Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

אנו מודים לאינגה וולף על התמיכה בתשתית ה-IT, לפלוריאן בק על התמיכה החישובית, ולאודה ה. שיוץ על הקריאה הביקורתית של כתב היד. המימון ניתן בחלקו באמצעות מלגת אלכסנדר פון הומבולדט לפיליפ ס. ארדמן ומלגת EMBO לטווח ארוך ALTF 764-2014 לפלוריאן וילפלינג. אנה ביבר נתמכה על ידי מלגת Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D.

<ol>
	<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+tomography:+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail.">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li><li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins.">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-correlative+light+and+electron+microscopy+workflow+for+cryo-focused+ion+beam+milled+adherent+cells.">Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 162, 273-302 (2021).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies.">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li><li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy.">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits.">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li><li>. Scientific volume imaging, Nyquist calculator Available from: <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>. 3DCT Available from: <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021)</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745 (2021).</li><li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae.">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0 (2019).</li><li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology.">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).</li><li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling.">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033 (2020).</li><li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286 (2020).</li><li>. tools3dct Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021)</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>B&#228;uerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions.">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions.">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li><li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crinkling:+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature.">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li><li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images.">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li><li>. Delmic METEOR Available from: <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021)</li><li>. iFLM Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021)</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association.">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li><li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging.">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714 (2021).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms.">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue.">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li><li>Wu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context.">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017 (2015).</li><li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision.">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li><li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins.">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

1. שלבים קריטיים בפרוטוקול
אופטימיזציה של תרבית תאים ופרמטרים של צניחת רשת היא בסיסית עבור זרימת עבודה זו. בתחילת הפרויקט, כדאי להשקיע זמן כדי לייעל אסטרטגיות תיוג, את התפלגות התאים ואת חרוזי fiducial, ולבדוק פרמטרים שונים של הכנת רשת ו blotting. עבודה עם דגימה קפואה אופטימלית תקל באופן משמעותי על עיבוד במורד הזרם.
כמו בכל ניסוי TEM, דגימות זגוגית נדרשות. עבור תאי יונקים גדולים כגון HeLa, 1-2 תאים לכל ריבוע רשת עדיפים, אך תאים עדיין עשויים להיות זגוגיים בצפיפות גבוהה יותר. לחלופין, ניתן לשפר את הוויטריפיקציה בתאי יונקים (למשל, HEK293, HeLa) על ידי דגירה שלהם עם גליצרול של 2.5-10% (v/v) שנוסף למדיום התרבית 10 דקות לפני צלילה23. במידת האפשר, ניתן להשתמש בתבניות רשת כדי להבטיח מיקום ופיזור מושלמים של התאים, ובכך לשפר את הוויטריפיקציה ומתאם מאוחר יותר24.
בעוד שניתן לבחור תאים ספציפיים במהלך זרימת העבודה, מעט מדי תאים המציגים את התכונה הביולוגית המעניינת יפחיתו באופן משמעותי את התפוקה הכוללת. כדי לשפר את המתאם בתאים חיוביים POI, יש להשתמש בפלואורופורים בהירים מספיק. זה חשוב במיוחד ברמות ביטוי אנדוגניות. מצאנו כי בתנאי קריו, mVenus לעתים קרובות תפקד טוב יותר מאשר EGFP בשל בהירותו המוגברת25 והשינוי ההיפסוכרומי, מה ששומר אותו מתאים להגדרות מסנן GFP סטנדרטיות בתנאי הקפאה26. עבור מבני מטרה שאינם דמויי נקודה, יש לשקול גם את הפשרה בין אורך גל לדיוק לוקליזציה (גבול עקיפה של Abbe).
מתאם תלת-ממדי יעיל דורש גם שהרשתות יהיו יציבות מבחינה מכנית ויטופלו בזהירות רבה. בעוד שניתן להשתמש ברשתות זהב או נחושת סטנדרטיות עם תמיכת פחמן, ניתן להגדיל את שיעור ההצלחה באופן משמעותי על ידי שימוש בסרטי SiO2 קשיחים יותר בהתאם לפרויקט. עם זאת, עדיין לא נקבע באופן חד משמעי אם (א) יציבות מכנית או (ב) מקדמי התפשטות תרמית תואמים (מצע לעומת יריעה) להפחתת קמטים בהקפאה27, הם הגורם המכריע ביותר למתאם תלת-ממדי מוצלח. יתר על כן, עבור להרים רשתות Au שבירות, מנות מצופות polydimethylsiloxane ניתן להשתמש5.
בנוסף להבטחת יציבות הדגימה, יש צורך בבחירה זהירה של פרמטרי הדמיה FLM לקבלת ערימות פלואורסצנטיות באיכות גבוהה המתאימות למיקוד אופטימלי במהלך כרסום FIB. בהקשר זה, מומלץ גם לבדוק טכניקות שונות של denoising28 או deconvolution על נתוני FLM, שכן הוא עשוי לשפר במידה ניכרת את הלוקליזציה של fiducials ואותות סלולריים. כאשר מקשרים את האות הפלואורסצנטי לתמונות FIB-SEM, דגימה טובה של חרוזים פידוקיאליים חשובה. הם צריכים להיות מפוזרים היטב סביב התאים ואולי בגבהים z שונים. זה גם נוהג טוב לאמת את עקביות המתאם על ידי בדיקת המיקומים החזויים לעומת בפועל של חרוזים שהושארו בכוונה מחוץ למודל הפידוקיאלי אך ניתן לתאם בבירור בעין. יש לשקול תמיד גם את ערכי RMSE של 3DCT כדי לבדוק את עקביות הרישום.
מכיוון שקיעת חומר טחון ומים שיוריים מתא FIB-SEM (כלומר, זיהום מחדש) מגדילה את עובי הלמלה האפקטיבי על ידי הוספת חומר אמורפי לשני צדדיו, שמירה על למלות טחונות עדינות במיקרוסקופ למשך זמן ממושך בדרך כלל מפחיתה את איכות נתוני TEM עקב אירועי פיזור אלקטרונים נוספים. לפיכך, כרסום מבוצע לרוב בצורה דו-שלבית: ראשית, כל המיקומים נטחנים בערך (כלומר, לכ 800 ננומטר), ולאחר מכן דק (ל~ 150-250 ננומטר), והרשת נפרקת מיד לאחר השלמת הלמלה האחרונה. עם זאת, ניתן להשיג הצלחה קורלציונית טובה יותר על ידי עיבוד עמדות העניין באופן חכם באתר, ומכאן ביצוע כרסום גס ועדין על אותה למלה ישירות זו אחר זו, שכן זה לא משאיר זמן לכיפוף או עיוות. זה, עם זאת, מפחית את המספר המרבי של lamellas שניתן לייצר בכל רשת בהתאם לקצב זיהום מחדש של המערכת. בקצב של 20 ננומטר / שעה, 4-6 lamellas מיוצרים בתוך 1-1.5 שעות.
תנועה של הרשת כולה או של הלאמלות הגסות >300 ננומטר תגרום למתאם גרוע או לא מוצלח (ראו גם מגבלות שיידונו להלן). לכן יש לבדוק אותו באופן קבוע, למשל על ידי השוואת תמונות IB לפני, במהלך ואחרי כרסום FIB. אתרים המראים תנועה משמעותית (>300 ננומטר) יש להשליך. מטב את הכנת הדגימה (כלומר, בחירת סוג הרשת, צפיפות התא ופרמטרים של צלילה; ראה פרוטוקול סעיף 1) ואסטרטגיית כרסום כדי למנוע תנועות אלה. ניתן להפחית באופן משמעותי את כיפוף הלמלה על ידי כרסום מבחינת האתר כמתואר בשלב 3.6 והקטנת רוחב הלמלה. כפי שהוזכר קודם, בעוד חתכים להפגת מתח 15 תוכננו כדי להפחית את כיפוף הלמלה, הם לעתים קרובות גורמיםלתנועה מתואמת של הלמלה המנותקת, ובכך מונעים למעשה קורלציה. ניתן להשתמש במערכות FLM משולבות כדי לפתור בעיה זו.
2. שינויים ובעיות של השיטה
מומלץ מאוד לבצע אפיון יסודי של הדגימה בהדמיה של תאים חיים לפני היציאה לתנאי הקפאה. אופטימיזציה של דגימות התאים, תוכניות הטיפול, והידיעה לאיזה סוג של אות לצפות לפני הכניסה לזרימת העבודה הקרויה יכולה לשפר באופן משמעותי את שיעור ההצלחה שלה.
בתהליך העבודה המוצג כאן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עצמאי עם שלב קריו-שלב משמש לצילום הדגימות, ואחריו העברה של הרשתות למיקרוסקופ קרן היונים הממוקדת. עם זאת, הוא נבדק על מערכות שבהן מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב בתא FIB-SEM, ולכן אין צורך בהעברת דגימה כדי לקבל תמונות פלואורסצנטיות 29,30,31. באמצעות מערכות משולבות כאלה, ניתן לצלם עמדות עניין במהלך כרסום FIB ולאחריו כדי לבדוק את נוכחותו של אות הפלואורסצנטיות של המטרה מבלי להגדיל את הסיכון לזיהום הלמלות הסופיות. עם זאת, חשוב לזכור את הפרמטרים האופטיים של המיקרוסקופים המשומשים, כמו, למשל, מטרת NA נמוכה תגביל את הדיוק שבו ניתן למקם חרוזים ואותות מטרה. עם זאת, הגדרות FLM משולבות יסייעו גם להתמודד טוב יותר עם עיוותים קלים של רשתות ולמלות, מכיוון שניתן לעדכן באופן רציף ערימות FLM ולהשוות אותן לתצוגות SEM ו- IB עדכניות.
כחלופה להדמיית פלואורסצנטיות של הלמלה בין כרסום FIB ורכישת נתוני TEM, ניתן להשתמש בקורלציה שלאחר TEM כדי לאמת מיקום וכרסום נכונים של הלמלות 5,6.
במהלך כל השלבים של זרימת העבודה המתאמת, אך במיוחד במהלך TEM, מומלץ ליצור שכבת-על של נתוני הפלואורסצנטיות המוקרנים בתמונות FIB-SEM/TEM. השקפות CLEM קלאסיות כאלה עוזרות להבין באופן אינטואיטיבי יותר איזה חלק של התאים נמצא בתוך הלאמלות. זה משמש גם כבדיקת שפיות שימושית כדי לאמת את דיוק הקורלציה.
3. מגבלות השיטה
גישת FIB עם מתאם תלת-ממדי דורשת דגימות שניתן לספק עם חרוזים fiducial. בהתאם לכך, שיטה זו מוגבלת כיום לרשתות קפואות. עבור דגימות קפואות (רקמות) בלחץ גבוה (HPF), כיום ניתן לבצע רק מתאמים דו-ממדיים. באופן פוטנציאלי, סמנים פידוקיאליים פנימיים (למשל, אברונים, טיפות שומנים מוכתמות) יכולים להיות פתרון לבעיה זו32,33. שיעור ההצלחה הסופי של המתאם תלוי בגורמים רבים, כולל איכות הדגימה, מערך המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, עובי הלמלה וגודל מבנה היעד. דיוק המתאם באמצעות גישת הרישום התלת-ממדית המתוארת מוערך בטווח של 200-300 ננומטר בתמונת IB הסופית, המקביל בערך לעובי האופייני של למלותטחונות FIB 7. בהתאם לכך, מבנים תאיים קטנים בהרבה מזה יהיה קשה למיקוד כרגע. בנוסף, תנועה מוגזמת באתר הכרסום (>300 ננומטר) מפחיתה גם היא את דיוק הקורלציה, בעיה שניתן לטפל בה באמצעות הגדרות FLM המשולבות במכשירי FIB/SEM. Lamellas המראים עיוות חזק או כיפוף במהלך כרסום צריך, בכל מקרה, להיות מחוץ זרימת העבודה במורד הזרם.
בסך הכל, הדמיית קריו-פלואורסצנטיות מוגבלת כיום על ידי קריטריון עקיפה של Abbe. עם יישום שגרתי יותר (ומסחור) של שיטות cryo-FLM סופר-פתורות, מיקוד מדויק יותר של מבנים סלולריים עשוי להיות אפשרי, במיוחד כאשר משולבים ב- FIB/SEM לפעולה תוך כדי תנועה.
4. משמעות השיטה
במיוחד בהשוואה לטכניקות לא ממוקדות ופוסט-קורלציה, גישת כרסום FIB במתאם תלת-ממדי מאפשרת בחירת מיקומים מתאימים לפני שלב TEM הגוזל זמן ומשאבים. בכך הוא מאפשר איסוף נתונים יעיל יותר ותכנון פרויקטים. יתר על כן, הנתונים הפלואורסצנטיים המתואמים מוסיפים שכבת מידע שיכולה להיות חיונית לפענוח הטומוגרפיה ולשילוב תוצאות cryo-ET בפרויקטים בקנה מידה גדול, במיוחד כאשר מדובר במכלולי חלבונים לא מובנים או כאלה קטנים מדי להתאמת תבניות וממוצע תת-טומוגרפיה.
5. חשיבות ויישומים עתידיים פוטנציאליים
בשילוב עם זרימות עבודה מתקדמות כגון הרמת הקפאה מתוך דגימות HPF 34,35, נפח cryo-FIB-SEM 36 והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה מעולה26,37,38,39, הכנת למלה ממוקדת תלת-ממד מציעה את האפשרות לא רק לנתח תהליכים ביולוגיים בתאים מבודדים, אלא גם להפוך דגימות רקמות וחולים לנגישות לכרסם FIB וטומוגרפיה של אלקטרונים קריו-אלקטרונים. ככזה, הוא יאפשר דיסקציה של תהליכים פתולוגיים ברזולוציה גבוהה ובכך יהווה אבן בניין אינטגרלית לקראת ביופסיה בקנה מידה ננומטרי.

כרסום קרן יונים ממוקד מאפשר הכנת דגימות ביולוגיות דקות מדגימות קבועות בהקפאה ללא הבעיות הקשורות בדרך כלל לחתכים מכניים כגון סימני סכין וחפצי דחיסה1. בשילוב עם טומוגרפיה קריו-אלקטרונית, כרסום FIB מאפשר מחקרים ביולוגיים ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה התאית וקביעת המבנה של קומפלקסים מקרומולקולריים ישירות מתוך תאים ברזולוציה תת-ננומטרית 2,3,4. בעוד מינים רבים, כגון ריבוזומים, נמצאים בקלות בלמלות FIB שנחתכו באופן אקראי, תהליכים תאיים רבים מסתמכים על קולוקליזציה של מספר קומפלקסים או ממוקמים לאתרים ספציפיים בתוך התא. כתוצאה מכך, מיקוד יעיל נדרש כדי לא לאבד את התכונה הביולוגית של עניין במהלך תהליך הכרסום ולהיות מוגבל לפגיעות אקראיות. לכן יש צורך בגישה מתאמתית המשלבת נתונים ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)-FIB ומיקרוסקופ אור קריו-פלואורסצנטי (FLM). בעוד שניתן להשמיט את המתאם הראשוני ולשלב נתוני FLM ו- cryo-ET רק לאחר רכישת TEM5,6, כרסום קרן יונים ממוקד מונחה פלואורסצנטיות מאפשר בחירה מדויקת של אזור הכרסום מראש, ובכך מביא לאיסוף נתונים יעיל יותר. מאז תפיסתו7, היישום של כרסום FIB מתואם תלת-ממד במחקרים ביולוגיים היה מוגבל עד שדיווחנו לאחרונה על זיהוי תא חדש המופרד פאזה נוזלי-נוזלי (LLPS) בשמרים באמצעות טכניקה זו8.
מתואר כאן פרוטוקול מיקרוסקופ אור ואלקטרונים תלת-ממדי מתואם קריו-ממדי (CLEM), שניתן להשתמש בו כדי לחקור מגוון רחב של דגימות, החל מחיידקים ועד תאי שמרים ויונקים. בעוד שהניסויים בוצעו באמצעות סט מסוים של מכשירים, השלבים הבודדים אינם כבולים לחומרה ספציפית וניתן להעביר אותם בקלות למערכות אחרות כהרחבה לפרוטוקולים קיימים 3,5. רשימה של ציוד נבדק והגדרות מוצעות מופיעות בטבלת החומרים ובטבלה 1. ארבעת השלבים העיקריים של הצינור הם: (1) הכנת דגימות, (2) לוקליזציה של תכונות מעניינות באמצעות מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, (3) כרסום קרן יונים ממוקד במתאם תלת-ממדי, ו-(4) לוקליזציה של המבנים המיועדים לרכישת נתוני קריו-ET על הלאמות במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-הולכה (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

טומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryo-ET) הפכה לשיטת הבחירה לחקר אולטרה-מבנה תאי וקומפלקסים מולקולריים במצבם הטבעי, קפוא. עם זאת, cryo-ET דורש שהדגימות יהיו דקות מספיק כדי לא לפזר או לחסום את קרן האלקטרונים של האירוע. עבור דגימות תאיות עבות, ניתן להשיג זאת על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת הקפאה (FIB). פרוטוקול זה מתאר כיצד להתמקד באתרים סלולריים ספציפיים במהלך כרסום FIB באמצעות גישה תלת-ממדית מתאמת, המשלבת נתוני מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת-ממדי עם מידע ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק FIB. באמצעות טכניקה זו, ניתן למקד אירועים ומבנים תאיים נדירים בדיוק גבוה ולהמחיש אותם ברזולוציה מולקולרית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-שידור (cryo-TEM).

הפרוטוקול מספק סיור בצנרת המשמשת לגילוי מרבץ החלבון האנדוציטי התלוי בתחום EH ואנדוציטוזה 1 (Ede1) (END) והפירוק והלכידה שלו בגופים אוטופגיים8. END הוא תא מופרד פאזה נוזלי-נוזלי בשמרי אפייה (S. cerevisiae), החוצץ מגוון חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלאתרין (CME) לאחר אירועים אנדוציטיים כושלים. אחד המרכיבים העיקריים שלה הוא Ede1, אשר משמש כרכיב CME וכקולטן אוטופגיה סלקטיבית לפירוק תא LLPS חדש זה. בהתאם לכך, נעשה שימוש באיחוי EGFP של Ede1 (EGFP-Ede1) תחת שליטתו של מקדם האלכוהול דהידרוגנאז (ADH) כדי לדמיין ENDs מכיוון שביטוי יתר של Ede1 מפריע לשלבים המוקדמים של אנדוציטוזה ולכן גורם באופן מכונן LLPS.
ברשת קפואה עם תאי שמרים בעלי ביטוי יתר של EGFP-Ede1 וסמנים פידוקיאליים של 1 מיקרומטר, נבחרו חמישה מיקומים לרכישת מחסנית FLM בערוץ GFP (איור 6A; TFS Corrsight; מצב קונפוקל, גודל צעד מיקוד של 300 ננומטר, טווח של 10 מיקרומטר). הרשת הועברה למכשיר FIB (Quanta 3D FEG), וריבועי הרשת שעבורם נרכשו ערימות FLM זוהו על ידי ביצוע מתאם דו-ממדי של סקירות הרשת הפלואורסצנטיות וה-SEM (השווה שלב 3.2).
עבור כל אחד מהריבועים שנבחרו, תמונות קרן יונים צולמו בזרם נמוך (10 pA, הגדלה של 1200x), ומיקומים פידוקיאליים תואמים נרשמו ב- 3DCT. לאחר בחירת מיקומים בעלי תכונה ביולוגית מעניינת והתאמת המיקום התלת-ממדי שלהם בתוך ערימת ה-FLM, הטרנספורמציה שנמצאה יושמה על מיקומי END משוערים, ונבחרו האתרים להכנת למלה (איור 6B). קרן FIB הנוטה 11° ביחס למשטח הרשת שימשה בדוגמאות המוצגות כאן (45° FIB מעבורת pre-tilt; הטיית שלב 18°). מיקומים מעניינים הועברו, ותבניות FIB שורטטו באופן ידני (איור 6D) על-ידי מדידת המרחק של המיקומים החזויים ביחס לציוני דרך בולטים בתמונת FIB (למשל, חורים, זיהומי קרח, חרוזים פידוקיאליים). דיוק הרישום הוערך על ידי השמטת חרוזים שניתן היה לזהות בבירור בתמונת FLM ו-IB, ולאחר מכן השוואת מיקומם בפועל והחזוי בתצוגת קרן היונים (למשל, יהלום באיור 6B,C). המתאם עבור הריבוע המוצג באיור 6C נמצא מדויק (כלומר, המיקום החזוי של מיקומי חרוזי FLM חפף באופן מושלם עם מיקום IB המתאים שלהם וערכי RMSE של תת-פיקסלים המדווחים ב-3DCT עבור הרישום). לפיכך, למלות נחתכו במיקומים החזויים (אתר B) וטחנו דק לעובי של ~200 ננומטר (קיזוז תבנית סופית).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות עבור מיקוד תלת-ממדי של משקעי חלבון אנדוציטי (END) בשמרים. (A) סקירת SEM של הרשת לפני הכרסום. הקופסאות הצבעוניות מציינות ריבועי רשת שעבורם נלקחו מראש ערימות פלואורסצנטיות. (B-C) מתאם תלת-ממדי בריבוע רשת. לאחר רישום מספר חרוזים פידוקיאליים תואמים (קופסאות צבעוניות) בנתוני FLM (B, המוצגים כאן כהקרנה בעוצמה מרבית) ובתמונת קרן היונים (C), אומת הדיוק של הרישום התלת-ממדי על ידי חיזוי מיקום החרוז המצוין עם היהלום. לאחר מכן, נחזו מיקומי אות המטרה (עיגולים אדומים) בתצוגת קרן היונים עבור שני אתרי כרסום פוטנציאליים. (D) זום אין של אתר B המציג את המיקומים החזויים של שלושה פונקטה מטרה (עיגולים אדומים) ואת תבניות הכרסום הראשוניות (קופסאות צהובות). פונקטום פלואורסצנטי רביעי נחזה להיות נמוך בהרבה מהפונקטה השנייה ולכן לא היה ממוקד במהלך הכרסום (עיגול אפור). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לאחר כרסום FIB מוצלח והעברת הרשת למיקרוסקופ אלקטרונים בשידור קריו-תמסורת (טיטאן קריוס פעל במהירות של 300 קילו-וולט וצויד בגלאי אלקטרונים ישיר Gatan K2 ובמסנן אנרגיה ביוקוונטית), נרשמה סקירת רשת ב-SerialEM ושימשה לאיתור ריבועים עם למלות. עבור כל למלה נרכשו תמונות סקירה, ונתוני FLM נרשמו ב-3DCT (3D-2D) באמצעות חרוזים פידוקיאליים תואמים. מיקומים של המאפיינים הביולוגיים המעניינים (איור 7A) נחזו לאחר מכן באמצעות הטרנספורמציה שחושבה מהחרוזים הפידוקיאליים. סקירות Lamella שתועדו בהגדלה גבוהה יותר נתפרו, ואתרים מעניינים היו מתואמים באמצעות ציוני דרך גלויים בבירור (למשל, חרוזים fiducial). לחלופין, ניתן להפיק סקירות CLEM קלאסיות בתוכנותשונות 10,12.
בהתבסס על המתאם, נמצאו ארבעה אתרים פוטנציאליים לרכישת טומוגרפיה עבור הלמלה המוצגת באיור 7A. אולם זה כולל גם מיקום שלא הותקף במהלך כרסום FIB מתואם תלת-ממד (השוו איור 6D; עיגול אפור) ומיקום שנחסם על-ידי זיהום קרח (איור 7; קופסאות אפורות). בהתאם לכך, ניתן היה להקליט טומוגרפיה רק עבור שתי עמדות (איור 7B). בסך הכל, הושגה הצלחה במתאם של ~75%, כלומר למלות ששרדו את המעבר למבני TEM ו-END באתרים החזויים (12 אתרים מתואמים). לאחר שחזור טומוגרפיה, סגמנטציה והתאמת תבניות, ניתן להמחיש מבני END בודדים בהקשר המקורי שלהם (איור 7C,D). זה כולל את הרשתית האנדופלסמית (ER) המקיפה את ה- END, טיפות שומנים מדי פעם יוצרות מגע, וריבוזומים, שאינם נכללים בתא LLPS. יחד, זה מראה כיצד כרסום FIB מתאם תלת-ממדי יכול לספק מידע ברמה המולקולרית של תהליכים ביולוגיים נדירים מתאים שלמים.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> איור 7: תוצאות מייצגות להמחשת END עם cryo-ET. (A) סקירת TEM בהגדלה נמוכה של אתר הכרסום המוצגת באיור 6 יכולה להיות מתואמת בקלות עם היטל העוצמה המרבית FLM (איור 6B) כדי למקם מאפיינים ביולוגיים מעניינים (צלבים אדומים). (B) בשלב שני, ניתן להתאים תצוגה גבוהה יותר (תפורה), ולהגדיר מיקומים לרכישת טומוגרפיה (קופסאות צהובות). התעלמו ממיקומים שנבעו מהאות מחוץ למישור (תיבה אפורה, השוו איור 6D). (ג-ד) באמצעות גישת FIB תלת-ממדית זו, ניתן לדמיין את מרבץ החלבון האנדוציטי (END) בסביבתו הטבעית. מבנים כגון הרשתית האנדופלסמית (ER), ריבוזומים, ממברנות וטיפות שומנים ניתנים לזיהוי ולהמחשה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>הגדרות מנקה פלזמה</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick פלזמה מנקה PDG-3XG :</td>
			<td colspan="3">תדר רדיו setiing: "HI", 30 שניות; פלזמה N2</td>
		</tr><tr><td>הגדרות בוכנה</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot סימן IV:</td>
			<td colspan="3">100% לחות; blotforce = 8; blottime = 10 שניות; זמן המתנה 0 שניות; (זה אמור לעבוד עבור רוב תאי המתלה והדבק)</td>
		</tr><tr><td>מיקומים ותזמונים של FIB GIS</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">הטיה = 0, סיבוב = -180, מיקום Z = 13.5, נקודת הגדרת טמפרטורה = 26.15° , זמן = 8 שניות</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">הטיה = 0, סיבוב = -180, מיקום Z = 9.8, נקודת הגדרת טמפרטורה = 28° C, זמן = 7 שניות</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">מיקום מוגדר מראש של תוכנה, נקודת טמפרטורה = 28°, זמן = 7 שניות</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">מיקום מוגדר מראש של תוכנה, נקודת הגדרת טמפרטורה = 28°, זמן = 7 שניות</td>
		</tr><tr><td>הגדרות FIB Sputter Coater</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>מערכת מניין:</td>
			<td colspan="3">בתא הכנה מניין: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0.2 mbar, 15 שניות</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 שניות</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 שניות</td>
		</tr><tr><td>רכישת טומוגרמה</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>טיטאן קריוס Gi2</td>
			<td colspan="3">מצלמת K2, מסנן אנרגיה ביוקוונטי Gatan</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">חריץ 20 eV; ערכת הטיה סימטרית מינון (האגן) עם צעדים של 2°; התחל ב- +10° (lamella pre-tilt!) עד +70° ו- -50°</td>
		</tr><tr><td>טיטאן קריוס Gi4</td>
			<td colspan="3">פלקון 4; מסנן האנרגיה Selectris X</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">חריץ 10 eV; ערכת הטיה סימטרית מינון (האגן) עם צעדים של 2°; התחל ב- +10° (lamella pre-tilt!) ל- +70° ו- -50°</td>
		</tr><tr><td>רכישת FLM</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Corrsight (מצב קונפוקלי)</td>
			<td colspan="3">מטרה: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; פרמטרים של רכישת מחסנית: גודל פיקסל x-y = 161.25 ננומטר, גודל צעד z = 300 ננומטר.</td>
		</tr><tr><td>Leica SP8 Cryo-Confocal</td>
			<td colspan="3">מטרה: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; פרמטרים של רכישת מחסנית: גודל פיקסל x-y = 84 ננומטר, גודל צעד z = 300 ננומטר.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רשימת הציוד שנבדק וההגדרות המוצעות.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

כרסום FIB בעל מתאם תלת-ממדי הופך אירועים סלולריים ספציפיים ואפילו נדירים לנגישים ל-Cryo-TEM. לאפשר את הגילוי של המבנה האולטרה של אירוע זה ישירות בתוך הסביבה הילידית. זרימת העבודה המתאמתית משפרת את שיעור ההצלחה של התמקדות במבנים תאיים נדירים, ומסייעת לזהות אותם באופן חד משמעי בסביבה התאית הצפופה.המדגימות את ההליך יהיו אנה ביבר וכריסטינה קפיטניו, מומחיות בטומוגרפיה קריו-אלקטרונית מתאמת. התחל את המיקרוסקופ הקריו-פלואורסצנטי של רשתות זרעי התא על ידי רכישת סקירת שדה רחבה במצב פלואורסצנטי ומשוקף. לאחר מכן, בחר ריבועי רשת מתאימים עם אות פלואורסצנטי.לאחר שווידאתם שהתאים והחרוזים מפוזרים באופן שווה לכיוון מרכז כל ריבוע, בחרו את הריבועים ב-200 רשתות רשת הנגישים הן למכשיר FIB-SEM והן למכשיר TEM, ומרוחקים לפחות שלושה ריבועים מקצה הרשת. בכל אחד מריבועי הרשת שנבחרו, רכשו ערימה פלואורסצנטית עם צעד ממוקד מתאים. יש להשתמש ביעדי צמצם מספריים גבוהים כדי להגדיל את ספירת הפוטונים ואת דיוק הלוקליזציה.במיקרוסקופ קונפוקלי עם מפתח צמצם מספרי 0.9 מטרה, רכשו ערימות בגודל צעד של 300 ננומטר ודגימת יתר של ערך נייקוויסט. הקליטו ערימות צבעים מרובות ואחסנו רשתות תחת חנקן נוזלי עד לשימוש חדש. השתמש בסימני החיתוך או בכיוון כדי להבטיח כיוון נכון של הרשת לצורך מיקום מאוחר יותר ב- TEM.טען את הרשתות לתוך מכשיר ה- FIB-SEM של cryo. ודא שכיוון הכרסום מאונך לציר ההטיה של ה- TEM. כדי לצפות את הרשתות בשכבה אורגנומטלית מגינה, השתמש בקודר פלזמה ובמערכת הזרקת גז במיקומי הבמה שהוגדרו מראש על ידי הגדרת FIB-SEM.לאחר מכן, הקלט את סקירת רשת SEM ובצע מתאם דו-ממדי עם סקירות FLM. מצא את ריבועי הרשת על-ידי בדיקה ידנית של סקירות רשת מוקלטות או שימוש בחבילת תוכנה. בחר וסמן ארבעה מיקומים מתאימים עבור הריבועים בסקירת הרשת FLM ו- SEM וחשב את ההמרה בין הנקודות המסומנות עבור מתאם FLM-SEM.לאחר מכן, מקם את הסמנים במרכז ריבועי הרשת המתאימים שעבורם נרכשו ערימות FLM לפני חיזוי מיקומם בתצוגת SEM. עבור כל ריבוע רשת מתואם, צלם תמונת קרן יונים בזרם נמוך בזווית הכרסום FIB לפי בחירתך ובחר שדה ראייה עם המיקום וההגדלה הרצויים התואמים את נתוני הפלואורסצנציה. עבור 200 רשתות רשת, רכוש נתוני FIB-SEM כדי לכלול ריבועי רשת בודדים, כולל סרגלי הרשת.לאחר מכן, צלם תמונת SEM של אותו ריבוע כדי לסייע בזיהוי חרוזים מתאימים בתצוגת פלואורסצנטיות וקרן יונים. בצע רישום של מחסנית FLM תלת-ממדית גולמית או מפותלת מפותלת ותצוגת קרן יונים דו-ממדית עבור כל מיקום באמצעות ארגז הכלים למתאם תלת-ממדי, 3D CT, על ידי טעינת מחסנית ה-FLM התלת-ממדית המתאימה פרוסה מחדש ותצוגת קרן יונים בתלת-ממד CT.In את נתוני הפלואורסצנטיות, בחר ארבעה חרוזים פידוקיאליים ולחץ לחיצה ימנית על רשימת המיקומים כדי לקבוע מיקום תלת-ממדי של החרוזים באמצעות התאמת גאוס של האות ב-X, Y ו- Z.לאחר מכן, בחר את החרוזים המתאימים בתמונת קרן היונים כדי לבצע מתאם תלת-ממדי ראשוני. באופן דומה, הוסף חרוזים נוספים לרישום כדי לבדוק את דיוק הקורלציה.השמיט כמה חרוזים פידוקיאליים הניתנים לזיהוי ברור הן בפלואורסצנטיות והן בקרן היונים על ידי בדיקת מיקומם החזוי לעומת המיקום בפועל בתמונת קרן היונים. ב- CT תלת ממדי, ניתן לצפות בערכי שורש ממוצעים בריבוע "או RMSE, כדי להעריך את עקביות המתאם. ודא שערכי RMSE קטנים ובסדר הדיוק של לוקליזציה.לאחר מכן, בחר את האותות הסלולריים המיועדים והתאם את המיקום התלת-ממדי בערימת FLM לפני החלת הטרנספורמציה כדי לחזות את מיקומי המטרה בתצוגת קרן יונים. עבור כל ריבוע מתואם, העבר את המיקומים החזויים של התכונות המעניינות למכשיר FIB-SEM כדי למקם את תבניות כרסום הלמלה. אם יש מספר אותות לכל תא, מקם את הדפוסים כך שיכללו את מקסימום נקודות העניין האפשריות באותה למלה.טחינה גסה את lamellas ואחריו כרסום עדין כדי לקבל עובי סופי של 150 עד 250 ננומטר. ודא שכיוון הלמלה מאונך לציר ההטיה בעת טעינת הרשתות למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. רכוש מונטאז' רשת וסקירות עבור כל ריבוע רשת המכיל lamellas עם הגדלה מתאימה וזמן חשיפה כדי להמחיש את החרוזים fiducial בתמונות TEM מבלי להוסיף באופן משמעותי את מינון האלקטרונים הכולל.רכוש מפות TEM ברזולוציה גבוהה של כל lamella. Register ו- 3D-2D מתאמים את ערימת FLM עם ריבוע הרשת TEM וסקירות ה- lamella ב- CT תלת-ממדי. בצע מתאם בין FLM ו- TEM מהגדלה נמוכה לגבוהה ב- TEM. לאחר העברת המיקומים, הגדר והפעל סדרות הטיה במיקומים מתואמים", ולאחר מכן השתמש בהגדלה, ביטול מיקוד ומינון כולל מתאימים כדי להתחיל את רכישת התמונה בהטיה מראש שנקבעה על ידי הלמלה באמצעות סכימת הטיה סימטרית של מינון.בצע רכישה ידנית או אצווה של תמונות. בניתוח המייצג, סקירת TEM בהגדלה נמוכה של אתר הכרסום מוצגת כלוקליזציה של תכונות ביולוגיות מעניינות. מאוחר יותר, תצוגת הגדלה גבוהה יותר נמצאה בקורלציה עם הקרנה בעוצמה מרבית של FLM והוגדרו מיקומים לרכישת טומוגרפיה.בתמונות שנרכשו, ניתן היה לדמיין את מרבץ החלבון האנדוציטי בסביבתו הטבעית. אופטימיזציה של המדגם הוא מאוד חשוב. הכנת הרשת צריכה להיות אופטימלית כדי לקבל פיזור טוב של תאים לטחינה ומספר טוב של חרוזים fiducial גלוי ברוב ריבועי הרשת.כרסום מתאם תלת-ממדי סייע לחשוף את מבנה העל של תהליכים תאיים שונים כגון התקדמות שלב אחר שלב של אוטופגיה בכל תא, והוא משמש ללכידת תא מופרד פאזה חדשני.

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-אלקטרון מתכוון בהכנה מיקרוסקופית דגימה של אלומת יונים ממוקדת

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

ויזואליזציה של דחיסת DNA ב כחוליות על ידי מתח גבוה הקפאה-אלקטרון טומוגרפיה

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...