Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Vi takker Inga Wolf for at understøtte IT-infrastrukturen, Florian Beck for beregningsstøtte og Oda H. Schiøtz for den kritiske læsning af manuskriptet. Finansieringen blev delvist ydet gennem et Alexander von Humboldt returners stipendium til Philipp S. Erdmann og et EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 til Florian Wilfling. Anna Bieber blev støttet af et Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. stipendium.

<ol>
	<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+tomography:+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail.">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li><li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins.">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-correlative+light+and+electron+microscopy+workflow+for+cryo-focused+ion+beam+milled+adherent+cells.">Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 162, 273-302 (2021).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies.">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li><li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy.">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits.">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li><li>. Scientific volume imaging, Nyquist calculator Available from: <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>. 3DCT Available from: <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021)</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745 (2021).</li><li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae.">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0 (2019).</li><li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology.">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).</li><li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling.">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033 (2020).</li><li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286 (2020).</li><li>. tools3dct Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021)</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>B&#228;uerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions.">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions.">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li><li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crinkling:+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature.">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li><li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images.">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li><li>. Delmic METEOR Available from: <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021)</li><li>. iFLM Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021)</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association.">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li><li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging.">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714 (2021).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms.">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue.">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li><li>Wu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context.">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017 (2015).</li><li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision.">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li><li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins.">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

1. Kritiske trin i protokollen
Optimering af cellekultur og gitterdykkende parametre er grundlæggende for denne arbejdsgang. I begyndelsen af et projekt er det værd at investere tid i at optimere taggingstrategier, fordelingen af celler og fiduciale perler og teste forskellige gitterforberedelses- og blottingparametre. Arbejde med en optimalt dykfrosset prøve vil betydeligt lette downstream-behandlingen.
Som for ethvert TEM-eksperiment kræves glasagtige prøver. For store pattedyrceller som HeLa foretrækkes 1-2 celler pr. gitterkvadrat, men celler kan stadig være glasagtige ved højere densitet. Eventuelt kan vitrifikation forbedres i pattedyrceller (f.eks. HEK293, HeLa) ved at inkubere dem med 2,5-10% (v / v) glycerol tilsat til dyrkningsmediet 10 minutter, før de falder23. Hvis det er muligt, kan gittermønstre bruges til at sikre perfekt placering og fordeling af cellerne og derved forbedre vitrifikation og senere korrelation24.
Mens specifikke celler kan vælges under arbejdsgangen, vil for få celler, der viser det biologiske træk af interesse, reducere den samlede gennemstrømning betydeligt. For at forbedre korrelationen i POI-positive celler bør der anvendes tilstrækkeligt lyse fluoroforer. Dette er især vigtigt på endogene ekspressionsniveauer. Vi fandt ud af, at mVenus under kryo-forhold ofte klarede sig bedre end EGFP på grund af dens øgede lysstyrke25 og det hypsokromiske skift, hvilket holder den velegnet til standard GFP-filteropsætninger under kryo-forhold26. For ikke-punktlignende målstrukturer bør afvejningen mellem bølgelængde og lokaliseringsnøjagtighed (Abbe-diffraktionsgrænse) også overvejes.
Effektiv 3D-korrelation kræver også, at elnettet er mekanisk stabilt og håndteres med stor omhu. Mens standard guld- eller kobbergitter med kulstofstøtte kan anvendes, kan succesraten øges betydeligt ved at bruge mere stive SiO2-film afhængigt af projektet. Det er dog endnu ikke endeligt bestemt, om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchende termiske ekspansionskoefficienter (substrat vs. film) for at reducere kryorynker27 er den mest afgørende faktor for vellykket 3D-korrelation. Desuden kan der anvendes polydimethylsiloxanovertrukne skåle til opsamling af skrøbelige Au-riste5.
Ud over at sikre prøvestabilitet er et omhyggeligt valg af FLM-billeddannelsesparametre nødvendigt for at opnå fluorescensstakke af høj kvalitet, der er egnede til optimal målretning under FIB-fræsning. I denne henseende anbefales det også at teste forskellige denoising28 eller dekonvolutionsteknikker på FLM-dataene, da det kan forbedre lokaliseringen af fiducials og cellulære signaler betydeligt. Når fluorescenssignalet korreleres til FIB-SEM-billeder, er en god prøveudtagning af fiduciale perler vigtig. De skal være godt fordelt omkring cellerne og muligvis i forskellige z-højder. Det er også god praksis at validere konsistensen af korrelationen ved at kontrollere de forudsagte vs. faktiske positioner af perler, der bevidst blev udeladt af fiducialmodellen, men klart kan korreleres med øjet. 3DCTs RMSE-værdier bør også altid tages i betragtning for at kontrollere registreringskonsistensen.
Da aflejring af formalet materiale og restvand fra FIB-SEM-kammeret (dvs. rekontaminering) øger den effektive lameltykkelse ved at tilføje amorft materiale til begge sider af det, reducerer opbevaring af finmalede lameller i mikroskopet i længere tid generelt TEM-datakvaliteten på grund af yderligere elektronspredningshændelser. Derfor udføres fræsning oftest i to trin: Først fræses alle positioner groft (dvs. til ca. 800 nm) og derefter fint (til ~ 150-250 nm), og gitteret aflæses straks, efter at den sidste lamel er afsluttet. Bedre korrelationssucces kan dog opnås ved at behandle de interessante positioner på en stedlig måde og dermed udføre grov og fin fræsning på de samme lameller direkte efter hinanden, da dette ikke giver tid til bøjning eller deformation. Dette reducerer dog det maksimale antal lameller, der kan produceres pr. gitter, afhængigt af systemets rekontamineringshastighed. For en hastighed på 20 nm / h produceres 4-6 lameller inden for 1-1,5 timer.
Bevægelse af hele gitteret eller de grovfræsede lameller >300 nm vil resultere i dårlig eller mislykket korrelation (se også begrænsninger, der diskuteres nedenfor). Det bør derfor kontrolleres regelmæssigt, f.eks. ved at sammenligne IB-billeder før, under og efter FIB-fræsning. Steder, der viser betydelig bevægelse (>300 nm), skal kasseres. Optimer prøveforberedelsen (dvs. valg af gittertype, celletæthed og dykparametre; se protokolafsnit 1) og fræsningsstrategi for at undgå disse bevægelser. Lamelbøjning kan reduceres betydeligt ved fræsning på stedet som beskrevet i trin 3.6 og reduktion af lamelbredden. Som tidligere nævnt, mens stressaflastningssnit15 er designet til at reducere lamelbøjning, resulterer de ofte i en samordnet bevægelse af den afkoblede lamel og derved effektivt forhindrer korrelation. Integrerede FLM-systemer kan bruges til at løse dette problem.
2. Ændringer og fejlfinding af metoden
Det anbefales stærkt at udføre en grundig karakterisering af prøven i levende cellebilleddannelse, før du går til kryo-betingelser. Optimering af celleprøver, behandlingsordninger og viden om, hvilken slags signal man kan forvente, før man går ind i cryo-workflowet, kan forbedre succesraten betydeligt.
I arbejdsgangen, der præsenteres her, bruges et enkeltstående fluorescensmikroskop med et kryo-trin til at afbilde prøverne efterfulgt af en overførsel af gitterene til det fokuserede ionstrålemikroskop. Det er imidlertid blevet testet på systemer, hvor et fluorescensmikroskop er integreret i FIB-SEM-kammeret, og derfor kræves der ingen prøveoverførsel for at erhverve fluorescensbilleder 29,30,31. Ved hjælp af sådanne integrerede systemer kan interessepositioner afbildes under og efter FIB-fræsning for at kontrollere tilstedeværelsen af målfluorescenssignalet uden at øge risikoen for kontaminering af de endelige lameller. Det er dog vigtigt at huske de optiske parametre for de anvendte mikroskoper, da f.eks. et lavt NA-mål vil begrænse den præcision, hvormed fiduciale perler og målsignaler kan lokaliseres. Ikke desto mindre vil integrerede FLM-opsætninger også hjælpe med bedre at håndtere små deformationer af net og lameller, da FLM-stakke løbende kan opdateres og sammenlignes med opdaterede SEM- og IB-visninger.
Som et alternativ til fluorescensbilleddannelse af lamellen mellem FIB-fræsning og TEM-dataindsamling kan post-TEM-korrelation bruges til at verificere korrekt placering og fræsning af lamellerne 5,6.
Under alle trin i den korrelative arbejdsgang, men især under TEM, anbefales det at oprette en overlejring af de projicerede fluorescensdata på FIB-SEM/TEM-billederne. Sådanne klassiske CLEM-synspunkter hjælper med at forstå mere intuitivt, hvilken del af cellerne der er indeholdt i lamellerne. Dette tjener også som en nyttig sanity check for at verificere nøjagtigheden af korrelationen.
3. Metodens begrænsninger
Den 3D-korrelerede FIB-tilgang kræver prøver, der kan leveres med fiduciale perler. Derfor er denne metode i øjeblikket begrænset til dykfrosne gitre. For højtryksfrosne (HPF) (væv) prøver kan der i øjeblikket kun udføres 2D-2D-korrelationer. Potentielt kan interne fiduciale markører (f.eks. Organeller, farvede lipiddråber) være en løsning på dette problem32,33. Den endelige korrelationssuccesrate afhænger af mange faktorer, herunder prøvekvaliteten, fluorescensmikroskopiopsætningen, lameltykkelsen og størrelsen af den målrettede struktur. Korrelationsnøjagtigheden ved hjælp af den beskrevne 3D-registreringsmetode anslås at ligge i området 200-300 nm på det endelige IB-billede, hvilket stort set svarer til den typiske tykkelse af FIB-fræsede lameller7. Derfor vil cellulære strukturer, der er meget mindre end dette, være svære at målrette mod i øjeblikket. Derudover reducerer overdreven bevægelse på fræsestedet (>300 nm) også nøjagtigheden af korrelationen, et problem, der potentielt kan løses med FLM-opsætninger integreret i FIB/SEM-instrumenter. Lameller, der udviser stærk deformation eller bøjning under fræsning, bør under alle omstændigheder udelukkes fra downstream-arbejdsgangen.
Samlet set er kryofluorescensbilleddannelse i øjeblikket begrænset af Abbe-diffraktionskriteriet. Med mere rutinemæssig anvendelse (og kommercialisering) af superopløste cryo-FLM-metoder kan mere nøjagtig målretning af cellulære strukturer blive mulig, især når den integreres i FIB / SEM til on-the-fly drift.
4. Metodens betydning
Især sammenlignet med ikke-målrettede og postkorrelationsteknikker gør den 3D-korrelerede FIB-fræsningsmetode det muligt at vælge passende positioner før det tids- og ressourcekrævende TEM-trin. Det muliggør dermed mere effektiv dataindsamling og projektplanlægning. Desuden tilføjer de korrelerede fluorescensdata et lag af information, der kan være afgørende for fortolkningen af tomogrammerne og for at integrere cryo-ET-resultaterne i projekter i flere skalaer, især når det drejer sig om ikke-strukturerede proteinsamlinger eller dem, der er for små til skabelonmatchning og subtomogramgennemsnit.
5. Betydning og potentielle fremtidige anvendelser
I kombination med avancerede arbejdsgange såsom kryoløft ud af HPF-prøver 34,35, kryo-FIB-SEM volumen 36 og superopløsningsfluorescensbilleddannelse26,37,38,39 giver 3D-målrettet lamelpræparation udsigt til ikke kun at dissekere biologiske processer i isolerede celler, men også at gøre vævs- og patientprøver tilgængelige for FIB-fræsning og kryo-elektrontomografi. Som sådan vil det muliggøre dissektion af patologiske processer i høj opløsning og dermed være en integreret byggesten mod en biopsi på nanoskala.

Fokuseret ionstrålefræsning muliggør forberedelse af tynde biologiske prøver fra kryofikserede prøver uden de problemer, der ofte er forbundet med mekaniske sektioner såsom knivmærker og kompressionsartefakter1. Når FIB-fræsning parres med kryo-elektrontomografi, muliggør FIB-fræsning biologiske undersøgelser med høj opløsning af den cellulære morfologi og bestemmelse af strukturen af makromolekylære komplekser direkte inde fra celler ved subnanometeropløsning 2,3,4. Mens rigelige arter, såsom ribosomer, let findes i tilfældigt skårne FIB-lameller, er mange cellulære processer afhængige af colokalisering af flere komplekser eller er lokaliseret til bestemte steder i cellen. Derfor kræves effektiv målretning for ikke at miste det biologiske træk af interesse under fræseprocessen og være begrænset til tilfældige hits. En korrelativ tilgang, der kombinerer data fra scanningelektronmikroskopet (SEM)-FIB og et kryofluorescenslysmikroskop (FLM), er derfor nødvendig. Selvom det er muligt at udelade den oprindelige korrelation og først kombinere FLM- og kryo-ET-data efter TEM-erhvervelse5,6, muliggør fluorescensstyret fokuseret ionstrålefræsning en nøjagtig udvælgelse af fræseområdet på forhånd, hvilket resulterer i mere effektiv dataindsamling. Siden sin undfangelse7 havde anvendelsen af 3D-korreleret FIB-fræsning i biologiske undersøgelser været begrænset, indtil vi for nylig rapporterede at identificere et nyt væske-væskefase-adskilt (LLPS) rum i gær ved hjælp af denne teknik8.
Her beskrives en generaliseret 3D-kryo-korreleret lys- og elektronmikroskopi (CLEM) protokol, som kan bruges til at studere en bred vifte af prøver lige fra bakterier til gær- og pattedyrceller. Mens eksperimenterne blev udført ved hjælp af et bestemt sæt instrumenter, er de enkelte trin ikke bundet til specifik hardware og kan let overføres til andre systemer som en udvidelse til eksisterende protokoller 3,5. En liste over testet udstyr og foreslåede indstillinger findes i materialetabellen og tabel 1. De fire vigtigste trin i rørledningen er (1) prøveforberedelse, (2) lokalisering af funktioner af interesse ved kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korreleret fokuseret ionstrålefræsning og (4) lokalisering af de målrettede strukturer til kryo-ET-dataindsamling på lamellerne i kryotransmissionselektronmikroskopet (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

Kryo-elektrontomografi (cryo-ET) er blevet den valgte metode til undersøgelse af cellulære ultrastruktur og molekylære komplekser i deres oprindelige, frosne hydratiserede tilstand. Kryo-ET kræver dog, at prøverne er tynde nok til ikke at sprede eller blokere den indfaldende elektronstråle. For tykke cellulære prøver kan dette opnås ved kryofokuseret ionstrålefræsning (FIB). Denne protokol beskriver, hvordan man målretter mod specifikke cellulære steder under FIB-fræsning ved hjælp af en 3D-korrelativ tilgang, der kombinerer tredimensionelle fluorescensmikroskopidata med information fra FIB-scanningelektronmikroskopet. Ved hjælp af denne teknik kan sjældne cellulære begivenheder og strukturer målrettes med høj nøjagtighed og visualiseres ved molekylær opløsning ved hjælp af kryotransmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM).

Protokollen giver en gennemgang af rørledningen, der bruges til at opdage det EH-domæneholdige og endocytoseprotein 1 (Ede1)-afhængige endocytiske proteinaflejring (END) og dets nedbrydning og fangst i autofagiske legemer8. END er et væske-væske-fasesepareret rum i S. cerevisiae, som buffer en række proteiner involveret i clathrin-medieret endocytose (CME) efter mislykkede endocytiske hændelser. En af hovedkomponenterne er Ede1, som også fungerer som en CME-komponent og som en selektiv autofagireceptor til nedbrydning af dette nye LLPS-rum. Følgelig blev en EGFP-fusion af Ede1 (EGFP-Ede1) under kontrol af alkoholdehydrogenasepromotoren (ADH) anvendt til at visualisere END'er, da Ede1-overekspression interfererer med de tidlige stadier af endocytose og derfor konstitutivt inducerer LLPS.
På et dykfrosset gitter med EGFP-Ede1 overekspression af gærceller og 1 μm fiduciale markører blev fem positioner valgt til FLM-stakerhvervelse i GFP-kanalen (figur 6A; TFS Corrsight; Konfokal tilstand, 300 nm fokustrinstørrelse, 10 μm rækkevidde). Gitteret blev overført til FIB-instrumentet (Quanta 3D FEG), og gitterkvadraterne, for hvilke FLM-stakke var blevet erhvervet, blev identificeret ved at udføre en 2D-2D-korrelation af fluorescens- og SEM-gitteroversigterne (sammenlign trin 3.2).
For hver af de valgte firkanter blev ionstrålebilleder taget ved lav strøm (10 pA, 1200x forstørrelse), og tilsvarende fiduciale positioner blev registreret i 3DCT. Efter udvælgelse af positioner med det biologiske træk af interesse og tilpasning af deres 3D-position inden for FLM-stakken blev den fundne transformation anvendt på formodede END-positioner, og stederne til lamelforberedelse blev valgt (figur 6B). En FIB-stråle hældende 11° i forhold til gitteroverfladen blev anvendt i eksemplerne vist her (45° FIB-shuttle pre-tilt; 18° stage tilt). Interessepositioner blev overført, og FIB-mønstre blev tegnet manuelt (figur 6D) ved at måle afstanden mellem de forudsagte positioner i forhold til fremtrædende vartegn i FIB-billedet (f.eks. huller, isforureninger, fiducialperler). Nøjagtigheden af registreringen blev evalueret ved bevidst at udelade perler, der tydeligt kunne identificeres i FLM- og IB-billedet, og derefter sammenligne deres faktiske og forudsagte positioner i ionstrålebilledet (f.eks. diamant i figur 6B, C). Korrelationen for kvadratet vist i figur 6C viste sig at være nøjagtig (dvs. den forudsagte position af FLM-perlepositioner faldt perfekt sammen med deres tilsvarende IB-placering og 3DCT-rapporterede RMSE-værdier for underpixel til registreringen). Lameller blev således skåret på de forudsagte positioner (Site B) og finfræset til en tykkelse på ~200 nm (endelig mønsterforskydning).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> Figur 6: Repræsentative resultater for 3D-korreleret målretning af endocytiske proteinaflejringer (END) i gær. A) SEM-oversigt over nettet før fræsning. De farvede felter angiver gitterfirkanter, for hvilke fluorescensstabler blev taget på forhånd. (B-C) 3D-korrelation i et gitterkvadrat. Efter registrering af flere tilsvarende fiduciale perler (farvede kasser) i FLM-dataene (B, her vist som maksimal intensitetsprojektion) og ionstrålebilledet (C), blev nøjagtigheden af 3D-registreringen verificeret ved at forudsige placeringen af perlen angivet med diamanten. Dernæst blev målsignalets positioner (røde cirkler) forudsagt i ionstrålebilledet for to potentielle fræsesteder. (D) Zoom ind på sted B, der viser de forudsagte positioner for tre målpunkter (røde cirkler) og de indledende fræsemønstre (gule felter). En fjerde fluorescens punctum blev forudsagt at være meget lavere end den anden punktskive og derfor ikke målrettet under fræsning (grå cirkel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Efter vellykket FIB-fræsning og overførsel af nettet til kryotransmissionselektronmikroskopet (Titan Krios opererede ved 300 kV og udstyret med en Gatan K2 direkte elektrondetektor og Bioquantum energifilter), blev en gitteroversigt registreret i SerialEM og brugt til at lokalisere firkanter med lameller. For hver lamel blev der indsamlet oversigtsbilleder, og FLM-dataene blev registreret i 3DCT (3D-2D) ved hjælp af tilsvarende fiducialperler. Positioner af de biologiske egenskaber af interesse (figur 7A) blev derefter forudsagt ved hjælp af transformationen beregnet ud fra fiducialperlerne. Lameloversigter optaget ved højere forstørrelse blev syet, og interesseområder korrelerede ved hjælp af tydeligt synlige landemærker (f.eks. fiducialperler). Alternativt kan klassiske CLEM-oversigter produceres i forskellige software10,12.
Baseret på korrelationen blev der fundet fire potentielle steder for tomogramerhvervelse for lamellen vist i figur 7A. Dette omfatter dog også en position, der ikke var målrettet under den 3D-korrelerede FIB-fræsning (sammenlign figur 6D; grå cirkel) og en position blokeret af isforurening (figur 7; grå kasser). Tomogram kunne derfor kun registreres for to positioner (figur 7B). Samlet set blev der opnået en korrelationssucces på ~ 75%, dvs. lameller, der overlevede overførslen til TEM- og END-strukturerne på de forudsagte steder (12 korrelerede steder). Efter tomogramrekonstruktion, segmentering og skabelonmatchning kan individuelle END-strukturer visualiseres inden for deres oprindelige kontekst (figur 7C, D). Dette inkluderer det fenestrerede endoplasmatiske retikulum (ER), der omgiver END, lipiddråber, der lejlighedsvis kommer i kontakt, og ribosomer, der er udelukket fra LLPS-rummet. Samlet set viser dette, hvordan 3D-korreleret FIB-fræsning kan give information på molekylært niveau om sjældne biologiske processer fra intakte celler.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> Figur 7: Repræsentative resultater til visualisering af END med cryo-ET. (A) TEM-oversigten med lav forstørrelse for fræsestedet vist i figur 6 kan let korreleres med FLM-projektionen med maksimal intensitet (figur 6B) for at lokalisere biologiske karakteristika af interesse (røde kryds). (B) I et andet trin kan en visning med højere forstørrelse (syet) korreleres, og positioner til tomogramoptagelse (gule bokse) oprettes. Placeringer som følge af signalet uden for planet (grå boks, sammenlign figur 6D) blev ignoreret. (C-D) Ved hjælp af denne 3D-korrelative FIB-tilgang kan den endocytiske proteinaflejring (END) visualiseres i sit oprindelige miljø. Strukturer såsom det endoplasmatiske retikulum (ER), ribosomer, membraner og lipiddråber kan identificeres og visualiseres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Indstillinger for plasmarenser</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG:</td>
			<td colspan="3">Indstilling af radiofrekvens: "HI", 30 s; N2 plasma</td>
		</tr><tr><td>Indstillinger for stempel</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">100% fugtighed; blotforce = 8; blottime = 10 s; ventetid 0 s; (dette burde fungere for de fleste suspensions- og klæbende celler)</td>
		</tr><tr><td>FIB GIS-positioner og -tidspunkter</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">Tilt = 0, Rotation = -180, Z-position = 13,5, Temperatursætpunkt =26,15°, Tid = 8 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">Tilt = 0, Rotation = -180, Z-position = 9,8, Temperatursætpunkt = 28° C, Tid = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">Software foruddefineret position, temperatur setpoint = 28°, tid = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">Software foruddefineret position, temperatur setpunkt = 28°, tid = 7 s</td>
		</tr><tr><td>FIB Sputter Coater-indstillinger</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Beslutningsdygtighed:</td>
			<td colspan="3">I kvorumsforberedelseskammeret: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>Tomogram erhvervelse</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi2</td>
			<td colspan="3">K2 kamera, Gatan Bioquantum energifilter</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eV slids; dosissymmetrisk hældningsskema (Hagen) med 2° trin; Start ved +10° (lamellen før vip!) til +70°og -50°</td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Falcon 4; Selectris X energifilter</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eV slids; dosissymmetrisk hældningsskema (Hagen) med 2° trin; Start ved +10° (lamel før vip!) til +70° og -50°</td>
		</tr><tr><td>FLM-opkøb</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Corrsight (konfokal tilstand)</td>
			<td colspan="3">Formål: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol; Stack erhvervelse parametre: x-y pixelstørrelse = 161.25 nm, z trin størrelse = 300 nm.</td>
		</tr><tr><td>Leica SP8 kryo-konfokal</td>
			<td colspan="3">Formål: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Stack erhvervelse parametre: x-y pixelstørrelse = 84 nm, z trin størrelse = 300 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Liste over testet udstyr og foreslåede indstillinger.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Her præsenterer vi en pipeline til 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til styring af forberedelsen af cellulære prøver til kryo-elektrontomografi. 3D-positionen af fluorescerende mærkede proteiner af interesse bestemmes først ved kryofluorescensmikroskopi og målrettes derefter til fræsning. Protokollen er velegnet til pattedyr, gær og bakterieceller.

Prøveforberedelse ved 3D-korrelativfokuseret ionstrålefræsning til kryo-elektrontomografi med høj opløsning

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

3D-korreleret FIB-fræsning gør specifikke og endda sjældne cellulære hændelser tilgængelige for Cryo-TEM. Tillader afsløringen af denne begivenheds ultrastruktur direkte i det oprindelige miljø. Den korrelative arbejdsgang forbedrer succesraten for målretning mod sjældne cellulære strukturer og hjælper med at identificere dem entydigt i det overfyldte mobilmiljø.Demonstrerer proceduren vil være Anna Bieber og Christina Capitanio, eksperter i korreleret kryo-elektrontomografi. Begynd kryofluorescensmikroskopien af de celleseedede gitre ved at få et bredt feltoverblik i fluorescens og reflekteret "tilstand. Vælg derefter passende gitterfirkanter med fluorescenssignal.Når du har sikret, at cellerne og perlerne er jævnt fordelt mod midten af hver firkant, skal du vælge firkanterne på 200 maskegitre, der er tilgængelige for både FIB-SEM- og TEM-instrumentet, og som er mindst tre firkanter væk fra gitterkanten. På hver af de valgte gitterfirkanter erhverver du en fluorescerende stak med et passende fokuseret trin. Høje numeriske blændemål bør bruges til at øge fotontællingen og lokaliseringsnøjagtigheden.På et konfokalmikroskop med numerisk blænde 0,9 mål, erhverve stakke med 300 nanometer trinstørrelse og oversampling Nyquist-værdien. Optag flere farvestakke og opbevar gitre under flydende nitrogen indtil videre brug. Brug enten udskærings- eller orienteringsmærkerne for at sikre korrekt orientering af gitteret til senere placering i TEM.Indlæs gitterene i cryo FIB-SEM-instrumentet. Sørg for, at fræseretningen er vinkelret på TEM's hældningsakse. For at belægge gitterene med et beskyttende organometallisk lag skal du bruge en plasmakoder og et gasindsprøjtningssystem på de scenepositioner, der er foruddefineret af FIB-SEM-opsætningen.Optag derefter SEM-gitteroversigten, og udfør en 2D-korrelation med FLM-oversigter. Find gitterkvadraterne ved manuelt at inspicere registrerede gitteroversigter eller ved hjælp af en softwarepakke. Vælg og markér fire tilsvarende positioner for kvadraterne i FLM- og SEM-gitteroversigten, og beregn transformationen mellem de markerede punkter for FLM-SEM-korrelation.Placer derefter markørerne i midten af de tilsvarende gitterkvadrater, som FLM-stakke er hentet for, før du forudsiger deres position i SEM-visningen. For hvert korreleret gitterkvadrat skal du tage et ionstrålebillede med lav strøm ved den valgte FIB-fræsevinkel og vælge et synsfelt med den ønskede position og forstørrelse, der matcher fluorescensdataene. For 200 maskegitre skal du hente FIB-SEM-data for at indeholde enkelte gitterkvadrater, herunder gitterbjælkerne.Tag derefter et SEM-billede af den samme firkant for at hjælpe med at identificere tilsvarende perler i fluorescens- og ionstrålevisningen. Udfør registrering af den rå eller deconvoled 3D FLM-stak og 2D-ionstrålevisningen for hver position med 3D-korrelationsværktøjskassen, 3D CT, ved at indlæse den tilsvarende re-skivede 3D FLM-stak og ionstrålevisning i 3D-CT.In fluorescensdataene, vælg fire fiduciale perler og højreklik på positionslisten for at bestemme 3D-position af perlerne via Gaussisk tilpasning af signalet i X, Y og Z.Vælg derefter de tilsvarende perler i ionstrålebilledet for at udføre en indledende 3D-korrelation. På samme måde skal du tilføje flere perler til registreringen for at kontrollere nøjagtigheden af korrelationen.Udelad nogle fiduciale perler, der er tydeligt identificerbare i både fluorescens og ionstråle ved at kontrollere deres forudsagte versus faktiske placering i ionstrålebilledet. I 3D CT kan rodmiddelkvadratfejl eller RMSE-værdier ses for at vurdere korrelationskonsistensen. Sørg for, at RMSE-værdierne er små og i overensstemmelse med lokaliseringsnøjagtigheden.Vælg derefter de målrettede cellulære signaler, og tilpas 3D-positionen i FLM-stakken, før du anvender transformationen til at forudsige målpositionerne i ionstrålevisningen. For hvert korreleret kvadrat overføres de forudsagte positioner for de interessante funktioner til FIB-SEM-instrumentet for at placere lamelfræsemønstrene. Hvis der er flere signaler pr. celle, skal du placere mønstrene for at inkludere de maksimalt mulige interessepunkter i den samme lamel.Grov mølle lamellerne efterfulgt af fin fræsning for at få en endelig tykkelse på 150 til 250 nanometer. Sørg for, at lamelorienteringen er vinkelret på hældningsaksen, når gitterene indlæses i transmissionselektronmikroskopet. Få gittermontage og oversigter for hvert gitterkvadrat, der indeholder lameller, med passende forstørrelse og eksponeringstid for at visualisere de fiduciale perler i TEM-billederne uden signifikant at øge den samlede elektrondosis.Få TEM-kort i høj opløsning over hver lamell. Register og 3D-2D korrelerer FLM-stakken med TEM-gitterkvadratet og lameloversigterne i 3D CT. Udfør korrelation mellem FLM og TEM fra lav til høj forstørrelse i TEM. Efter overførsel af positionerne skal du opsætte og køre vippeserier på korrelerede positioner"Brug derefter en passende forstørrelse, defokusering og total dosis til at starte billedoptagelsen ved forhældningen bestemt af lamellen ved hjælp af et dosissymmetrisk vippeskema.Følg enten manuel eller batchoptagelse af billeder. I den repræsentative analyse vises TEM-oversigten med lav forstørrelse af fræsestedet for at lokalisere biologiske egenskaber af interesse. Senere blev en højere forstørrelsesvisning korreleret med FLM-maksimal intensitetsprojektion, og positioner til tomogramerhvervelse blev oprettet.I de erhvervede billeder kunne den endocytiske proteinaflejring visualiseres i sit oprindelige miljø. Optimeringen af prøven er meget vigtig. Gitterforberedelsen skal optimeres til at have en god fordeling af celler til fræsning og et stort antal synlige fiduciale perler i de fleste gitterkvadrater.3D-korrelativfræsning har hjulpet med at afsløre ultrastrukturen i forskellige cellulære processer, såsom den trinvise progression af autofagi i hver celle, og det bruges til at fange et nyt faseadskilt rum.

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-Electron Microscopy Prøvepræparation ved hjælp af en målrettet Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

SKAL og MÅ af Cryo-elektronmikroskopi: En primer på Prøveforberedelse og data af høj kvalitet Indsamling til Macromolecular 3D Genopbygning

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Forberedelse og Observation af Thick Biologiske prøver ved scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering af Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle ved differentialcentrifugering for høj opløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering af DNA jordpakning i cyanobakterier af høj spænding Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...