Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Detta arbete stöddes av det franska nationella forskningsorganet (ANR) anslag 17-CE14-0022 (i-Stress).

Alla djurförsök utfördes efter godkännande av Institut Pasteur Use Committee och av det franska jordbruksministeriet nr 2016-0022. Alla steg utförs inuti en vävnadskulturhuv.
1. Beredning av reagenser och material för odling av tarmorganoider
<ol><li>För att förbereda tillväxtodlingsmedium, blanda avancerad DMEM/F-12 kompletterad med 1x glutamin, 1x penicillin/streptomycin (P/S) lösning, 10 mM HEPES, 50 ng/mL murin EGF, 20 μg/mL murine Noggin 500 ng/mL mus R-Spondin1 (se ...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Detta arbete ger ett steg-för-steg protokoll för att isolera murine jejunal krypter, odla dem i 3D organoider och analysera ROS i organoider genom att kombinera en ROS-känslig fluorogen sond med kvalitativ mikroskopi imaging av hela organoider och kvantitativ ROS mätning med flöde cytometri på enstaka celler efter organoid dissociation.
Det första kritiska steget i den här metoden är kryptextraheringsproceduren. Faktum är att kvaliteten på kryptberedning är nyckeln till framgångsr...

Reaktiva syrearter (ROS) är naturliga biprodukter av cellulär metabolism. De kan också aktivt produceras av specialiserade enzymatiska komplex som membranbundna NADPH-Oxidaser (NOX) och Dual Oxidases (DUOX), som genererar superoxid anjon och väteperoxid1. Genom att uttrycka antioxidantenzymer och ROS-asätare kan cellerna finjustera sin redoxbalans och därmed skydda vävnadshomeostas2. Även om ROS kan vara mycket giftigt för cellerna och skada DNA, proteiner och lipider, är de avgörande signalmolekyler2. I tarmepitelet krävs måttliga ROS-nivåer för stam- och stamceller spridning3; höga ROS nivåer leder till deras apoptos4. Kronisk oxidativ stress är kopplad till många gastrointestinala sjukdomar, såsom inflammatoriska tarmsjukdomar eller cancer. Som ett exempel, i en musmodell av Wnt-driven tarmcancer, förhöjd ROS produktion genom aktivering av NADPH-oxidaser konstaterades krävas för cancerceller hyperproliferation5,6. Att definiera hur tarmceller, särskilt stamceller, hanterar oxidativ stress och hur cellmiljön kan påverka denna kapacitet är avgörande för att förstå etiologin för denna sjukdom bättre7.
I en vävnad uppvisar olika celltyper ett basalt oxidativt tillstånd som kan variera beroende på deras funktion och ämnesomsättning och uttrycket av olika nivåer av oxidant- och antioxidantmolekyler4,7. Övervakning av ROS in vivo är mycket utmanande. Cellgenomsläppliga färgämnen som avger fluorescens enligt deras redoxtillstånd har utvecklats för att visualisera och mäta cellulär ROS i levande celler och djur. Deras effektivitet beror dock på deras diffusion inuti levande vävnader och deras snabba avläsning, vilket gör dem svåra att använda i djurmodeller8.
Tidigare gjordes studien av effekten av föreningar på ROS-generering med hjälp av cellinjer, men detta kanske inte återspeglar in vivo-situationen . Den intestinala organoidmodellen, utvecklad av gruppen Clevers9, möjliggör tillväxt av intestinala primärceller ex vivo. Kultur av intestinala krypter i matriser, i närvaro av definierade tillväxtfaktorer, leder till tredimensionella strukturer, kallade organoider (mini-gut), som reproducerar crypt-villus-organisationen, med celler från de olika epitelerna som fodrar en inre lumen och tarmstamcellerna som bor i små krypterliknande utskjutningar.
Här, dra nytta av denna modell, beskrivs en enkel metod för att studera oxidativ stress i primära tarmceller vid encellsupplösningen genom att lägga till ett kommersiellt tillgängligt ROS-känsligt färgämne i det organoida odlingsmediet.
Plattläsare används ofta för att upptäcka ROS-produktion i en total population. Detta protokoll använder flödescytometri eller avbildningsanalys för att detektera ROS i en viss celltyp med genetiskt modifierade celler eller specifik antikroppsfärgning. Detta arbete omfattar mus intestinal organoid kultur och ROS visualisering genom confocal imaging och kvantifiering av flöde cytometry. Med hjälp av Lgr5-GFP möss-härledda små intestinala organoider är det möjligt att specifikt analysera nivån av oxidativ stress i intestinala stamceller vid olika behandlingar. Detta protokoll kan anpassas för att testa påverkan av exogena molekyler, såsom mikrobiota-härledd muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, efter att ha stimulerat organoider med de valda föreningarna.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Reaktiva syrearter (ROS) spelar viktiga roller i intestinal homeostas. ROS är naturliga biprodukter av cellmetabolism. De produceras som svar på infektion eller skada på slemhinnan eftersom de är involverade i antimikrobiella svar och sårläkning. De är också kritiska sekundära budbärare, som reglerar flera vägar, inklusive celltillväxt och differentiering. Å andra sidan leder överdrivna ROS-nivåer till oxidativ stress, vilket kan vara skadligt för celler och gynna tarmsjukdomar som kronisk inflammation eller cancer. Detta arbete ger en enkel metod för att upptäcka ROS i intestinala murin organoider genom levande imaging och flöde cytometri, med hjälp av en kommersiellt tillgänglig fluorogen sond. Här beskriver protokollet att analysera effekten av föreningar som modulerar redoxbalansen i intestinala organoider och detekterar ROS-nivåer i specifika tarmcellstyper, exemplifierat här av analysen av tarmstamcellerna genetiskt märkta med GFP. Detta protokoll kan användas med andra fluorescerande sonder.

Som ett bevis på konceptet för det beskrivna protokollet användes de krypter som erhållits från muslinjen Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 där intestinala stamceller visar mosaik GFP-uttryck, som inrättades av Barker et al., för att karakterisera intestinala stamceller10 initialt och tillåta att kartlägga dessa celler baserat på deras GFP-uttryck. Därmed tillhandahålls en modell för att jämföra ROS-nivåer i en specifik celltyppopulation vid olika behandlingar. En ROS-hämmare (NAC) använde...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Detta protokoll beskriver en metod för att upptäcka reaktiva syre arter (ROS) i intestinala murine organoider med kvalitativ avbildning och kvantitativa cytometri analyser. Detta arbete kan potentiellt utvidgas till andra fluorescerande sonder för att testa effekten av valda föreningar på ROS.

Analysera oxidativ stress i Murine Intestinala organoider med hjälp av reaktiva syre arter-känslig fluorogen sond

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Denna metod är ett värdefullt verktyg inom cellbiologi för att bedöma cellulära ROS-nivåer i levande primära celler odlade in vitro som organoider med hjälp av en fluorogen sond. Den största fördelen med denna teknik är att ROS kvalitativt kan visualiseras i intakta intestinala organoider genom mikroskopi och kvantitativt analyseras i dissocierade celler genom flöde cytometri med hjälp av 96-brunnsplattor. Denna metod kan tillämpas på andra organoida modeller och alternativa fluorescerande sensorer kan användas för att analysera olika cellulära vägar.Innan du tillämpar detta protokoll för första gången bör experimenteraren bli bekant med organoidkulturen och passaging. Även om vårt protokoll är väl anpassat till screeningmetoder, bör nybörjare börja med några prover. Sophie Dulauroy, en ingenjör från laboratoriet, demonstrerar proceduren.Efter att ha offrat en 8 till 10 veckor gammal Lgr5-GFP-mus, samla fem till åtta centimeter av jejunum som omfattar regionen mellan tolvfingertarmen och ileum, och placera den i kall DPBS kompletterad med antibiotika på is. Rengör sedan tarminnehållet genom att spola med fem till 10 milliliter kall DPBS som innehåller antibiotika. Använd sedan bollspetssax, öppna tarmen längsgående och använd tång, överför vävnaden till en Petri-maträtt som innehåller kalla DPBS med antibiotika.Skaka vävnaden inuti skålen för att skölja den. Ta sedan tag i tarmen genom strävan med hjälp av en pasteurpipeett av plast och överför den till ett 15 ml rör som innehåller 10 milliliter kall 10 millimolar EDTA. Vänd röret tre gånger och inkubera det på is i 10 minuter.Överför vävnaden i ett rör som innehåller 10 milliliter DPBS och virvel i två minuter efter inkubationen. Tillsätt omedelbart 10 mikroliter av fraktionen i en Petri-maträtt och använd ett mikroskop för att bedöma kvaliteten på fraktionen. Efter två överföringar i DPBS innehållande rör med två minuters virvel mellan varje överföring, inkubera tarmarna i EDTA på is i fem minuter som visats tidigare.Efter tre på varandra följande överföringar i rör som innehåller DPBS med tre minuters virvel mellan varje överföring, kombinera de bästa fraktionerna i ett 50 milliliter rör genom att invertera de valda rören tre gånger och filtrera genom en 70 mikron cellsil. Snurra sedan krypterna, kassera supernatanten och stör pelleten mekaniskt innan du lägger till fem milliliter kall DMEM F12. Räkna antalet krypter som finns i en 10 mikroliter alikvot manuellt under ett mikroskop.Efter att ha räknat, snurra krypterna igen och ta försiktigt bort supernatanten. Avbryt sedan pelleten mekaniskt och tillsätt tillväxtkulturmedium till röret för att få en koncentration av 90 krypter per mikroliter. Lägg sedan till två volymer outspädd källarmembranmatris eller BMM för att få en slutlig koncentration på 30 krypter per mikroliter och rör försiktigt suspensionen upp och ner utan att införa luftbubblor i blandningen.För flödescytometrianalys blandas platta 10 mikroliter av krypterna BMM som en kupol i mitten av varje brunn på en förvärmd rund botten 96-brunnsplatta. Och för avbildning, deponera 10 mikroliter av blandningen som ett tunt lager i en förvärmd mikroslide åtta-brunnskammare. Efter att ha låtit BMM stelna vid rumstemperatur i fem minuter, placera plattorna i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Efter 15 minuter tillsätt 250 mikroliter tillväxtmedium i varje brunn, var försiktig så att du inte lossar BMM och placera plattan i inkubatorn. För att visualisera oxidativ stress genom konfokal mikroskopi, tillsätt en mikroliter av n-acetycystein lagerlösning i motsvarande brunnar i mikroslide åtta-brunn kammaren pläterad med organoider. Efter en timmes inkubation tillsätt en mikroliter av tert-butylhydroperoxidbuljonglösning i motsvarande brunnar och inkubera i ytterligare 30 minuter.Tillsätt sedan en mikroliter av den fluorogena sondens utspädning på 1,25 millimolar per brunn, följt av en mikroliter på 1,25 milligram per milliliter Hoechst-lösning. Efter ytterligare 30 minuters inkubation, ta bort mediet utan att störa BMM och tillsätt försiktigt 250 mikroliter varm DMEM utan fenolrött. Föreställ dig organoiderna med hjälp av ett konfokalt mikroskop utrustat med en termisk kammare och gastillförsel som detekterar den fluorogena sonden.Med hjälp av den positiva kontrollen ställer du in laserintensiteten och tidsexponeringen för ROS-signalen och kontrollerar att denna signal är lägre i den negativa kontrollen. Använd sedan ett okular för att identifiera de organoider som uttrycker GFP och justera laserintensiteten. Sätt upp en z-stack på 25 mikrometer och definiera positioner för att få en sydd bild av hela organoiden för att få en del av organoiderna som visar ett lager av celler.Tillsätt en mikroliter av n-acetytysteinbuljonglösningen i de negativa kontrollbrunnarna på den 96-väl runda bottenplattan som innehåller organoiderna. Efter en timmes inkubation tillsätt en mikroliter tert-butylhydroperoxidbuljonglösning i motsvarande brunnar och inkubera i 30 minuter. Använd sedan en flerkanalig pipett, ta bort mediet utan att störa den bifogade BMM och överför den till en annan 96-väl rund bottenplatta.Håll tallriken åt sidan. Lägg sedan till 100 mikroliter trypsin och använd en flerkanalig pipett, pipetter upp och ner fem gånger för att förstöra BMM. Efter en kort fem minuters inkubation, separera organoiderna genom pipettering upp och ner en andra gång.Snurra plattan och kassera supernatanten genom att vända plattan. Tillsätt mediet som tidigare samlats i en annan 96-brunnsplatta tillbaka i motsvarande brunnar och återanvänd cellerna genom pipettering upp och ner fem gånger. Tillsätt sedan en mikroliter av den fluorogena sonden och inkubera i 30 minuter.Snurra sedan plattan igen och återanvänd cellerna med 250 mikroliter DAPI-lösning. Överför proverna i flödescytometrirör och håll rören på is. Optimera spänningsinställningarna för spänning framåt- och sidospridning på oförstätlig kontroll och laserspänningar för varje fluorofor med hjälp av monostainedprover.Använd sedan en lämplig gating-strategi och samla in minst 20 000 händelser. Representativa konfokala bilder av ROS färgning och organoider visade att i närvaro av NAC-hämmaren är endast signalen från de döda cellerna som finns i lumen i organoiden synlig. I den icke-behandlade organoiden kan de basala ROS-nivåerna ses, särskilt i GFP-positiva celler, vilket bevisar att stamceller producerar högre ROS än differentierade celler.GFP-positiva celler utgör en mer signifikant cytoplasmisk signal med induceraren i närvaro av den fluorogena sonden, vilket visar att ROS-nivåerna ökar särskilt i stamceller efter behandling. Flödescytometrianalys av ROS-produktion i tarmorganoiderna visar att basala ROS-nivåer minskar efter stimulering med hämmare och ökar efter utmaning med inducerare. Celler som förbehandlats med inhibitor och sedan stimuleras med inducerare uppvisar lägre nivåer än de som stimuleras enbart med induceraren.En liknande analys på stamceller som gated som GFP positiva visar en 3,5 gånger minskning av ROS-nivån vid inhibitorbehandling och en fyrfaldig ökning vid inducerarbehandling över icke-stimulerade celler. När du försöker denna procedur, användare bör komma ihåg att begränsa cell stress under organoid manipulation och dissociation. Dessutom bör positiva och negativa kontroller alltid inkluderas vid analys av ROS.Efter denna procedur kan analysen kompletteras med immunofluorescensfärgning på fasta intakta organoider, cellsortering och genuttrycksanalys för att få ytterligare insikter om ROS-reglering. Efter att ha tittat på den här videon bör du veta hur man odlar murin intestinala organoider, utför levande bildanalys av intakta organoider och bearbeta tarmorgan för flödescytometrianalys.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Att upptäcka, Visualisering och kvantifiering Generation av reaktiva syreradikaler i en Amoeba modellsystem

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analys av oxidativ stress i Zebrafish embryon

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Ett protokoll för Lentiviral Transduction och Nedströms Analys av Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Mätning Oxidativ stress Resistans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I 96-brunnars mikrotiterplattor

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet analys som ett indirekt mått på system oxidativ stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-odling av organoider från intestinala Villi Epitel som genomgår dedifferentiering

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analys av E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Realtidsdetektering av reaktiv syreradikalproduktion i immunsvar i ris med en kemiluminescensanalys

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

3D-odling av organoider från murina tarmkrypter och en enda stamcell för organoidforskning

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

Studera epiteleffekterna av tarminflammation in vitro på etablerade murina kolonioider

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...