Name: analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibe 17-CE14-0022 (i-Stress) tarafından desteklendi.

Tüm hayvan deneyleri, Institut Pasteur Kullanım Komitesi ve 2016-0022 sayılı Fransa Tarım Bakanlığı tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm adımlar bir doku kültürü başlığı içinde gerçekleştirilir.
1. Bağırsak organoidlerini kültleme için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Büyüme kültürü ortamını hazırlamak için, 1x glutamin, 1x penisilin/streptomisin (P/S) çözeltisi, 10 mM HEPES, 50 ng/mL murine EGF, 20 μg/mL murine Noggi...

<ol>
	<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article.">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li><li>Holmstr&#246;m, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling.">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li><li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation.">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li><li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+production+and+NF-&#954;B+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation.">ROS production and NF-&#954;B activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li><li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction.">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+in+gastrointestinal+inflammation:+Rescue+Or+Sabotage.">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li><li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species.">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5++intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation.">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li><li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell,+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15.">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li><li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death.">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li><li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides.">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li><li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner.">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li><li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter.">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).</li><li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model.">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

Bu çalışma, murine jejunal mahzenleri izole etmek, 3D organoidler halinde kültürlemek ve ROS'a duyarlı florojenik bir probu tüm organoidlerin nitel mikroskopisi ve organoid ayrışmasını takiben tek hücrelerde akış sitometrisi kullanarak nicel ROS ölçümü ile birleştirerek organoidlerde ROS'u analiz etmek için adım adım bir protokol sağlar.
Bu yöntemin ilk kritik adımı, mahzen çıkarma prosedürüdür. Gerçekten de, mahzenlerin hazırlanmasının kalitesi başarılı o...

Reaktif oksijen türleri (ROS) hücresel metabolizmanın doğal yan ürünleridir. Ayrıca, süperoksit anion ve hidrojen peroksit1 üreten membran bağlı NADPH-Oxidases (NOX) ve Çift Oksidaz (DUOX) gibi özel enzimatik kompleksler tarafından da aktif olarak üretilebilirler. Antioksidan enzimleri ve ROS çöpçülerini ifade ederek, hücreler redoks dengelerini ince bir şekilde ayarlayabilir ve böylece doku homeostazını koruyabilir2. ROS hücreler için oldukça toksik olmasına ve DNA, protein ve lipitlere zarar verebilmesine rağmen, çok önemli sinyal molekülleridir2. Bağırsak epitelinde, kök ve progenitör hücre çoğalması için orta derecede ROS seviyeleri gereklidir3; yüksek ROS seviyeleri apoptozlarına yol açar4. Kronik oksidatif stres, enflamatuar bağırsak hastalıkları veya kanser gibi birçok gastrointestinal hastalıkla bağlantılıdır. Örnek olarak, Wnt güdümlü bağırsak kanserinin bir fare modelinde, NADPH-oksidazların aktivasyonu yoluyla yüksek ROS üretiminin kanser hücrelerinin hiperproliferasyon için gerekli olduğu bulunmuştur5,6. Bağırsak hücrelerinin, özellikle kök hücrelerin, kök hücrelerin oksidatif stresi nasıl yönettiğini ve hücresel ortamın bu kapasiteyi nasıl etkileyebileceğini tanımlamak, bu hastalığın etiyolojisini daha iyi anlamak için gereklidir7.
Bir dokuda, farklı hücre tipleri işlevlerine ve metabolizmalarına ve değişen oksidan ve antioksidan molekül seviyelerinin ifadelerine göre değişebilen bazal oksidatif bir durum sunar4,7. Ros in vivo'nun izlenmesi çok zor. Redoks durumlarına göre floresan yayan hücre geçirgen boyaları, canlı hücrelerde ve hayvanlarda hücresel ROS'yi görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, etkinliği canlı dokuların içindeki difüzyonlarına ve hızlı okumalarına bağlıdır, bu da onları hayvan modellerinde kullanımını zorlaştırır8.
Geçmişte, bileşiklerin ROS üretimi üzerindeki etkisinin incelenmesi hücre hatları kullanılarak yapılmıştır, ancak bu in vivo durumu yansıtmayabilir. Clevers9 grubu tarafından geliştirilen bağırsak organoid modeli, bağırsak birincil hücrelerinin eks vivo büyümesini sağlar. Matrislerdeki bağırsak mahzenleri kültürü, tanımlanmış büyüme faktörlerinin varlığında, kripto-villus organizasyonuni yeniden üreten organoidler (mini bağırsak) adı verilen üç boyutlu yapılara, iç lümeni kaplayan farklı epitel soyundan hücrelere ve küçük mahzen benzeri çıkıntılarda bulunan bağırsak kök hücrelerine yol açar.
Burada, bu modelden yararlanarak, organoid kültür ortamına ticari olarak mevcut bir ROS duyarlı boya ekleyerek birincil bağırsak hücrelerindeki oksidatif stresi tek hücreli çözünürlükte incelemek için basit bir yöntem tanımlanmıştır.
Plaka okuyucular genellikle toplam popülasyonda ROS üretimini tespit etmek için kullanılır. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş hücreler veya spesifik antikor lekeleme ile belirli bir hücre tipinde ROS'yi tespit etmek için akış sitometrisi veya görüntüleme testi kullanır. Bu çalışma fare bağırsak organoid kültürünü ve ros görselleştirmeyi konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi ile nicelemesini içerir. Lgr5-GFP fare türevi küçük bağırsak organoidlerini kullanarak, farklı tedaviler üzerine bağırsak kök hücrelerindeki oksidatif stres seviyesini özellikle analiz etmek mümkündür. Bu protokol, seçilen bileşiklerle organoidleri uyarladıktan sonra mikrobiyota türevli muramil-dipeptid (MDP)10 gibi eksojen moleküllerin ROS dengesi üzerindeki etkisini test etmek için uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12587010</td>
			<td>Stock Concentration: 50x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Stock Concentration: 1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>2028-EG-200</td>
			<td>Stock Concentration: 500 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1967-NG/CF</td>
			<td>Stock Concentration: 100 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine R-spondin1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td>Stock Concentration: 50 &#181;g/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17502048</td>
			<td>Stock Concentration: 100x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &#181;g/mL of streptomycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ball tip scissor</td>
			<td>Fine Science Tools GMBH</td>
			<td>14086-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX&#174; Deep Red Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C10422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-diamidino-2-ph&#233;nylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td>stock at 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 Well chambers</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>458139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Programs and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
			<td>images generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observer.Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opterra (swept-field confocal)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>confocal system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing oxidative stress in murine intestinal organoids using reactive oxygen species-sensitive fluorogenic probe

Reaktif oksijen türleri (ROS) bağırsak homeostazında önemli roller oynar. ROS hücre metabolizmasının doğal yan ürünleridir. Antimikrobiyal yanıtlar ve yara iyileşmesinde rol aldıkları için mukozal düzeyde enfeksiyon veya yaralanmaya yanıt olarak üretilirler. Ayrıca, hücre büyümesi ve farklılaşma da dahil olmak üzere çeşitli yolları düzenleyen kritik ikincil habercilerdir. Öte yandan, aşırı ROS seviyeleri, hücreler için zararlı olabilen ve kronik iltihap veya kanser gibi bağırsak hastalıklarını destekleyen oksidatif strese yol açar. Bu çalışma, bağırsak murine organoidlerindeki ROS'yi canlı görüntüleme ve akış sitometrisi ile, piyasada bulunan florojenik bir prob kullanarak tespit etmek için basit bir yöntem sağlar. Burada protokol, bağırsak organoidlerindeki redoks dengesini modüle eden ve GFP ile genetik olarak etiketlenmiş bağırsak kök hücrelerinin analizi ile örneklenen belirli bağırsak hücre tiplerindeki ROS seviyelerini tespit eden bileşiklerin etkisini test etmeyi açıklamaktadır. Bu protokol diğer floresan problarla kullanılabilir.

Açıklanan protokolün bir kavram kanıtı olarak, Bağırsak kök hücrelerinin Barker ve arkadaşları tarafından kurulan mozaik GFP ekspresyonunun görüntülendiği Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 fare hattından elde edilen mahzenler, başlangıçta bağırsak kök hücrelerini karakterize etmek için kullanıldı10 ve bu hücreleriN GFP ifadelerine göre haritalandırılmasına izin vermek için. Böylece, farklı tedaviler üzerine belirli bir hücre tipi popülasyondaki ROS seviyelerini karşıla...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe at JoVE.com

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Bu yöntem, florojenik bir prob kullanarak in vitro olarak organoid olarak yetiştirilen canlı birincil hücrelerdeki hücresel ROS seviyelerini değerlendirmek için hücresel biyoloji alanında değerli bir araçtır. Bu tekniğin temel avantajı, ROS'un sağlam bağırsak organoidlerinde mikroskopi ile nitel olarak görselleştirilebilmesi ve 96 kuyu plakası kullanılarak akış sitometrisi ile ayrışmış hücrelerde nicel olarak analiz edilebilmesidir. Bu yöntem diğer organoid modellerine uygulanabilir ve farklı hücresel yolları analiz etmek için alternatif floresan sensörler kullanılabilir.Bu protokolü ilk kez uygulamadan önce, deneyci organoid kültürüne aşina olmalı ve geçmelidir. Protokolümüz tarama yaklaşımlarına iyi adapte olmasına rağmen, yeni başlayanlar birkaç örnekle başlamalıdır. Prosedürü gösteren sophie Dulauroy, laboratuvardan bir mühendis.8 ila 10 haftalık bir Lgr5-GFP faresini feda ettikten sonra, duodenum ve ileum arasındaki jejunum kuşatıcı bölgenin beş ila sekiz santimetresini toplayın ve buz üzerinde antibiyotiklerle desteklenmiş soğuk DPBS'ye yerleştirin. Daha sonra, antibiyotik içeren beş ila 10 mililitre soğuk DPBS ile yıkanarak bağırsak içeriğini temizleyin. Daha sonra top ucu makası kullanarak, bağırsağı uzunlamasına açın ve uzunlamasına kullanarak, dokuyu antibiyotiklerle soğuk DPBS içeren bir Petri kabına aktarın.Durulamak için kabın içindeki dokuyu sallayın. Daha sonra, plastik bir Pasteur pipet kullanarak bağırsağı aspirasyonla tutun ve 10 mililitre soğuk 10 milimolar EDTA içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü üç kez ters çevirin ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, dokuyu 10 mililitre DPBS ve girdap içeren bir tüpe iki dakika aktarın. Hemen bir Petri kabına fraksiyonun 10 mikrolitresini ekleyin ve fraksiyonun kalitesini değerlendirmek için bir mikroskop kullanın. DPBS'de her transfer arasında iki dakikalık girdap bulunan tüpler içeren iki transferden sonra, daha önce gösterildiği gibi EDTA'daki bağırsağı buz üzerinde beş dakika kuluçkaya yatırın.Her transfer arasında üç dakikalık girdap bulunan DPBS içeren tüplerde art arda yapılan üç transferin ardından, seçilen tüpleri üç kez ters çevirerek ve 70 mikron hücreli süzgeçten süzerek en iyi fraksiyonları 50 mililitrelik bir tüpte birleştirin. Ardından, beş mililitre soğuk DMEM F12 eklemeden önce mahzenleri döndürün, süpernatantı atın ve peletin mekanik olarak bozulsun. Mikroskop altında manuel olarak 10 mikroliter aliquot'ta bulunan mahzen sayısını sayın.Saydıktan sonra, mahzenleri tekrar döndürün ve üst saltantları dikkatlice çıkarın. Daha sonra peletin mekanik olarak bozulması ve mikroliter başına 90 mahzen konsantrasyonu elde etmek için tüpe büyüme kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra, mikroliter başına 30 mahzenin son konsantrasyonunu elde etmek için iki hacim sulandırılmamış bodrum membran matrisi veya BMM ekleyin ve hava kabarcıklarını karışıma sokmadan süspansiyonu dikkatlice yukarı ve aşağı borulayın.Akış sitometri analizi için, bmm mahzenlerinin plaka 10 mikrolitresi önceden ısıtılmış yuvarlak alt 96 kuyu plakasının her kuyusunun merkezinde bir kubbe olarak karıştırın. Ve görüntüleme için, karışımın 10 mikrolitresini önceden ısıtılmış bir mikroslid sekiz kuyulu haznede ince bir tabaka olarak biriktirin. BMM'nin oda sıcaklığında beş dakika katılaşmasını sağladıktan sonra, plakaları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin.15 dakika sonra, BMM'yi ayırmamaya dikkat ederek her kuyuya 250 mikrolitre büyüme ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Konfokal mikroskopi ile oksidatif stresi görselleştirmek için, organoidlerle kaplanmış sekiz kuyulu mikroslid sekiz kuyulu odanın ilgili kuyularına bir mikroliter n-asetilsistein stok çözeltisi ekleyin. Bir saatlik bir inkübasyondan sonra, ilgili kuyulara bir mikroliter tert-butil hidroperoksit stok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika daha kuluçkaya yatırın.Daha sonra, kuyu başına florojenik probun 1,25 milimolar seyreltilmesinden bir mikrolitre ve ardından mililitre Hoechst çözeltisi başına 1,25 miligramlık bir mikrolitre ekleyin. 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın ve fenol kırmızısı olmadan 250 mikrolitre sıcak DMEM ekleyin. Organoidleri, florojenik probu algılayan bir terik odası ve gaz kaynağı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.Pozitif kontrolü kullanarak, ROS sinyali için lazer yoğunluğunu ve zamana maruz kalmayı ayarlayın ve bu sinyalin negatif kontrolde daha düşük olup olmadığını kontrol edin. Ardından, bir göz merceği kullanarak, GFP'yi ifade eden organoidleri tanımlamak ve lazer yoğunluğunu ayarlamak için slaytı tarayın. 25 mikrometreden oluşan bir z yığını kurun ve organoidlerin bir hücre tabakasını gösteren bir bölümünü elde etmek için tüm organoidin dikişli bir görüntüsünü elde etmek için pozisyonlar tanımlayın.Organoidleri içeren 96 kuyulu yuvarlak alt plakanın negatif kontrol kuyularına n-asetilsistein stok çözeltisinin bir mikroliterini ekleyin. Bir saatlik bir inkübasyondan sonra, ilgili kuyulara bir mikroliter tert-butil hidroperoksit stok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra çok kanallı bir pipet kullanarak, bağlı BMM'yi rahatsız etmeden ortamı çıkarın ve başka bir 96 kuyu yuvarlak alt plakaya aktarın.Bu tabağı bir kenara bırak. Daha sonra, 100 mikrolitre tripsin ekleyin ve çok kanallı bir pipet kullanarak, BMM'yi yok etmek için beş kez pipet yukarı ve aşağı. Beş dakikalık kısa bir inkübasyondan sonra, organoidleri ikinci kez yukarı ve aşağı pipetleyarak ayrıştırın.Plakayı döndürün ve plakayı ters çevirerek süpernatant atın. Daha önce başka bir 96 kuyu plakasında toplanan ortamı ilgili kuyulara geri ekleyin ve hücreleri beş kez yukarı ve aşağı pipetleyarak yeniden biriktirin. Daha sonra, florojenik probun bir mikroliterini ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra plakayı tekrar döndürün ve hücreleri 250 mikrolitre DAPI çözeltisi ile yeniden kullanın. Örnekleri akış sitometri tüplerine aktarın ve tüpleri buzda tutun. Tekli numuneler kullanarak her florofor için ellenmemiş kontrol ve lazer voltajlarında ileri ve yan dağılım gerilimi ayarlarını optimize edin.Ardından uygun bir gating stratejisi kullanarak en az 20.000 olay toplayın. ROS boyama ve organoidlerin temsili konfokal görüntüleri, NAC inhibitörünün varlığında, sadece organoidin lümeninde bulunan ölü hücrelerden gelen sinyalin görülebildiğine göstermiştir. Tedavi edilmeyen organoidde bazal ROS seviyeleri, özellikle GFP pozitif hücrelerinde görülebilir ve kök hücrelerin farklılaştırılmış hücrelerden daha yüksek ROS ürettiğini kanıtlayabilir.GFP pozitif hücreler florojenik prob varlığında indükleyici ile daha önemli bir sitoplazmik sinyal sunarak ros seviyelerinin özellikle tedavi sonrası kök hücrelerde arttığını gösterir. Bağırsak organoidlerinde ROS üretiminin akış sitometrisi analizi, bazal ROS seviyelerinin inhibitör ile stimülasyondan sonra azaldığını ve indükleyici ile meydan okumadan sonra arttığını göstermektedir. inhibitör ile önceden tedavi edilen ve daha sonra indükleyici ile uyarılan hücreler, sadece indükleyici ile uyarılanlardan daha düşük seviyeler sunar.GFP pozitif olarak kapılı kök hücreler üzerinde yapılan benzer bir analiz, inhibitör tedavisi üzerine ROS seviyesinde 3,5 kat azalma ve uyarılmamış hücreler üzerinde indükleyici tedavide dört kat artış göstermektedir. Bu prosedürü denerken, kullanıcılar organoid manipülasyonu ve ayrışması sırasında hücre stresini sınırlamayı unutmamalıdır. Ayrıca, ROS analiz ederken her zaman olumlu ve olumsuz kontroller dahil edilmelidir.Bu prosedürden sonra, ros regülasyonu hakkında ek bilgiler elde etmek için sabit bozulmamış organoidlerde immünofluoresans lekeleme, hücre sıralama ve gen ekspresyon analizi ile analiz tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, murine bağırsak organoidlerini nasıl yetiştireceğinizi, sağlam organoidlerin canlı görüntüleme analizini nasıl gerçekleştireceğinizi ve akış sitometri analizi için bağırsak organlarını nasıl işleyeceğinizi bilmelisiniz.

Research

JoVE Journal

Biology

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Lentiviral İletim ve Bağırsak Organoids Mansabında Analizi için Protokol

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Kemilüminesans Testi ile Pirinçte İmmün Yanıtta Reaktif Oksijen Türleri Üretiminin Gerçek Zamanlı Tespiti

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...