Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

نشكر إنغا وولف على دعمها للبنية التحتية لتكنولوجيا المعلومات ، وفلوريان بيك على الدعم الحسابي ، وأودا إتش شيوتز على القراءة النقدية للمخطوطة. تم توفير التمويل جزئيا من خلال زمالة ألكسندر فون هومبولت للعائدين إلى فيليب س. إردمان وزمالة EMBO طويلة الأجل ALTF 764-2014 إلى فلوريان ويلفلينج. حصلت آنا بيبر على دعم من زمالة بوهرنجر إنجلهايم فوندز للدكتوراه.

<ol>
	<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+tomography:+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail.">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li><li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins.">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-correlative+light+and+electron+microscopy+workflow+for+cryo-focused+ion+beam+milled+adherent+cells.">Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 162, 273-302 (2021).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies.">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li><li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy.">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits.">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li><li>. Scientific volume imaging, Nyquist calculator Available from: <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>. 3DCT Available from: <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021)</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745 (2021).</li><li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae.">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0 (2019).</li><li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology.">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).</li><li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling.">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033 (2020).</li><li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286 (2020).</li><li>. tools3dct Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021)</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>B&#228;uerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions.">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions.">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li><li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crinkling:+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature.">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li><li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images.">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li><li>. Delmic METEOR Available from: <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021)</li><li>. iFLM Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021)</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association.">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li><li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging.">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714 (2021).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms.">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue.">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li><li>Wu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context.">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017 (2015).</li><li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision.">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li><li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins.">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

1. الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يعد تحسين ثقافة الخلية ومعلمات غرق الشبكة أمرا أساسيا لسير العمل هذا. في بداية المشروع ، يجدر استثمار الوقت لتحسين استراتيجيات وضع العلامات ، وتوزيع الخلايا والخرز الائتماني ، واختبار معلمات إعداد الشبكة والنشاف المختلفة. إن العمل مع عينة مجمدة على النحو الأمثل سيسهل بشكل كبير المعالجة النهائية.
بالنسبة لأي تجربة TEM ، يلزم أخذ عينات زجاجية. بالنسبة لخلايا الثدييات الكبيرة مثل HeLa، يفضل استخدام 1-2 خلية لكل مربع شبكي، ولكن قد تظل الخلايا زجاجية بكثافة أعلى. اختياريا ، يمكن تحسين التزجيج في خلايا الثدييات (على سبيل المثال ، HEK293 ، HeLa) عن طريق احتضانها ب 2.5-10٪ (v / v) من الجلسرين المضاف إلى وسط الاستزراع قبل 10 دقائق من الانخفاض23. إذا كان ذلك متاحا ، يمكن استخدام الزخرفة الشبكية لضمان وضع الخلايا وتوزيعها بشكل مثالي ، وبالتالي تحسين التزجيج والارتباط اللاحق24.
بينما يمكن تحديد خلايا معينة أثناء سير العمل ، فإن عددا قليلا جدا من الخلايا التي تظهر الميزة البيولوجية ذات الأهمية سيقلل بشكل كبير من الإنتاجية الإجمالية. لتحسين الارتباط في الخلايا الإيجابية POI ، يجب استخدام الفلوروفورات الساطعة بما فيه الكفاية. هذا مهم بشكل خاص في مستويات التعبير الذاتية. وجدنا أنه في ظل ظروف التبريد ، غالبا ما كان أداء mVenus أفضل من EGFP نظرا لزيادة سطوعه25 والتحول الصوتي ، مما يجعله مناسبا لإعدادات مرشح GFP القياسية في ظل ظروف التبريد26. بالنسبة للهياكل المستهدفة غير الشبيهة بالنقطة ، يجب أيضا مراعاة المفاضلة بين الطول الموجي ودقة التوطين (حد حيود آبي).
يتطلب الارتباط الفعال 3D أيضا أن تكون الشبكات مستقرة ميكانيكيا ويتم التعامل معها بعناية فائقة. بينما يمكن استخدام شبكات الذهب أو النحاس القياسية مع دعم الكربون ، يمكن زيادة معدل النجاح بشكل كبير باستخدام أفلام SiO2 أكثر صلابة اعتمادا على المشروع. ومع ذلك ، لم يتم بعد تحديد ما إذا كان (أ) الاستقرار الميكانيكي أو (ب) مطابقة معاملات التمدد الحراري (الركيزة مقابل الفيلم) لتقليل التجاعيدبالتبريد 27 ، هو العامل الأكثر أهمية لنجاح الارتباط ثلاثي الأبعاد. علاوة على ذلك ، لالتقاط شبكات Au الهشة ، يمكن استخدام الأطباق المطلية بالبولي ثنائي ميثيل سيلوكسان5.
بالإضافة إلى ضمان استقرار العينة، يعد الاختيار الدقيق لمعلمات التصوير FLM ضروريا للحصول على مداخن مضان عالية الجودة مناسبة للاستهداف الأمثل أثناء طحن FIB. في هذا الصدد ، ينصح أيضا باختبار تقنيات مختلفة لتقليل التشويش28 أو إزالة الالتفاف على بيانات FLM ، لأنها قد تحسن بشكل كبير من توطين الإشارات الائتمانية والخلوية. عند ربط إشارة التألق بصور FIB-SEM ، من المهم أخذ عينات جيدة من الخرز الائتماني. يجب أن تكون موزعة بشكل جيد حول الخلايا وربما على ارتفاعات z مختلفة. من الممارسات الجيدة أيضا التحقق من اتساق الارتباط عن طريق التحقق من المواضع المتوقعة مقابل الفعلية للخرز التي تم استبعادها عمدا من النموذج الائتماني ولكن يمكن ربطها بوضوح بالعين. يجب أيضا مراعاة قيم RMSE الخاصة ب 3DCT دائما للتحقق من اتساق التسجيل.
نظرا لأن ترسب المواد المطحونة والمياه المتبقية من غرفة FIB-SEM (أي إعادة التلوث) يزيد من سمك الصفيحة الفعال عن طريق إضافة مادة غير متبلورة إلى كلا جانبيها ، فإن الاحتفاظ بالصفائح المطحونة بدقة في المجهر لفترة طويلة يقلل بشكل عام من جودة بيانات TEM بسبب أحداث تشتت الإلكترون الإضافية. وفقا لذلك ، غالبا ما يتم إجراء الطحن بطريقة من خطوتين: أولا ، يتم طحن جميع المواضع تقريبا (أي إلى حوالي 800 نانومتر) ، ثم ناعما (إلى ~ 150-250 نانومتر) ، ويتم تفريغ الشبكة على الفور بعد اكتمال الصفيحة الأخيرة. ومع ذلك ، يمكن تحقيق نجاح أفضل في الارتباط من خلال معالجة المواقف ذات الاهتمام بطريقة الموقع ، وبالتالي إجراء طحن خشن ودقيق على نفس الصفيحة مباشرة بعد بعضها البعض لأن هذا لا يترك وقتا للانحناء أو التشوه. ومع ذلك ، فإن هذا يقلل من الحد الأقصى لعدد الصفائح التي يمكن إنتاجها لكل شبكة اعتمادا على معدل إعادة تلوث النظام. بمعدل 20 نانومتر / ساعة ، يتم إنتاج 4-6 صفائح في غضون 1-1.5 ساعة.
ستؤدي حركة الشبكة بأكملها أو الصفائح المطحونة الخشنة >300 نانومتر إلى ارتباط ضعيف أو غير ناجح (انظر أيضا القيود التي تمت مناقشتها أدناه). لذلك يجب فحصه بانتظام ، على سبيل المثال ، من خلال مقارنة صور IB قبل وأثناء وبعد طحن FIB. يجب التخلص من المواقع التي تظهر حركة كبيرة (>300 نانومتر). تحسين تحضير العينة (أي اختيار نوع الشبكة وكثافة الخلية ومعلمات الغطس ؛ انظر قسم البروتوكول 1) واستراتيجية الطحن لتجنب هذه الحركات. يمكن تقليل انحناء الصفيحة بشكل كبير عن طريق الطحن في الموقع كما هو موضح في الخطوة 3.6 وتقليل عرض الصفيحة. كما ذكرنا من قبل ، في حين تم تصميم تخفيضات تخفيف التوتر15 لتقليل انحناء الصفيحة ، فإنها غالبا ما تؤدي إلى حركة منسقة للصفائح غير المنفصلة ، وبالتالي تمنع الارتباط بشكل فعال. يمكن استخدام أنظمة FLM المتكاملة لحل هذه المشكلة.
2. التعديلات وحل المشاكل من الطريقة
ينصح بشدة بإجراء توصيف شامل للعينة في تصوير الخلايا الحية قبل الانتقال إلى ظروف التبريد. يمكن أن يؤدي تحسين العينات الخلوية ومخططات العلاج ومعرفة نوع الإشارة المتوقعة قبل الدخول في سير العمل بالتبريد إلى تحسين معدل نجاحها بشكل كبير.
في سير العمل المعروض هنا ، يتم استخدام مجهر مضان مستقل مع مرحلة التبريد لتصوير العينات ، يليه نقل الشبكات إلى مجهر الحزمة الأيونية المركزة. ومع ذلك ، فقد تم اختباره على الأنظمة التي يتم فيها دمج مجهر مضان في غرفة FIB-SEM ، وبالتالي لا يلزم نقل عينة للحصول على صور مضان29،30،31. باستخدام مثل هذه الأنظمة المتكاملة ، يمكن تصوير المواضع ذات الأهمية أثناء وبعد طحن FIB للتحقق من وجود إشارة مضان الهدف دون زيادة خطر تلويث الصفائح النهائية. ومع ذلك ، من المهم أن نضع في اعتبارنا المعلمات البصرية للمجاهر المستخدمة ، على سبيل المثال ، فإن هدف NA المنخفض سيحد من الدقة التي يمكن بها تحديد موقع الخرز الإيماني وإشارات الهدف. ومع ذلك ، ستساعد إعدادات FLM المدمجة أيضا على التعامل بشكل أفضل مع التشوهات الطفيفة للشبكات والصفائح ، حيث يمكن تحديث مكدسات FLM باستمرار ومقارنتها بمناظر SEM و IB الحديثة.
كبديل للتصوير الفلوري للصفائح بين طحن FIB والحصول على بيانات TEM ، يمكن استخدام ارتباط ما بعد TEM للتحقق من الموضع الصحيح وطحن الصفائح 5,6.
خلال جميع خطوات سير العمل المترابط، ولكن بشكل خاص أثناء TEM، يوصى بإنشاء تراكب لبيانات التألق المتوقعة على صور FIB-SEM/TEM. تساعد طرق عرض CLEM الكلاسيكية هذه على فهم جزء الخلايا الموجود داخل الصفائح بشكل أكثر حدسية. يعمل هذا أيضا كفحص مفيد للعقل للتحقق من دقة الارتباط.
3. حدود الطريقة
يتطلب نهج FIB المترابط 3D عينات يمكن تزويدها بالخرز الائتماني. وفقا لذلك ، تقتصر هذه الطريقة حاليا على الشبكات المجمدة للغطس. بالنسبة لعينات الضغط العالي (HPF) المجمدة (الأنسجة) ، في الوقت الحاضر ، يمكن إجراء ارتباطات 2D-2D فقط. من المحتمل أن تكون العلامات الإيمانية الداخلية (على سبيل المثال ، العضيات ، قطرات الدهون الملطخة) حلا لهذه المشكلة32,33. يعتمد معدل نجاح الارتباط النهائي على العديد من العوامل ، بما في ذلك جودة العينة ، وإعداد الفحص المجهري الفلوري ، وسمك الصفيحة ، وحجم الهيكل المستهدف. تقدر دقة الارتباط باستخدام نهج التسجيل ثلاثي الأبعاد الموصوف في حدود 200-300 نانومتر على صورة IB النهائية ، والتي تتوافق تقريبا مع السماكة النموذجية للصفائحالمطحونة FIB 7. وبناء على ذلك، سيكون من الصعب استهداف الهياكل الخلوية الأصغر بكثير من ذلك في الوقت الحاضر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحركة المفرطة في موقع الطحن (>300 نانومتر) تقلل أيضا من دقة الارتباط ، وهي مشكلة يمكن معالجتها باستخدام إعدادات FLM المدمجة في أدوات FIB / SEM. يجب استبعاد الصفائح التي تظهر تشوها قويا أو انحناءا أثناء الطحن ، على أي حال ، من سير عمل المصب.
بشكل عام ، التصوير الفلوري بالتبريد محدود حاليا بمعيار حيود آبي. مع المزيد من التطبيق الروتيني (والتسويق) لطرق cryo-FLM فائقة الحل ، قد يصبح الاستهداف الأكثر دقة للهياكل الخلوية ممكنا ، خاصة عند دمجها في FIB / SEM للتشغيل أثناء التنقل.
4. أهمية الطريقة
خاصة بالمقارنة مع التقنيات غير المستهدفة وما بعد الارتباط ، يسمح نهج طحن FIB المرتبط ب 3D باختيار المواضع المناسبة قبل خطوة TEM المستهلكة للوقت والموارد. وبالتالي ، فإنه يتيح جمع البيانات وتخطيط المشاريع بشكل أكثر كفاءة. علاوة على ذلك ، تضيف بيانات التألق المترابطة طبقة من المعلومات التي يمكن أن تكون حاسمة لتفسير الصور المقطعية ولدمج نتائج cryo-ET في مشاريع متعددة النطاقات ، خاصة عند التعامل مع مجموعات البروتين غير المهيكلة أو تلك الصغيرة جدا لمطابقة القوالب ومتوسط التصوير المقطعي الفرعي.
5. الأهمية والتطبيقات المستقبلية المحتملة
بالاقتران مع تدفقات العمل المتقدمة مثل الرفع بالتبريد من عينات HPF 34,35 ، وحجم cryo-FIB-SEM36 والتصوير الفلوري فائق الدقة26،37،38،39 ، يوفر إعداد الصفيحة المستهدف ثلاثي الأبعاد إمكانية ليس فقط تشريح العمليات البيولوجية في الخلايا المعزولة ولكن أيضا لجعل عينات الأنسجة والمرضى في متناول طحن FIB والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. على هذا النحو ، سيسمح بتشريح العمليات المرضية بدقة عالية وبالتالي يكون لبنة أساسية نحو خزعة على المستوى النانوي.

يسمح طحن الحزمة الأيونية المركزة بإعداد عينات بيولوجية رقيقة من العينات الثابتة بالتبريد دون المشاكل المرتبطة عادة بالمقاطع الميكانيكية مثل علامات السكين والتحف الانضغاطية1. عند إقرانه بالتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد ، يتيح طحن FIB دراسات بيولوجية عالية الدقة للتشكل الخلوي وتحديد بنية المعقدات الجزيئية مباشرة من داخل الخلايا بدقة دون نانومتر2،3،4. في حين أن الأنواع الوفيرة ، مثل الريبوسومات ، توجد بسهولة في صفائح FIB المقطوعة بشكل عشوائي ، فإن العديد من العمليات الخلوية تعتمد على التمركز المشترك للعديد من المجمعات أو يتم توطينها في مواقع محددة داخل الخلية. وبالتالي ، فإن الاستهداف الفعال مطلوب حتى لا تفقد الميزة البيولوجية ذات الأهمية أثناء عملية الطحن وتقتصر على الضربات العشوائية. لذلك من الضروري اتباع نهج مترابط يجمع بين البيانات من المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) -FIB ومجهر الضوء الفلوري بالتبريد (FLM). في حين أنه من الممكن حذف الارتباط الأولي والجمع بين بيانات FLM و cryo-ET فقط بعد الحصول على TEM 5,6 ، فإن طحن الحزمة الأيونية المركزة الموجهة بالفلورة يتيح اختيارا دقيقا لمنطقة الطحن مسبقا ، مما يؤدي إلى الحصول على بيانات أكثر كفاءة. منذ تصورها7 ، كان تطبيق طحن FIB المرتبط ب 3D في الدراسات البيولوجية محدودا حتى أبلغنا مؤخرا عن تحديد حجرة جديدة مفصولة عن الطور السائل السائل (LLPS) في الخميرة باستخدام هذه التقنية8.
الموصوف هنا هو بروتوكول مجهر ضوئي وإلكتروني معمم مرتبط بالتبريد 3D (CLEM) ، والذي يمكن استخدامه لدراسة مجموعة واسعة من العينات التي تتراوح من البكتيريا إلى خلايا الخميرة والثدييات. بينما تم إجراء التجارب باستخدام مجموعة معينة من الأدوات ، فإن الخطوات الفردية ليست مرتبطة بأجهزة معينة ويمكن نقلها بسهولة إلى أنظمة أخرى كامتداد للبروتوكولات الحالية 3,5. يتم توفير قائمة بالمعدات المختبرة والإعدادات المقترحة في جدول المواد والجدول 1. الخطوات الأربع الرئيسية لخط الأنابيب هي (1) تحضير العينة ، (2) توطين الميزات ذات الأهمية بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، (3) طحن الحزمة الأيونية المركزة المرتبطة ب 3D ، و (4) توطين الهياكل المستهدفة للحصول على بيانات cryo-ET على الصفائح في المجهر الإلكتروني للإرسال بالتبريد (الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

أصبح التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) الطريقة المفضلة للتحقيق في البنية الخلوية والمجمعات الجزيئية في حالتها الأصلية المجمدة المائية. ومع ذلك ، يتطلب cryo-ET أن تكون العينات رقيقة بما يكفي لعدم تشتيت أو منع حزمة الإلكترون الساقط. بالنسبة للعينات الخلوية السميكة ، يمكن تحقيق ذلك عن طريق طحن الحزمة الأيونية المركزة بالتبريد (FIB). يصف هذا البروتوكول كيفية استهداف مواقع خلوية محددة أثناء طحن FIB باستخدام نهج 3D المترابط ، والذي يجمع بين بيانات الفحص المجهري الفلوري ثلاثي الأبعاد مع معلومات من المجهر الإلكتروني الماسح FIB. باستخدام هذه التقنية ، يمكن استهداف الأحداث والهياكل الخلوية النادرة بدقة عالية وتصورها بدقة جزيئية باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-TEM).

يوفر البروتوكول جولة في خط الأنابيب المستخدم لاكتشاف رواسب البروتين الداخلي المعتمدة على مجال EH 1 (Ede1) وتدهورها وحبسها في أجسام الالتهام الذاتي8. END عبارة عن حجرة مفصولة بالطور السائل السائل في S. cerevisiae ، والتي تخزن مجموعة متنوعة من البروتينات المشاركة في التكاثر الخلوي بوساطة clathrin-(CME) بعد فشل الأحداث الداخلية. أحد مكوناته الرئيسية هو Ede1 ، والذي يتضاعف كمكون CME وكمستقبل انتقائي للالتهام الذاتي لتدهور حجرة LLPS الجديدة هذه. وفقا لذلك ، تم استخدام اندماج EGFP ل Ede1 (EGFP-Ede1) تحت سيطرة محفز نازعة هيدروجين الكحول (ADH) لتصور ENDs لأن التعبير المفرط ل Ede1 يتداخل مع المراحل المبكرة من التداخل الخلوي وبالتالي يحفز بشكل أساسي LLPS.
على شبكة مجمدة الغطس مع خلايا الخميرة EGFP-Ede1 المفرطة التعبير وعلامات إيمانية 1 ميكرومتر ، تم اختيار خمسة مواضع لاكتساب مكدس FLM في قناة GFP (الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ ؛ الشكل 6 أ TFS المشاهدة. وضع متحد البؤر ، حجم خطوة تركيز 300 نانومتر ، نطاق 10 ميكرومتر). تم نقل الشبكة إلى أداة FIB (Quanta 3D FEG) ، وتم تحديد مربعات الشبكة التي تم الحصول على مكدسات FLM من أجلها من خلال إجراء ارتباط 2D-2D لمحات عامة عن شبكة التألق و SEM (قارن الخطوة 3.2).
لكل مربع من المربعات المختارة ، تم التقاط صور الحزمة الأيونية بتيار منخفض (10 pA ، تكبير 1200x) ، وتم تسجيل المواضع الائتمانية المقابلة في 3DCT. بعد اختيار المواضع ذات الميزة البيولوجية ذات الأهمية وملاءمة موقعها ثلاثي الأبعاد داخل مكدس FLM ، تم تطبيق التحويل الذي تم العثور عليه على مواقع END المفترضة ، وتم اختيار مواقع تحضير الصفيحة (الشكل 6B). تم استخدام شعاع FIB يميل بمقدار 11 درجة بالنسبة إلى سطح الشبكة في الأمثلة الموضحة هنا (45 درجة مكوك FIB قبل الإمالة ؛ إمالة المرحلة 18 درجة). تم نقل مواقع الاهتمام ، وتم رسم أنماط FIB يدويا (الشكل 6D) عن طريق قياس مسافة المواضع المتوقعة بالنسبة للمعالم البارزة في صورة FIB (على سبيل المثال ، الثقوب ، والتلوث الجليدي ، والخرز الائتماني). تم تقييم دقة التسجيل عن طريق الترك المتعمد للخرز الذي يمكن تحديده بوضوح في صورة FLM و IB ، ثم مقارنة مواقعها الفعلية والمتوقعة في عرض الحزمة الأيونية (على سبيل المثال ، الماس في الشكل 6B ، C). وجد أن ارتباط المربع الموضح في الشكل 6C دقيق (أي أن الموضع المتوقع لمواضع حبة FLM يتطابق تماما مع موقع IB المقابل لها وأبلغت 3DCT عن قيم RMSE فرعية البكسل للتسجيل). وهكذا ، تم قطع الصفائح في المواضع المتوقعة (الموقع ب) وطحنها بدقة إلى سمك ~ 200 نانومتر (إزاحة النمط النهائي).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> الشكل 6: النتائج التمثيلية للاستهداف الارتباطي ثلاثي الأبعاد لرواسب البروتين الداخلي (END) في الخميرة. (أ) نظرة عامة على SEM للشبكة قبل الطحن. تشير المربعات الملونة إلى مربعات الشبكة التي تم أخذ مداخن مضان لها مسبقا. (B-C) ارتباط 3D في مربع الشبكة. بعد تسجيل العديد من الخرز الإيماني المقابل (الصناديق الملونة) في بيانات FLM (B ، كما هو موضح هنا كإسقاط أقصى كثافة) وصورة الحزمة الأيونية (C) ، تم التحقق من دقة تسجيل 3D من خلال التنبؤ بموضع الخرزة المشار إليها مع الماس. بعد ذلك ، تم التنبؤ بمواقع إشارة الهدف (الدوائر الحمراء) في عرض الحزمة الأيونية لموقعين محتملين للطحن. (د) تكبير الموقع B الذي يوضح المواضع المتوقعة لثلاث نقاط مستهدفة (دوائر حمراء) وأنماط الطحن الأولية (المربعات الصفراء). كان من المتوقع أن تكون نقطة مضان رابعة أقل بكثير من النقاط الأخرى وبالتالي لم يتم استهدافها أثناء الطحن (الدائرة الرمادية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد نجاح طحن FIB ونقل الشبكة إلى المجهر الإلكتروني للإرسال بالتبريد (يعمل Titan Krios عند 300 كيلو فولت ومجهز بكاشف الإلكترون المباشر Gatan K2 ومرشح طاقة Bioquant) ، تم تسجيل نظرة عامة على الشبكة في SerialEM واستخدامها لتحديد موقع المربعات مع الصفائح. لكل صفيحة ، تم الحصول على صور نظرة عامة ، وتم تسجيل بيانات FLM في 3DCT (3D-2D) باستخدام الخرز الائتماني المقابل. ثم تم التنبؤ بمواقع السمات البيولوجية ذات الأهمية (الشكل 7 أ) باستخدام التحويل المحسوب من الخرز الائتماني. تم خياطة لمحات عامة عن الصفيحة المسجلة بتكبير أعلى ، وارتبطت المواقع ذات الأهمية باستخدام معالم مرئية بوضوح (على سبيل المثال ، الخرز الائتماني). بدلا من ذلك ، يمكن إنتاج لمحات عامة CLEM الكلاسيكية في برامج مختلفة10,12.
بناء على الارتباط ، تم العثور على أربعة مواقع محتملة للحصول على التصوير المقطعي للصفائح الموضحة في الشكل 7 أ. ومع ذلك ، يتضمن هذا أيضا موقعا لم يتم استهدافه أثناء طحن FIB المرتبط ب 3D (قارن الشكل 6D ؛ الدائرة الرمادية) وموقعا محظورا بسبب تلوث الجليد (الشكل 7 ؛ الصناديق الرمادية). وفقا لذلك ، لا يمكن تسجيل التصوير المقطعي إلا لموقعين (الشكل 7 ب). بشكل عام ، تم تحقيق نجاح ارتباط بنسبة ~ 75٪ ، أي الصفائح التي نجت من النقل إلى هياكل TEM و END في المواقع المتوقعة ، (12 موقعا مرتبطا). بعد إعادة بناء التصوير المقطعي والتجزئة ومطابقة القالب ، يمكن تصور هياكل END الفردية في سياقها الأصلي (الشكل 7C ، D). وهذا يشمل الشبكة الإندوبلازمية المحطمة (ER) المحيطة ب END ، وقطرات الدهون التي تتلامس أحيانا ، والريبوسومات ، والتي يتم استبعادها من حجرة LLPS. مجتمعة ، يوضح هذا كيف يمكن لطحن FIB المترابط 3D أن يوفر معلومات على المستوى الجزيئي للعمليات البيولوجية النادرة من الخلايا السليمة.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> الشكل 7: النتائج التمثيلية لتصور END باستخدام cryo-ET. (أ) يمكن بسهولة ربط نظرة عامة منخفضة التكبير TEM لموقع الطحن الموضح في الشكل 6 بإسقاط الكثافة القصوى FLM (الشكل 6B) لتحديد السمات البيولوجية ذات الأهمية (الصلبان الحمراء). (ب) في الخطوة الثانية، يمكن ربط عرض تكبير أعلى (مخيط)، ويتم إعداد مواضع لاقتناء التصوير المقطعي (المربعات الصفراء). تم تجاهل المواقع الناتجة عن إشارة خارج الطائرة (المربع الرمادي ، قارن الشكل 6D). (ج-د) باستخدام نهج FIB المترابط 3D ، يمكن تصور رواسب البروتين الداخلي (END) في بيئتها الأصلية. يمكن تحديد وتصور تراكيب مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER) والريبوسومات والأغشية وقطرات الدهون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>إعدادات منظف البلازما</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>هاريك منظف البلازما PDG-3XG :</td>
			<td colspan="3">تردد الراديو: "HI" ، 30 ثانية ؛ N2 البلازما</td>
		</tr><tr><td>إعدادات المكبس</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS فيتروبوتعضو الكنيست الرابع:</td>
			<td colspan="3">رطوبة 100٪ قوة اللطخة = 8 ؛ وقت اللطخة = 10 ثوان ؛ وقت الانتظار 0 ثانية ؛ (يجب أن يعمل هذا مع معظم الخلايا المعلقة والملتصقة)</td>
		</tr><tr><td>مواقع وتوقيتات FIB GIS</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>كوانتا 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">الميل = 0 ، الدوران = -180 ، موضع Z = 13.5 ، نقطة ضبط درجة الحرارة = 26.15 درجة ، الوقت = 8 ثوان</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">الميل = 0 ، الدوران = -180 ، موضع Z = 9.8 ، نقطة ضبط درجة الحرارة = 28 درجة مئوية ، الوقت = 7 ثوان</td>
		</tr><tr><td>TFS أكويلوس 1:</td>
			<td colspan="3">موضع محدد مسبقا للبرنامج ، نقطة ضبط درجة الحرارة = 28 درجة ، الوقت = 7 ثوان</td>
		</tr><tr><td>TFS أكويلوس 2:</td>
			<td colspan="3">موضع البرنامج المحدد مسبقا ، نقطة ضبط درجة الحرارة = 28 درجة ، الوقت = 7 ثوان</td>
		</tr><tr><td>إعدادات طلاء الرش FIB</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>نظام النصاب:</td>
			<td colspan="3">في غرفة إعداد النصاب: 10 مللي أمبير ، 40 ثانية</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 واط ، 500 فولت ، 250 مللي أمبير ، 0.2 ملي بار ، 15 ثانية</td>
		</tr><tr><td>TFS أكويلوس 1:</td>
			<td colspan="3">1 كيلو فولت ، 10 مللي أمبير ، 10 باسكال ، 15 ثانية</td>
		</tr><tr><td>TFS أكويلوس 2:</td>
			<td colspan="3">1 كيلو فولت ، 10 مللي أمبير ، 10 باسكال ، 15 ثانية</td>
		</tr><tr><td>اقتناء التصوير المقطعي</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>تيتان كريوس Gi2</td>
			<td colspan="3">كاميرا K2 ، فلتر طاقة Gatan Bioquantum</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">شق 20 فولت ؛ مخطط الميل المتماثل للجرعة (هاغن) مع خطوات 2 درجة ؛ ابدأ من +10 درجات (الإمالة المسبقة للصفيحة!) إلى +70 درجة و-50 درجة</td>
		</tr><tr><td>تيتان كريوس Gi4</td>
			<td colspan="3">الصقر 4 ؛ فلتر الطاقة Selectris X</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 فولت شق. مخطط الميل المتماثل للجرعة (هاغن) مع خطوات 2 درجة ؛ ابدأ من +10 درجات (الإمالة المسبقة للصفيحة!) إلى +70 درجة و-50 درجة</td>
		</tr><tr><td>استحواذ FLM</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>الظهور (الوضع البؤري)</td>
			<td colspan="3">الهدف: خطة زايس EC - نيوفلوار 40×/0.9 NA Pol؛ معلمات اكتساب المكدس: حجم بكسل x-y = 161.25 نانومتر ، حجم خطوة z = 300 نانومتر.</td>
		</tr><tr><td>لايكا SP8 التبريد متحد البؤر</td>
			<td colspan="3">الهدف: لايكا HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM ؛ معلمات اكتساب المكدس: حجم بكسل x-y = 84 نانومتر ، حجم خطوة z = 300 نانومتر.</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: قائمة المعدات المختبرة والإعدادات المقترحة.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

يجعل طحن FIB المترابط 3D أحداثا خلوية محددة وحتى نادرة في متناول Cryo-TEM. السماح بالكشف عن البنية الفائقة لهذا الحدث مباشرة داخل البيئة الأصلية. يعمل سير العمل المترابط على تحسين معدل نجاح استهداف الهياكل الخلوية النادرة ، ويساعد على تحديدها بشكل لا لبس فيه في البيئة الخلوية المزدحمة.سيتم توضيح الإجراء من قبل آنا بيبر وكريستينا كابيتانيو ، الخبيرين في التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. ابدأ الفحص المجهري الفلوري بالتبريد للشبكات المصنفة بالخلايا من خلال الحصول على نظرة عامة ميدانية واسعة في الوضع الفلوري والمنعكس. ثم حدد مربعات الشبكة المناسبة مع إشارة مضان.بعد التأكد من توزيع الخلايا والخرز بالتساوي نحو مركز كل مربع ، اختر المربعات على 200 شبكة شبكية يمكن الوصول إليها بواسطة كل من أداة FIB-SEM و TEM ، وهي على بعد ثلاثة مربعات على الأقل من حافة الشبكة. في كل مربع من مربعات الشبكة المحددة ، احصل على مكدس فلورسنت بخطوة مركزة مناسبة. يجب استخدام أهداف الفتحة العددية العالية لزيادة عدد الفوتونات ودقة التوطين.على مجهر متحد البؤر مع فتحة عددية 0.9 هدف ، احصل على مكدسات بحجم خطوة 300 نانومتر وأخذ عينات زائدة من قيمة Nyquist. سجل مكدسات ألوان متعددة وقم بتخزين الشبكات تحت النيتروجين السائل حتى الاستخدام مرة أخرى. استخدم إما علامات القطع أو التوجيه لضمان التوجيه الصحيح للشبكة لوضعها لاحقا في TEM.قم بتحميل الشبكات في أداة التبريد FIB-SEM. تأكد من أن اتجاه الطحن عمودي على محور إمالة TEM. لطلاء الشبكات بطبقة عضوية معدنية واقية ، استخدم جهاز تشفير البلازما ونظام حقن الغاز في مواضع المرحلة المحددة مسبقا بواسطة إعداد FIB-SEM.بعد ذلك ، قم بتسجيل نظرة عامة على شبكة SEM وقم بإجراء ارتباط 2D مع لمحات عامة عن FLM. ابحث عن مربعات الشبكة عن طريق فحص لمحات عامة عن الشبكة المسجلة يدويا أو باستخدام حزمة برامج. حدد وضع علامة على أربعة مواضع مقابلة للمربعات في نظرة عامة على شبكة FLM و SEM واحسب التحويل بين النقاط المحددة لارتباط FLM-SEM.بعد ذلك ، ضع العلامات في وسط مربعات الشبكة المقابلة التي تم الحصول على مكدسات FLM لها قبل التنبؤ بموضعها في عرض SEM. لكل مربع شبكة مترابط ، التقط صورة شعاع أيوني منخفض التيار بزاوية طحن FIB المختارة وحدد مجال رؤية بالموضع المطلوب والتكبير الذي يطابق بيانات التألق. بالنسبة ل 200 شبكة شبكية ، احصل على بيانات FIB-SEM لاحتواء مربعات الشبكة الفردية ، بما في ذلك أشرطة الشبكة.بعد ذلك ، التقط صورة SEM لنفس المربع للمساعدة في تحديد الخرزات المقابلة في عرض التألق والحزمة الأيونية. قم بإجراء تسجيل مكدس 3D FLM الخام أو غير المفكك وعرض شعاع الأيونات 2D لكل موضع باستخدام صندوق أدوات الارتباط ثلاثي الأبعاد ، 3D CT ، عن طريق تحميل مكدس 3D FLM المعاد تقطيعه وعرض شعاع الأيونات في 3D CT.In بيانات التألق ، حدد أربع حبات إيمانية وانقر بزر الماوس الأيمن على قائمة المواضع لتحديد موضع 3D للخرز عبر التركيب الغاوسي للإشارة في X ، Y و Z.ثم ، حدد الخرزات المقابلة في صورة شعاع الأيونات لإجراء ارتباط 3D الأولي. وبالمثل ، أضف المزيد من الخرز إلى التسجيل للتحقق من دقة الارتباط.اترك بعض الخرزات الإيمانية التي يمكن التعرف عليها بوضوح في كل من التألق والشعاع الأيوني عن طريق التحقق من موقعها المتوقع مقابل الموقع الفعلي في صورة الحزمة الأيونية. في 3D CT ، يمكن عرض جذر متوسط مربع الخطأ "أو قيم RMSE ، لتقييم اتساق الارتباط. تأكد من أن قيم RMSE صغيرة وبترتيب دقة الترجمة.بعد ذلك ، حدد الإشارات الخلوية المستهدفة وتناسب موضع 3D في مكدس FLM قبل تطبيق التحويل للتنبؤ بالمواضع المستهدفة في عرض الحزمة الأيونية. لكل مربع مرتبط ، قم بنقل المواضع المتوقعة للميزات ذات الأهمية إلى أداة FIB-SEM لوضع أنماط طحن الصفيحة. إذا كانت هناك إشارات متعددة لكل خلية ، فضع الأنماط لتضمين أقصى نقاط اهتمام ممكنة في نفس الصفيحة.مطحنة خشنة الصفائح تليها طحن دقيق للحصول على سمك نهائي من 150 إلى 250 نانومتر. تأكد من أن اتجاه الصفيحة عمودي على محور الميل عند تحميل الشبكات في المجهر الإلكتروني المرسل. احصل على مونتاج شبكي ولمحات عامة لكل مربع شبكي يحتوي على صفائح مع تكبير مناسب ووقت تعرض لتصور الحبيبات الإيمانية في صور TEM دون إضافة جرعة إلكترونية إجمالية بشكل كبير.احصل على خرائط TEM عالية الدقة لكل صفيحة. يربط التسجيل و 3D-2D مكدس FLM بمربع شبكة TEM ولمحات عامة عن الصفيحة في 3D CT. إجراء الارتباط بين FLM و TEM من التكبير المنخفض إلى العالي في TEM. بعد نقل المواضع ، قم بإعداد وتشغيل سلسلة الميل في المواضع المترابطة "ثم استخدم التكبير المناسب وإلغاء التركيز والجرعة الإجمالية لبدء التقاط الصورة عند الإمالة المسبقة التي تحددها الصفيحة باستخدام مخطط إمالة متماثل للجرعة.اتبع إما الحصول اليدوي أو الدفعي للصور. في التحليل التمثيلي ، تظهر نظرة عامة على TEM ذات التكبير المنخفض لموقع الطحن لتوطين السمات البيولوجية ذات الأهمية. في وقت لاحق ، تم ربط عرض تكبير أعلى مع إسقاط الكثافة القصوى FLM وتم إعداد مواقع للحصول على التصوير المقطعي.في الصور المكتسبة ، يمكن تصور رواسب البروتين الداخلي في بيئتها الأصلية. تحسين العينة مهم جدا. يجب تحسين إعداد الشبكة للحصول على توزيع جيد للخلايا للطحن وعدد جيد من الخرز الائتماني المرئي في معظم مربعات الشبكة.ساعد الطحن المترابط 3D في الكشف عن البنية الفائقة للعمليات الخلوية المختلفة مثل التقدم التدريجي للالتهام الذاتي في كل خلية ، ويستخدم لالتقاط حجرة منفصلة عن طور جديد.

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

عالية الدقة تعقب الفيديو للتنقل في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

باستخدام التصوير المقطعي عالي الدقة لتصور البنية الثلاثية وظيفة الأوعية الدموية النباتية

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

البرد الإلكترون المجهري عينة التحضير عن طريق المركزة ايون شعاع

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

ما يفعل وما يترك من المجهري البرد الإلكترون: وهو أول كتاب عن تحضير العينة وجمع البيانات عالية الجودة للتعمير الجزيئات 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

عزل الميتوكوندريا سليمة من العضلات الهيكلية التي كتبها التفاضلية الطرد المركزي لقياسات عالية الدقة قياس التنفس

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...