Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la agencia nacional de investigación francesa (ANR) subvención 17-CE14-0022 (i-Stress).

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo después de la aprobación del Comité de Uso del Instituto Pasteur y del Ministerio de Agricultura francés n.º 2016-0022. Todos los pasos se realizan dentro de una campana de cultivo de tejidos.
1. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de organoides intestinales
<ol><li>Para preparar el medio de cultivo de crecimiento, mezcle DMEM/F-12 avanzado suplementado con 1x glutamina, 1x solución de penicilina/estreptomicina (...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Este trabajo proporciona un protocolo paso a paso para aislar criptas yeyunales murinas, cultivarlas en organoides 3D y analizar ROS en organoides mediante la combinación de una sonda fluorogénica sensible a ROS con imágenes de microscopía cualitativa de organoides completos y medición cuantitativa de ROS utilizando citometría de flujo en células individuales después de la disociación organoide.
El primer paso crítico en este método es el procedimiento de extracción de criptas. De ...

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo celular. También pueden ser producidos activamente por complejos enzimáticos especializados como las NADPH-Oxidasas (NOX) y las Oxidasas Duales (DUOX) unidas a la membrana, que generan anión superóxido y peróxido de hidrógeno1. Al expresar enzimas antioxidantes y eliminadores de ROS, las células pueden ajustar finamente su equilibrio redox, protegiendo así la homeostasis tisular2. Aunque las ROS pueden ser altamente tóxicas para las células y dañar el ADN, las proteínas y los lípidos, son moléculas de señalización cruciales2. En el epitelio intestinal, se requieren niveles moderados de ROS para la proliferación de células madre y progenitoras3; los niveles altos de ROS conducen a su apoptosis4. El estrés oxidativo crónico está relacionado con muchas enfermedades gastrointestinales, como las enfermedades inflamatorias intestinales o el cáncer. Como ejemplo, en un modelo de ratón de cáncer intestinal impulsado por Wnt, se encontró que la producción elevada de ROS a través de la activación de NADPH-oxidasas era necesaria para la hiperproliferación de las células cancerosas5,6. Definir cómo las células intestinales, en particular las células madre, las células madre gestionan el estrés oxidativo y cómo el entorno celular puede afectar a esta capacidad es esencial para comprender mejor la etiología de esta enfermedad7.
En un tejido, diferentes tipos de células presentan un estado oxidativo basal que puede variar según su función y metabolismo y la expresión de niveles variables de moléculas oxidantes y antioxidantes4,7. El monitoreo de ROS in vivo es muy desafiante. Se han desarrollado colorantes permeables a las células que emiten fluorescencia de acuerdo con su estado redox para visualizar y medir las ROS celulares en células vivas y animales. Sin embargo, su eficacia depende de su difusión en el interior de los tejidos vivos y de su rápida lectura, lo que dificulta su uso en modelos animales8.
En el pasado, el estudio del efecto de los compuestos en la generación de ROS se realizaba utilizando líneas celulares, pero esto puede no reflejar la situación in vivo . El modelo organoide intestinal, desarrollado por el grupo de Clevers9, permite el crecimiento de células primarias intestinales ex vivo. El cultivo de criptas intestinales en matrices, en presencia de factores de crecimiento definidos, conduce a estructuras tridimensionales, llamadas organoides (mini-intestino), que reproducen la organización cripta-vellosidad, con células de los diferentes linajes epiteliales que recubren una luz interna, y las células madre intestinales que residen en pequeñas protuberancias similares a criptas.
Aquí, aprovechando este modelo, se describe un método simple para estudiar el estrés oxidativo en células intestinales primarias a la resolución de una sola célula mediante la adición de un tinte sensible a ROS disponible comercialmente en el medio de cultivo de organoides.
Los lectores de placas se utilizan a menudo para detectar la producción de ROS en una población total. Este protocolo utiliza citometría de flujo o ensayo de imágenes para detectar ROS en un tipo de célula en particular con células modificadas genéticamente o tinción de anticuerpos específicos. Este trabajo involucra el cultivo de organoides intestinales de ratón y la visualización de ROS por imágenes confocales y la cuantificación por citometría de flujo. Utilizando organoides del intestino delgado derivados de ratones Lgr5-GFP, es posible analizar específicamente el nivel de estrés oxidativo en las células madre intestinales en diferentes tratamientos. Este protocolo se puede adaptar para probar la influencia de moléculas exógenas, como el muramilo-dipéptido derivado de la microbiota (MDP)10, en el equilibrio de las ROS, después de estimular los organoides con los compuestos seleccionados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel esencial en la homeostasis intestinal. Las ROS son subproductos naturales del metabolismo celular. Se producen en respuesta a una infección o lesión a nivel de la mucosa, ya que están involucrados en las respuestas antimicrobianas y la cicatrización de heridas. También son mensajeros secundarios críticos, que regulan varias vías, incluido el crecimiento y la diferenciación celular. Por otro lado, los niveles excesivos de ROS conducen al estrés oxidativo, que puede ser perjudicial para las células y favorecer enfermedades intestinales como la inflamación crónica o el cáncer. Este trabajo proporciona un método sencillo para detectar ROS en los organoides murinos intestinales mediante imágenes en vivo y citometría de flujo, utilizando una sonda fluorogénica disponible comercialmente. Aquí el protocolo describe el ensayo del efecto de los compuestos que modulan el equilibrio redox en organoides intestinales y detectan los niveles de ROS en tipos específicos de células intestinales, ejemplificado aquí por el análisis de las células madre intestinales genéticamente marcadas con GFP. Este protocolo se puede utilizar con otras sondas fluorescentes.

Como prueba de concepto del protocolo descrito, se utilizaron las criptas obtenidas de la línea de ratones Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 en la que las células madre intestinales muestran expresión GFP en mosaico, que fue establecida por Barker et al., para caracterizar inicialmente las células madre intestinales10 y permitir mapear estas células en función de su expresión GFP. De este modo, se proporciona un modelo para comparar los niveles de ROS en una población de tipo celular específico en d...

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Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

El presente protocolo describe un método para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) en los organoides murinos intestinales utilizando imágenes cualitativas y ensayos de citometría cuantitativa. Este trabajo se puede extender potencialmente a otras sondas fluorescentes para probar el efecto de compuestos seleccionados en ROS.

Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies reactivas de oxígeno

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Este método es una herramienta valiosa en el campo de la biología celular para evaluar los niveles de ROS celulares en células primarias vivas cultivadas in vitro como organoides utilizando una sonda fluorogénica. La principal ventaja de esta técnica es que las ROS pueden visualizarse cualitativamente en organoides intestinales intactos mediante microscopía y analizarse cuantitativamente en células disociadas mediante citometría de flujo utilizando placas de 96 pocillos. Este método se puede aplicar a otros modelos organoides y se pueden usar sensores fluorescentes alternativos para analizar diferentes vías celulares.Antes de aplicar este protocolo por primera vez, el experimentador debe familiarizarse con el cultivo de organoides y el pasaje. Aunque nuestro protocolo está bien adaptado a los enfoques de detección, los principiantes deben comenzar con algunas muestras. La demostración del procedimiento estará a cargo de Sophie Dulauroy, ingeniera del laboratorio.Después de sacrificar un ratón Lgr5-GFP de 8 a 10 semanas de edad, recolecte de cinco a ocho centímetros de la región que abarca el yeyuno entre el duodeno y el íleon, y colóquelo en DPBS frío suplementado con antibióticos en hielo. A continuación, limpie el contenido intestinal enjuagando con cinco a 10 mililitros de DPBS frío que contenga antibióticos. Luego, usando tijeras de punta de bola, abra el intestino longitudinalmente y, con fórceps, transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga DPBS frío con antibióticos.Agite el pañuelo dentro del plato para enjuagarlo. A continuación, agarre el intestino por aspiración con una pipeta Pasteur de plástico y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de EDTA frío de 10 milimolares. Invierta el tubo tres veces e incube en hielo durante 10 minutos.Después de la incubación, transfiera el tejido en un tubo que contenga 10 mililitros de DPBS y vórtice durante dos minutos. Agregue inmediatamente 10 microlitros de la fracción en una placa de Petri y use un microscopio para evaluar la calidad de la fracción. Después de dos transferencias en DPBS que contienen tubos con vórtice de dos minutos entre cada transferencia, incube el intestino en EDTA en hielo durante cinco minutos como se demostró anteriormente.Después de tres transferencias sucesivas en tubos que contienen DPBS con vórtice de tres minutos entre cada transferencia, combine las mejores fracciones en un tubo de 50 mililitros invirtiendo los tubos seleccionados tres veces y filtrando a través de un colador de células de 70 micras. Luego gire las criptas, deseche el sobrenadante e interrumpa el pellet mecánicamente antes de agregar cinco mililitros de DMEM F12 frío. Cuente el número de criptas presentes en una alícuota de 10 microlitros manualmente bajo un microscopio.Después de contar, gire las criptas nuevamente y retire cuidadosamente el sobrenadante. Luego, interrumpa mecánicamente el pellet y agregue un medio de cultivo de crecimiento al tubo para obtener una concentración de 90 criptas por microlitro. A continuación, agregue dos volúmenes de matriz de membrana basal sin diluir o BMM para obtener una concentración final de 30 criptas por microlitro y pipetee cuidadosamente la suspensión hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.Para el análisis de citometría de flujo, los microlitros de placa 10 de las criptas BMM se mezclan como una cúpula en el centro de cada pozo de una placa de fondo redondo precalentado de 96 pocillos. Y para la obtención de imágenes, deposite 10 microlitros de la mezcla como una capa delgada en una cámara de ocho pocillos de microslídidos precalentados. Después de permitir que el BMM se solidifique a temperatura ambiente durante cinco minutos, coloque las placas en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Después de 15 minutos, agregue 250 microlitros de medio de crecimiento en cada pozo, teniendo cuidado de no separar el BMM, y coloque la placa en la incubadora. Para visualizar el estrés oxidativo por microscopía confocal, agregue un microlitro de solución madre de n-acetilcisteína en los pocillos correspondientes de la cámara de ocho pocillos del microslídeo chapado con organoides. Después de una incubación de una hora, agregue un microlitro de solución madre de hidroperóxido de terc-butilo en los pozos correspondientes e incube durante otros 30 minutos.A continuación, agregue un microlitro de la dilución de 1,25 milimolares de la sonda fluorogénica por pozo, seguido de un microlitro de 1,25 miligramos por mililitro de solución de Hoechst. Después de otra incubación de 30 minutos, retire el medio sin molestar el BMM y agregue suavemente 250 microlitros de DMEM caliente sin rojo fenol. Tome una imagen de los organoides utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara térmica y suministro de gas que detecta la sonda fluorogénica.Usando el control positivo, configure la intensidad del láser y la exposición de tiempo para la señal ROS, y verifique que esta señal sea menor en el control negativo. A continuación, utilizando un ocular, revise la diapositiva para identificar los organoides que expresan GFP y ajustar la intensidad del láser. Configure una pila Z de 25 micrómetros y defina posiciones para obtener una imagen cosida de todo el organoide para obtener una sección de los organoides que muestre una capa de células.Agregue un microlitro de la solución madre de n-acetilcisteína en los pozos de control negativos de la placa inferior redonda de 96 pocillos que contiene los organoides. Después de una incubación de una hora, agregue una solución madre de hidroperóxido de terc-butilo de microlitros en los pozos correspondientes e incube durante 30 minutos. Luego, con una pipeta multicanal, retire el medio sin molestar el BMM conectado y transfiéralo a otra placa inferior redonda de 96 pocillos.Mantenga este plato a un lado. A continuación, agregue 100 microlitros de tripsina y use una pipeta multicanal, pipeta hacia arriba y hacia abajo cinco veces para destruir el BMM. Después de una breve incubación de cinco minutos, disocie los organoides mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo por segunda vez.Gire la placa y deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Agregue el medio previamente recolectado en otra placa de 96 pocillos a los pozos correspondientes y vuelva a suspender las celdas canalizando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. A continuación, agregue un microlitro de la sonda fluorogénica e incube durante 30 minutos.Luego gire la placa nuevamente y vuelva a suspender las células con 250 microlitros de solución DAPI. Transfiera las muestras en tubos de citometría de flujo y mantenga los tubos en hielo. Optimice la configuración de voltaje de dispersión hacia adelante y lateral en el control no manchado y los voltajes láser para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas.Luego, utilizando una estrategia de cierre adecuada, recopile un mínimo de 20, 000 eventos. Las imágenes confocales representativas de la tinción de ROS y los organoides mostraron que en presencia del inhibidor de NAC, solo es visible la señal de las células muertas contenidas en la luz del organoide. En el organoide no tratado, se pueden ver los niveles basales de ROS, particularmente en células GFP positivas, lo que demuestra que las células madre producen ROS más altas que las células diferenciadas.Las células GFP positivas presentan una señal citoplasmática más significativa con el inductor en presencia de la sonda fluorogénica, lo que demuestra que los niveles de ROS aumentan particularmente en las células madre después del tratamiento. El análisis de citometría de flujo de la producción de ROS en los organoides intestinales muestra que los niveles basales de ROS disminuyen después de la estimulación con el inhibidor y aumentan después del desafío con el inductor. Las células pretratadas con inhibidor y luego estimuladas con inductor presentan niveles más bajos que las estimuladas con inductor solo.Un análisis similar en células madre cerradas como GFP positivas muestra una disminución de 3,5 veces en el nivel de ROS en el tratamiento con inhibidores y un aumento de cuatro veces en el tratamiento con inductores sobre las células no estimuladas. Al intentar este procedimiento, los usuarios deben recordar limitar el estrés celular durante la manipulación y disociación de organoides. Además, siempre se deben incluir controles positivos y negativos al analizar ros.Después de este procedimiento, el análisis se puede complementar con tinción de inmunofluorescencia en organoides intactos fijos, clasificación celular y análisis de expresión génica para obtener información adicional sobre la regulación de ROS. Después de ver este video, debe saber cómo cultivar organoides intestinales murinos, realizar análisis de imágenes en vivo de organoides intactos y procesar órganos intestinales para el análisis de citometría de flujo.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

La detección, la visualización y cuantificación de la generación de especies reactivas de oxígeno en un sistema modelo de la ameba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigación

Biología

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Cultivo 3D de organoides del epitelio de las vellosidades intestinales sometidos a desdiferenciación

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Análisis de la función E3 Ubiquitina Ligasa

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Detección en tiempo real de la producción reactiva de especies de oxígeno en la respuesta inmune en el arroz con un ensayo de quimioluminiscencia

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...