемые индуктором, имеют более низкие уровни, чем те, которые стимулируются только индуктором.Аналогичный анализ стволовых клеток, закрытых как GFP положительный, показывает снижение уровня АФК в 3,5 раза при лечении ингибиторами и четырехкратное увеличение при лечении индуктором по сравнению с нестимстилированными клетками. При попытке этой процедуры пользователи должны помнить об ограничении клеточного стресса во время органоидных манипуляций и диссоциации. Кроме того, положительный и отрицательный контроль всегда должны включаться при анализе АФК.После этой процедуры анализ может быть дополнен иммунофлуоресцентным окрашиванием на фиксированных интактных органоидах, сортировкой клеток и анализом экспрессии генов, чтобы получить дополнительную информацию о регуляции АФК. После просмотра этого видео вы должны знать, как выращивать мышиные кишечные органоиды, выполнять анализ неповрежденных органоидов в реальном времени и обрабатывать органы кишечника для анализа проточной цитометрии.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Обнаружение, Визуализация и количественного генерации активных форм кислорода в модельной системе Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Анализ окислительного стресса у эмбрионов данио рерио

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Комет в качестве косвенного измерения системных окислительного стресса

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

В пробирке Анализ функции E3 убиквитин лигазы

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Обнаружение продукции активных форм кислорода в иммунном ответе риса в режиме реального времени с помощью хемилюминесцентного анализа

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-культивирование органоидов из крипт кишечника мышей и одной стволовой клетки для исследования органоидов

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...