Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

We bedanken Inga Wolf voor het ondersteunen van de IT-infrastructuur, Florian Beck voor computationele ondersteuning en Oda H. Schiøtz voor het kritisch lezen van het manuscript. De financiering werd gedeeltelijk verstrekt door middel van een Alexander von Humboldt returners fellowship aan Philipp S. Erdmann en een EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 aan Florian Wilfling. Anna Bieber werd ondersteund door een Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. fellowship.

<ol>
	<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+tomography:+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail.">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li><li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins.">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-correlative+light+and+electron+microscopy+workflow+for+cryo-focused+ion+beam+milled+adherent+cells.">Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 162, 273-302 (2021).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies.">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li><li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy.">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits.">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li><li>. Scientific volume imaging, Nyquist calculator Available from: <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>. 3DCT Available from: <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021)</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745 (2021).</li><li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae.">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0 (2019).</li><li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology.">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).</li><li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling.">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033 (2020).</li><li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286 (2020).</li><li>. tools3dct Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021)</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>B&#228;uerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions.">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions.">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li><li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crinkling:+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature.">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li><li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images.">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li><li>. Delmic METEOR Available from: <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021)</li><li>. iFLM Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021)</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association.">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li><li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging.">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714 (2021).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms.">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue.">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li><li>Wu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context.">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017 (2015).</li><li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision.">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li><li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins.">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

1. Kritieke stappen in het protocol
Optimalisatie van celcultuur en grid plunging parameters is fundamenteel voor deze workflow. Aan het begin van een project is het de moeite waard om tijd te investeren in het optimaliseren van taggingstrategieën, de verdeling van cellen en fiduciale kralen, en het testen van verschillende rastervoorbereiding en blottingparameters. Het werken met een optimaal ondergevroren monster zal de downstream-verwerking aanzienlijk vergemakkelijken.
Zoals voor elk TEM-experiment zijn glasvochtmonsters vereist. Voor grote zoogdiercellen zoals HeLa hebben 1-2 cellen per rastervierkant de voorkeur, maar cellen kunnen nog steeds glasachtig zijn bij een hogere dichtheid. Optioneel kan vitrificatie worden verbeterd in zoogdiercellen (bijv. HEK293, HeLa) door ze te incuberen met 2,5-10% (v / v) glycerol toegevoegd aan het kweekmedium 10 minuten voordat23 wordt gedompeld. Indien beschikbaar, kunnen rasterpatronen worden gebruikt om een perfecte plaatsing en verdeling van de cellen te garanderen, waardoor de vitrificatie en latere correlatieworden verbeterd 24.
Hoewel specifieke cellen tijdens de workflow kunnen worden geselecteerd, zullen te weinig cellen die het biologische kenmerk van belang vertonen, de totale doorvoer aanzienlijk verminderen. Om de correlatie in POI-positieve cellen te verbeteren, moeten voldoende heldere fluoroforen worden gebruikt. Dit is vooral belangrijk op endogene expressieniveaus. We ontdekten dat mVenus onder cryo-omstandigheden vaak beter presteerde dan EGFP vanwege de verhoogde helderheid25 en de hypsochrome verschuiving, waardoor het geschikt blijft voor standaard GFP-filteropstellingen onder cryo-omstandigheden26. Voor niet-puntachtige doelstructuren moet ook de afweging tussen golflengte en lokalisatienauwkeurigheid (Abbe-diffractielimiet) worden overwogen.
Efficiënte 3D-correlatie vereist ook dat rasters mechanisch stabiel zijn en met grote zorg worden behandeld. Hoewel standaard gouden of koperen roosters met koolstofondersteuning kunnen worden gebruikt, kan het slagingspercentage aanzienlijk worden verhoogd door meer rigide SiO2-films te gebruiken, afhankelijk van het project. Het is echter nog niet definitief vastgesteld of (a) mechanische stabiliteit of (b) het matchen van thermische uitzettingscoëfficiënten (substraat versus film) om cryo-rimpelingte verminderen 27, de meest cruciale factor is voor succesvolle 3D-correlatie. Bovendien kunnen voor het oppakken van fragiele Au-roosters met polydimethylsiloxaan gecoate schalen worden gebruikt5.
Naast het waarborgen van de stabiliteit van het monster, is een zorgvuldige keuze van FLM-beeldvormingsparameters noodzakelijk voor het verkrijgen van hoogwaardige fluorescentiestapels die geschikt zijn voor optimale targeting tijdens het FIB-frezen. In dit verband wordt ook geadviseerd om verschillende denoising28 - of deconvolutietechnieken op de FLM-gegevens te testen, omdat dit de lokalisatie van fiducialen en cellulaire signalen aanzienlijk kan verbeteren. Bij het correleren van het fluorescentiesignaal met FIB-SEM-beelden is een goede bemonstering van fiduciale kralen belangrijk. Ze moeten goed verdeeld zijn over de cellen en eventueel op verschillende z-hoogtes. Het is ook een goede gewoonte om de consistentie van de correlatie te valideren door de voorspelde versus werkelijke posities van kralen te controleren die opzettelijk buiten het fiduciale model zijn gelaten, maar duidelijk met het oog kunnen worden gecorreleerd. De RMSE-waarden van 3DCT moeten ook altijd in overweging worden genomen om de consistentie van de registratie te controleren.
Aangezien de afzetting van gefreesd materiaal en restwater uit de FIB-SEM-kamer (d.w.z. herbesmetting) de effectieve lamellendikte verhoogt door amorf materiaal aan beide zijden ervan toe te voegen, vermindert het langdurig in de microscoop houden van fijngemalen lamellen over het algemeen de TEM-gegevenskwaliteit als gevolg van extra elektronenverstrooiingsgebeurtenissen. Dienovereenkomstig wordt frezen meestal in twee stappen uitgevoerd: eerst worden alle posities ruw gefreesd (d.w.z. tot ongeveer 800 nm) en vervolgens fijn (tot ~ 150-250 nm) en wordt het rooster onmiddellijk gelost nadat de laatste lamellen zijn voltooid. Een beter correlatiesucces kan echter worden bereikt door de posities van belang op een locatiegewijze manier te verwerken, waardoor ruw en fijn frezen op dezelfde lamellen direct na elkaar wordt uitgevoerd, omdat dit geen tijd overlaat voor buigen of vervorming. Dit vermindert echter het maximale aantal lamellen dat per rooster kan worden geproduceerd, afhankelijk van de herbesmettingssnelheid van het systeem. Voor een snelheid van 20 nm / h worden 4-6 lamellen geproduceerd binnen 1-1,5 uur.
Beweging van het gehele rooster of de ruw gefreesde lamellen >300 nm zal resulteren in een slechte of mislukte correlatie (zie ook de hieronder besproken beperkingen). Het moet daarom regelmatig worden gecontroleerd, bijvoorbeeld door IB-beelden te vergelijken voor, tijdens en na het FIB-frezen. Locaties die een significante beweging vertonen (>300 nm) moeten worden weggegooid. Optimaliseer de monstervoorbereiding (d.w.z. keuze van rastertype, celdichtheid en kelderparameters; zie protocolsectie 1) en freesstrategie om deze bewegingen te voorkomen. Lamellenbuiging kan aanzienlijk worden verminderd door plaatselijk te frezen zoals beschreven in stap 3.6 en de lamellenbreedte te verkleinen. Zoals eerder vermeld, terwijl stressverlichtingssneden15 zijn ontworpen om het buigen van lamellen te verminderen, resulteren ze vaak in een gecoördineerde beweging van de ontkoppelde lamellen, waardoor correlatie effectief wordt voorkomen. Geïntegreerde FLM-systemen kunnen worden gebruikt om dit probleem op te lossen.
2. Wijzigingen en problemen met de methode
Het wordt ten zeerste aanbevolen om een grondige karakterisering van het monster uit te voeren in live-cell imaging voordat u naar cryo-omstandigheden gaat. Het optimaliseren van de cellulaire monsters, behandelingsschema's en weten wat voor soort signaal te verwachten voordat de cryo-workflow wordt betreden, kan het slagingspercentage aanzienlijk verbeteren.
In de hier gepresenteerde workflow wordt een stand-alone fluorescentiemicroscoop met een cryotrap gebruikt om de monsters in beeld te brengen, gevolgd door een overdracht van de rasters naar de gefocusseerde ionenbundelmicroscoop. Het is echter getest op systemen waarbij een fluorescentiemicroscoop is geïntegreerd in de FIB-SEM-kamer en daarom is er geen monsteroverdracht vereist om fluorescentiebeeldente verkrijgen 29,30,31. Met behulp van dergelijke geïntegreerde systemen kunnen interessante posities tijdens en na het FIB-frezen in beeld worden gebracht om te controleren op de aanwezigheid van het doelfluorescentiesignaal zonder het risico op verontreiniging van de uiteindelijke lamellen te vergroten. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de optische parameters van de gebruikte microscopen, omdat bijvoorbeeld een laag NA-objectief de precisie beperkt waarmee fiduciale kralen en doelsignalen kunnen worden gelokaliseerd. Niettemin zullen geïntegreerde FLM-opstellingen helpen om ook beter om te gaan met lichte vervormingen van rasters en lamellen, omdat FLM-stacks voortdurend kunnen worden bijgewerkt en vergeleken met up-to-date SEM- en IB-weergaven.
Als alternatief voor fluorescentiebeeldvorming van de lamellen tussen FIB-frezen en TEM-gegevensverzameling, kan post-TEM-correlatie worden gebruikt om de juiste plaatsing en frezen van de lamellente verifiëren 5,6.
Tijdens alle stappen van de correlatieve workflow, maar vooral tijdens TEM, wordt aanbevolen om een overlay te maken van de geprojecteerde fluorescentiegegevens op de FIB-SEM/TEM-afbeeldingen. Dergelijke klassieke CLEM-weergaven helpen om intuïtiever te begrijpen welk deel van de cellen zich in de lamellen bevindt. Dit dient ook als een nuttige sanity check om de nauwkeurigheid van de correlatie te verifiëren.
3. Beperkingen van de methode
De 3D-correlatieve FIB-benadering vereist monsters die kunnen worden geleverd met fiduciale kralen. Dienovereenkomstig is deze methode momenteel beperkt tot diepgevroren roosters. Voor hogedruk (HPF) bevroren (weefsel) monsters kunnen momenteel alleen 2D-2D-correlaties worden uitgevoerd. Mogelijk kunnen interne fiduciale markers (bijv. organellen, gekleurde lipidedruppels) een oplossing zijn voor dit probleem32,33. Het uiteindelijke succespercentage van de correlatie hangt af van vele factoren, waaronder de kwaliteit van het monster, de fluorescentiemicroscopie-opstelling, de lamellendikte en de grootte van de beoogde structuur. De correlatienauwkeurigheid met behulp van de beschreven 3D-registratiebenadering wordt geschat op 200-300 nm op het uiteindelijke IB-beeld, ruwweg overeenkomend met de typische dikte van FIB-gefreesde lamellen7. Dienovereenkomstig zullen cellulaire structuren die veel kleiner zijn dan dit op dit moment moeilijk te richten zijn. Bovendien vermindert overmatige beweging op de freeslocatie (> 300 nm) ook de nauwkeurigheid van de correlatie, een probleem dat mogelijk kan worden aangepakt met FLM-opstellingen die zijn geïntegreerd in FIB / SEM-instrumenten. Lamellen die tijdens het frezen een sterke vervorming of buiging vertonen, moeten in ieder geval van de stroomafwaartse workflow worden uitgesloten.
Over het algemeen wordt cryofluorescentiebeeldvorming momenteel beperkt door het Abbe-diffractiecriterium. Met meer routinematige toepassing (en commercialisering) van super-opgeloste cryo-FLM-methoden, zou een nauwkeuriger targeting van cellulaire structuren mogelijk kunnen worden, vooral wanneer geïntegreerd in de FIB / SEM voor on-the-fly operatie.
4. Betekenis van de methode
Vooral in vergelijking met niet-gerichte en post-correlatietechnieken, maakt de 3D-gecorreleerde FIB-freesbenadering de selectie van geschikte posities mogelijk vóór de tijd- en resource-verslindende TEM-stap. Het maakt daardoor efficiëntere gegevensverzameling en projectplanning mogelijk. Bovendien voegen de gecorreleerde fluorescentiegegevens een laag informatie toe die cruciaal kan zijn voor het interpreteren van de tomogrammen en voor het integreren van de cryo-ET-resultaten in projecten op meerdere schalen, vooral wanneer het gaat om niet-gestructureerde eiwitassemblages of die te klein zijn voor sjabloonmatching en subtomogrammiddeling.
5. Belang en mogelijke toekomstige toepassingen
In combinatie met geavanceerde workflows zoals cryo-lift uit HPF-monsters 34,35, cryo-FIB-SEM volume 36 en superresolutiefluorescentiebeeldvorming26,37,38,39, biedt 3D-gerichte lamellenvoorbereiding het vooruitzicht om niet alleen biologische processen in geïsoleerde cellen te ontleden, maar ook om weefsel- en patiëntmonsters toegankelijk te maken voor FIB-frezen en cryo-elektronentomografie. Als zodanig zal het dissectie van pathologische processen met hoge resolutie mogelijk maken en dus een integrale bouwsteen zijn voor een biopsie op nanoschaal.

Gefocusseerd ionenbundelfrezen maakt de bereiding van dunne biologische monsters van cryo-gefixeerde monsters mogelijk zonder de problemen die gewoonlijk gepaard gaan met mechanische secties zoals mesmarkeringen en compressieartefacten1. In combinatie met cryo-elektronentomografie maakt FIB-frezen biologische studies met hoge resolutie van de cellulaire morfologie en bepaling van de structuur van macromoleculaire complexen rechtstreeks vanuit cellen mogelijk met subnanometerresolutie 2,3,4. Hoewel overvloedige soorten, zoals ribosomen, gemakkelijk worden gevonden in willekeurig gesneden FIB-lamellen, zijn veel cellulaire processen afhankelijk van de colokalisatie van verschillende complexen of zijn ze gelokaliseerd op specifieke plaatsen in de cel. Bijgevolg is efficiënte targeting vereist om het biologische kenmerk van belang tijdens het freesproces niet te verliezen en beperkt te blijven tot willekeurige treffers. Een correlatieve benadering die gegevens van de scanning elektronenmicroscoop (SEM)-FIB en een cryo-fluorescentielichtmicroscoop (FLM) combineert, is daarom noodzakelijk. Hoewel het mogelijk is om de initiële correlatie weg te laten en FLM- en cryo-ET-gegevens pas na TEM-acquisitie5,6 te combineren, maakt fluorescentiegeleid gericht ionenbundelfrezen een nauwkeurige selectie van het freesgebied vooraf mogelijk, wat resulteert in een efficiëntere gegevensverzameling. Sinds de conceptie7 was de toepassing van 3D-gecorreleerd FIB-frezen in biologische studies beperkt totdat we onlangs meldden dat we met behulp van deze techniek een nieuw vloeibaar-vloeibaar fasegescheiden (LLPS) compartiment in gist identificeerden8.
Hier wordt een gegeneraliseerd 3D cryo-gecorreleerd licht- en elektronenmicroscopieprotocol (CLEM) beschreven, dat kan worden gebruikt om een breed scala aan monsters te bestuderen, variërend van bacteriën tot gist- en zoogdiercellen. Hoewel de experimenten werden uitgevoerd met behulp van een bepaalde set instrumenten, zijn de afzonderlijke stappen niet gebonden aan specifieke hardware en kunnen ze gemakkelijk worden overgedragen naar andere systemen als een uitbreiding op bestaande protocollen 3,5. Een lijst met geteste apparatuur en voorgestelde instellingen vindt u in de materiaaltabel en tabel 1. De vier belangrijkste stappen van de pijplijn zijn (1) monstervoorbereiding, (2) lokalisatie van interessante kenmerken door cryofluorescentiemicroscopie, (3) 3D-gecorreleerd gefocusseerd ionenbundelfrezen en (4) lokalisatie van de beoogde structuren voor cryo-ET-gegevensverzameling op de lamellen in de cryotransmissie-elektronenmicroscoop (figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

Cryo-elektronentomografie (cryo-ET) is de voorkeursmethode geworden voor het onderzoeken van cellulaire ultrastructuur en moleculaire complexen in hun oorspronkelijke, bevroren-gehydrateerde toestand. Cryo-ET vereist echter dat monsters dun genoeg zijn om de invallende elektronenbundel niet te verstrooien of te blokkeren. Voor dikke cellulaire monsters kan dit worden bereikt door cryo-gerichte ionenbundel (FIB) frezen. Dit protocol beschrijft hoe specifieke cellulaire locaties tijdens FIB-frezen kunnen worden gericht met behulp van een 3D-correlatieve benadering, die driedimensionale fluorescentiemicroscopiegegevens combineert met informatie van de FIB-scannende elektronenmicroscoop. Met behulp van deze techniek kunnen zeldzame cellulaire gebeurtenissen en structuren met hoge nauwkeurigheid worden gericht en gevisualiseerd op moleculaire resolutie met behulp van cryo-transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM).

Het protocol biedt een walk-through van de pijplijn die wordt gebruikt om het EH-domeinbevattende en endocytose-eiwit 1 (Ede1) -afhankelijke endocytische eiwitafzetting (END) en de afbraak en vangst ervan in autofagische lichamente ontdekken 8. De END is een vloeistof-vloeistof fase-gescheiden compartiment in S. cerevisiae, dat een verscheidenheid aan eiwitten buffert die betrokken zijn bij clathrin-gemedieerde endocytose (CME) na mislukte endocytische gebeurtenissen. Een van de belangrijkste componenten is Ede1, dat ook dienst doet als CME-component en als selectieve autofagiereceptor voor de afbraak van dit nieuwe LLPS-compartiment. Dienovereenkomstig werd een EGFP-fusie van Ede1 (EGFP-Ede1) onder controle van de alcoholdehydrogenase (ADH) -promotor gebruikt om END's te visualiseren, aangezien Ede1-overexpressie interfereert met de vroege stadia van endocytose en daarom constitutief LLPS induceert.
Op een diepgevroren rooster met EGFP-Ede1 overexpressie gistcellen en 1 μm fiduciale markers werden vijf posities geselecteerd voor FLM stack acquisitie in het GFP kanaal (Figuur 6A; TFS Corrsight; confocale modus, 300 nm focus stap grootte, 10 μm bereik). Het raster werd overgebracht naar het FIB-instrument (Quanta 3D FEG) en de rastervierkanten waarvoor FLM-stapels waren verkregen, werden geïdentificeerd door een 2D-2D-correlatie uit te voeren van de fluorescentie- en SEM-rasteroverzichten (vergelijk stap 3.2).
Voor elk van de gekozen vierkanten werden ionenbundelbeelden gemaakt met een lage stroom (10 pA, 1200x vergroting) en overeenkomstige fiduciale posities werden geregistreerd in 3DCT. Na selectie van posities met het biologische kenmerk van belang en het passen van hun 3D-positie binnen de FLM-stapel, werd de gevonden transformatie toegepast op vermeende END-posities en werden de locaties voor lamellenpreparatie geselecteerd (figuur 6B). In de hier getoonde voorbeelden werd een FIB-balk gebruikt die 11° ten opzichte van het rasteroppervlak was gekanteld (45° FIB-shuttle voorkantelen; 18° trapkanteling). Interessante posities werden overgedragen en FIB-patronen werden handmatig getekend (figuur 6D) door de afstand van de voorspelde posities ten opzichte van prominente oriëntatiepunten in het FIB-beeld te meten (bijv. Gaten, ijsverontreinigingen, fiduciale kralen). De nauwkeurigheid van de registratie werd geëvalueerd door opzettelijk kralen weg te laten die duidelijk konden worden geïdentificeerd in het FLM- en IB-beeld en vervolgens hun werkelijke en voorspelde posities in de ionenbundelweergave te vergelijken (bijv. Diamant in figuur 6B, C). De correlatie voor het vierkant in figuur 6C bleek nauwkeurig te zijn (d.w.z. de voorspelde positie van FLM-kraalposities viel perfect samen met hun overeenkomstige IB-locatie en 3DCT rapporteerde subpixel RMSE-waarden voor de registratie). Zo werden lamellen gesneden op de voorspelde posities (site B) en fijngefreesd tot een dikte van ~ 200 nm (uiteindelijke patroonverschuiving).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve resultaten voor 3D-correlatieve targeting van endocytische eiwitafzettingen (END) in gist. (A) SEM-overzicht van het rooster vóór het frezen. De gekleurde vakken geven rastervierkanten aan waarvoor vooraf fluorescentiestapels zijn genomen. (B-C) 3D-correlatie in een rastervierkant. Na het registreren van verschillende overeenkomstige fiduciale kralen (gekleurde vakken) in de FLM-gegevens (B, hier weergegeven als maximale intensiteitsprojectie) en het ionenbundelbeeld (C), werd de nauwkeurigheid van de 3D-registratie geverifieerd door de positie van de kraal aangegeven met de diamant te voorspellen. Vervolgens werden de posities van het doelsignaal (rode cirkels) voorspeld in de ionenbundelweergave voor twee potentiële freeslocaties. (D) Inzoomen op site B met de voorspelde posities van drie doelpuncta (rode cirkels) en de initiële freespatronen (gele vakken). Een vierde fluorescentie punctum werd voorspeld veel lager te zijn dan de andere puncta en daarom niet gericht tijdens het frezen (grijze cirkel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Na succesvol FIB-frezen en overdracht van het net naar de cryotransmissie-elektronenmicroscoop (Titan Krios werkte op 300 kV en uitgerust met een Gatan K2 directe elektronendetector en Bioquantum-energiefilter), werd een rasteroverzicht opgenomen in SerialEM en gebruikt om vierkanten met lamellen te lokaliseren. Voor elke lamellen werden overzichtsbeelden verkregen en de FLM-gegevens werden geregistreerd in 3DCT (3D-2D) met behulp van overeenkomstige fiduciale kralen. Posities van de biologische kenmerken van belang (figuur 7A) werden vervolgens voorspeld met behulp van de transformatie berekend uit de fiduciale kralen. Lamellenoverzichten die bij een hogere vergroting werden geregistreerd, werden gestikt en interessante plaatsen correleerden met duidelijk zichtbare oriëntatiepunten (bijv. Fiduciale kralen). Als alternatief kunnen klassieke CLEM-overzichten worden geproduceerd in verschillende softwares10,12.
Op basis van de correlatie werden vier potentiële locaties voor tomogramacquisitie gevonden voor de lamellen die in figuur 7A worden weergegeven. Dit omvat echter ook een positie die niet werd beoogd tijdens het 3D-gecorreleerde FIB-frezen (vergelijk figuur 6D; grijze cirkel) en een positie geblokkeerd door ijsverontreiniging (figuur 7; grijze vakken). Dienovereenkomstig konden tomogrammen slechts voor twee posities worden geregistreerd (figuur 7B). Over het algemeen werd een correlatiesucces van ~ 75%, d.w.z. lamellen die de overdracht naar de TEM- en END-structuren overleefden, gevonden op de voorspelde locaties, werd bereikt (12 gecorreleerde locaties). Na tomogramreconstructie, segmentatie en template matching kunnen individuele END-structuren worden gevisualiseerd binnen hun oorspronkelijke context (Figuur 7C,D). Dit omvat het fenestrated endoplasmatisch reticulum (ER) rond de END, lipidedruppeltjes die af en toe contact maken en ribosomen, die zijn uitgesloten van het LLPS-compartiment. Alles bij elkaar laat dit zien hoe 3D-correlatief FIB-frezen informatie op moleculair niveau kan bieden van zeldzame biologische processen uit intacte cellen.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> Figuur 7: Representatieve resultaten voor het visualiseren van het END met cryo-ET. (A) Het TEM-overzicht met lage vergroting van de maalplaats in figuur 6 kan gemakkelijk worden gecorreleerd met de FLM-projectie van de maximale intensiteit (figuur 6B) om biologische kenmerken van belang te lokaliseren (rode kruisen). (B) In een tweede stap kan een hogere vergroting (gestikt) worden gecorreleerd en worden posities voor tomogramacquisitie (gele vakken) ingesteld. Locaties die het gevolg waren van het out-of-plane signaal (grijs vak, vergelijk figuur 6D) werden genegeerd. (C-D) Met behulp van deze 3D-correlatieve FIB-benadering kan de endocytische eiwitafzetting (END) in zijn oorspronkelijke omgeving worden gevisualiseerd. Structuren zoals het endoplasmatisch reticulum (ER), ribosomen, membranen en lipidedruppels kunnen worden geïdentificeerd en gevisualiseerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plasma Cleaner-instellingen</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick Plasmareiniger PDG-3XG :</td>
			<td colspan="3">Radio frequentie setiing: "HI", 30 s; N2-plasma</td>
		</tr><tr><td>Instellingen plunjer</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">100% vochtigheid; blotforce = 8; vlekkertijd = 10 s; wachttijd 0 s; (dit zou moeten werken voor de meeste suspensie- en hechtcellen)</td>
		</tr><tr><td>FIB GIS-posities en -timings</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">Kantelen = 0, Rotatie = -180, Z-positie = 13,5, Temperatuur instelpunt = 26,15° , Tijd = 8 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">Kantelen = 0, Rotatie = -180, Z-positie = 9,8, Temperatuur instelpunt =28° C, Tijd = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">Software voorgedefinieerde positie, Temperatuur instelpunt = 28° , Tijd = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">Software voorgedefinieerde positie, Temperatuur instelpunt = 28°, Tijd = 7 s</td>
		</tr><tr><td>FIB Sputter Coater Instellingen</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quorumsysteem:</td>
			<td colspan="3">In quorumvoorbereidingskamer: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>Tomogram Acquisitie</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Titaan Krios Gi2</td>
			<td colspan="3">K2 camera, Gatan Bioquantum energiefilter</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eV spleet; dosissymmetrisch kantelschema (Hagen) met stappen van 2°; start bij +10° (lamellen voorkantelen!) tot +70°en -50°</td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Valk 4; Selectris X energiefilter</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eV spleet; dosissymmetrisch kantelschema (Hagen) met stappen van 2°; start bij +10° (lamellen voorkantelen!) tot +70° en -50°</td>
		</tr><tr><td>FLM Acquisitie</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Corrsight (confocale modus)</td>
			<td colspan="3">Doelstelling: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol; Stack acquisitie parameters: x-y pixelgrootte = 161,25 nm, z stapgrootte = 300 nm.</td>
		</tr><tr><td>Leica SP8 Cryo-confocale</td>
			<td colspan="3">Doelstelling: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; Stack acquisitie parameters: x-y pixelgrootte = 84 nm, z stapgrootte = 300 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Lijst van geteste apparatuur en voorgestelde instellingen.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

3D-correlatief FIB-frezen maakt specifieke en zelfs zeldzame cellulaire gebeurtenissen toegankelijk voor Cryo-TEM. Hierdoor kan de ultrastructuur van dit evenement direct in de oorspronkelijke omgeving worden onthuld. De correlatieve workflow verbetert het slagingspercentage van het richten op zeldzame cellulaire structuren en helpt ze ondubbelzinnig te identificeren in de drukke cellulaire omgeving.Anna Bieber en Christina Capitanio, experts in correlatieve cryo-elektronentomografie, zullen de procedure demonstreren. Begin met de cryo-fluorescentiemicroscopie van de celgezaaide rasters door een breed veldoverzicht te verkrijgen in fluorescentie- en gereflecteerde "modus. Selecteer vervolgens geschikte rastervierkanten met fluorescentiesignaal.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de cellen en kralen gelijkmatig naar het midden van elk vierkant zijn verdeeld, kiest u de vierkanten op 200 netrasters die toegankelijk zijn voor zowel het FIB-SEM- als het TEM-instrument en ten minste drie vierkanten verwijderd zijn van de rasterrand. Verkrijg op elk van de geselecteerde rastervierkanten een fluorescerende stapel met een geschikte gerichte stap. Objectieven met een hoog numeriek diafragma moeten worden gebruikt om het aantal fotonen en de lokalisatienauwkeurigheid te verhogen.Op een confocale microscoop met numeriek diafragma 0,9 objectief, verwerven stapels met 300 nanometer stapgrootte en oversampling van de Nyquist-waarde. Neem meerdere kleurstapels op en bewaar rasters onder vloeibare stikstof tot verder gebruik. Gebruik de uitsparings- of oriëntatiemarkeringen om ervoor te zorgen dat het raster goed is georiënteerd voor latere plaatsing in de TEM.Laad de roosters in het cryo FIB-SEM instrument. Zorg ervoor dat de freesrichting loodrecht staat op de kantelas van de TEM. Om de roosters te coaten met een beschermende organometaallaag, gebruikt u een plasmacoder en gasinjectiesysteem op de podiumposities die vooraf zijn gedefinieerd door de FIB-SEM-opstelling.Neem vervolgens het SEM-rasteroverzicht op en voer een 2D-correlatie uit met FLM-overzichten. Zoek de rastervierkanten door handmatig opgenomen rasteroverzichten te inspecteren of een softwarepakket te gebruiken. Selecteer en markeer vier overeenkomstige posities voor de vierkanten in het FLM- en SEM-rasteroverzicht en bereken de transformatie tussen de gemarkeerde punten voor FLM-SEM-correlatie.Plaats vervolgens de markeringen in het midden van de overeenkomstige rastervierkanten waarvoor FLM-stapels zijn verkregen voordat u hun positie in de SEM-weergave voorspelt. Neem voor elk gecorreleerd rastervierkant een ionenbundelafbeelding met lage stroom bij de FIB-freeshoek naar keuze en selecteer een gezichtsveld met de gewenste positie en vergroting die overeenkomt met de fluorescentiegegevens. Voor 200 netrasters verkrijgt u FIB-SEM-gegevens om enkele rastervierkanten te bevatten, inclusief de rasterbalken.Maak vervolgens een SEM-afbeelding van hetzelfde vierkant om te helpen bij de identificatie van overeenkomstige kralen in de fluorescentie- en ionenbundelweergave. Voer registratie uit van de onbewerkte of gedeconvoleerde 3D FLM-stack en de 2D-ionenbundelweergave voor elke positie met de 3D-correlatietoolbox, 3D CT, door de overeenkomstige opnieuw gesneden 3D FLM-stack en ionenbundelweergave in 3D CT.In de fluorescentiegegevens te laden, vier fiduciale kralen te selecteren en met de rechtermuisknop op de positielijst te klikken om de 3D-positie van de kralen te bepalen via Gaussische aanpassing van het signaal in X, Y en Z.Selecteer vervolgens de bijbehorende kralen in de ionenbundelafbeelding om een eerste 3D-correlatie uit te voeren. Voeg op dezelfde manier meer kralen toe aan de registratie om de nauwkeurigheid van de correlatie te controleren.Laat enkele fiduciale kralen weg die duidelijk herkenbaar zijn in zowel fluorescentie als ionenbundel door hun voorspelde versus werkelijke locatie in het ionenbundelbeeld te controleren. In 3D CT kunnen root mean square error"- of RMSE-waarden worden bekeken om de correlatieconsistentie te beoordelen. Zorg ervoor dat de RMSE-waarden klein zijn en in de volgorde van lokalisatienauwkeurigheid staan.Selecteer vervolgens de beoogde cellulaire signalen en pas de 3D-positie in de FLM-stapel voordat u de transformatie toepast om de doelposities in de ionenbundelweergave te voorspellen. Breng voor elk gecorreleerd vierkant de voorspelde posities van de interessante kenmerken over naar het FIB-SEM-instrument om de lamellenfreespatronen te plaatsen. Als er meerdere signalen per cel zijn, plaats dan de patronen om de maximaal mogelijke aandachtspunten in dezelfde lamellen op te nemen.Ruw frezen de lamellen gevolgd door fijn frezen om een uiteindelijke dikte van 150 tot 250 nanometer te krijgen. Zorg ervoor dat de lamellenoriëntatie loodrecht op de kantelas staat bij het laden van de roosters in de transmissie-elektronenmicroscoop. Verkrijg rastermontage en overzichten voor elk rastervierkant met lamellen met geschikte vergroting en belichtingstijd om de fiduciale kralen in de TEM-afbeeldingen te visualiseren zonder de totale elektronendosis aanzienlijk te verhogen.Verkrijg TEM-kaarten met hoge resolutie van elke lamellen. Register en 3D-2D correleren de FLM-stack met het TEM-rastervierkant en de lamellenoverzichten in 3D CT. Voer een correlatie uit tussen FLM en TEM van lage naar hoge vergroting in TEM. Na het overbrengen van de posities, het instellen en uitvoeren van tilt-series op gecorreleerde posities"gebruik vervolgens een geschikte vergroting, onscherpte en totale dosis om de beeldacquisitie te starten bij de pre-tilt bepaald door de lamellen met behulp van een dosissymmetrisch kantelschema.Volg handmatige of batchacquisitie van afbeeldingen. In de representatieve analyse wordt het TEM-overzicht met lage vergroting van de maalplaats getoond om biologische kenmerken van belang te lokaliseren. Later werd een hogere vergrotingsweergave gecorreleerd met FLM-projectie met maximale intensiteit en werden posities voor tomogramacquisitie ingesteld.In de verkregen beelden kon de endocytische eiwitafzetting in zijn oorspronkelijke omgeving worden gevisualiseerd. De optimalisatie van de steekproef is erg belangrijk. De rastervoorbereiding moet worden geoptimaliseerd om een goede verdeling van cellen te frezen en een groot aantal zichtbare fiduciale kralen in de meeste rastervierkanten te hebben.3D-correlatief frezen heeft geholpen om de ultrastructuur van verschillende cellulaire processen te onthullen, zoals de stapsgewijze progressie van autofagie in elke cel, en het wordt gebruikt om een nieuw fasegescheiden compartiment vast te leggen.

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Met behulp van hoge resolutie Computed Tomography om de driedimensionale structuur en functie van Plant vaatstelsel Visualiseer

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektron microscopie Specimen Voorbereiding door middel van een Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Do&#39;s en Don&#39;ts van cryo-elektronenmicroscopie: A Primer op Monstervoorbereiding en hoge kwaliteit Data Collection voor Macromolecular 3D Wederopbouw

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...