Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
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ITインフラストラクチャをサポートしてくれたInga Wolf、計算サポートを提供してくれたFlorian Beck、原稿を批判的に読んでくれたOda H. Schiøtzに感謝します。資金の一部は、フィリップS.エルドマンへのアレクサンダーフォンフンボルトリターナーフェローシップとフロリアンウィルフリングへのEMBO長期フェローシップALTF 764-2014を通じて提供されました。アンナビーバーは、ベーリンガーインゲルハイムフォンズ博士フェローシップによってサポートされました。

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著者は利益相反を宣言しません。

1.プロトコルの重要なステップ
細胞培養とグリッドプランジパラメータの最適化は、このワークフローの基本です。プロジェクトの開始時には、タグ付け戦略、細胞と基準ビーズの分布を最適化し、さまざまなグリッド調製とブロッティングパラメーターをテストするために時間を費やす価値があります。最適にプランジ凍結したサンプルを使用すると、下流の処理が大幅に容易になります。
TEM実験に関しては、硝子体サンプルが必要です。HeLaのような大型哺乳類細胞の場合、1グリッド四方あたり1〜2細胞が好ましいが、細胞は依然として高密度で硝子体であり得る。任意選択で、哺乳類細胞(例えば、HEK293、HeLa)において、2.5〜10%(v/v)グリセロールを培地に添加してインキュベートすることにより、23を急落させる10分間前にガラス化を改善することができる。利用可能な場合、グリッドパターニングを使用して、細胞の完全な配置および分布を確保し、それによってガラス化および後の相関を改善することができる24。
ワークフロー中に特定の細胞を選択することもできますが、目的の生物学的特徴を示す細胞が少なすぎると、全体的なスループットが大幅に低下します。POI陽性細胞の相関を改善するには、十分に明るい蛍光色素を使用する必要があります。これは、内因性発現レベルで特に重要です。クライオ条件下では、mVenusは輝度の増加25 とヒプソクロミックシフトによりEGFPよりも優れたパフォーマンスを発揮し、クライオ条件下での標準的なGFPフィルターのセットアップに適していることがわかりました26。非点状ターゲット構造の場合、波長と局在精度(アッベ回折限界)の間のトレードオフも考慮する必要があります。
効率的な3D相関には、グリッドが機械的に安定しており、細心の注意を払って取り扱われることも必要です。カーボンサポートを備えた標準的な金または銅グリッドを使用できますが、プロジェクトによっては、より剛性の高いSiO2 フィルムを使用することで成功率が大幅に向上する可能性があります。しかし、(a)機械的安定性、または(b)クライオシワ27を低減するための熱膨張係数のマッチングが、3D相関を成功させるための最も重要な要因であるかどうかはまだ決定的ではありません。また、壊れやすいAu格子をピックアップするために、ポリジメチルシロキサン被覆ディッシュを用いてもよい5。
サンプルの安定性を確保することに加えて、FIBミリング中の最適なターゲティングに適した高品質の蛍光スタックを取得するには、FLMイメージングパラメータを慎重に選択する必要があります。この点に関して、FLMデータに対して異なるノイズ除去28 またはデコンボリューション技術をテストすることも、基準およびセルラー信号の局在化を大幅に改善する可能性があるため、推奨されます。蛍光シグナルをFIB-SEM画像と相関させる場合、基準ビーズの良好なサンプリングが重要です。それらはセルの周りによく分布し、おそらく異なるz高さにあるはずです。また、意図的に基準モデルから除外されたが、目で明確に相関できるビーズの予測位置と実際の位置を確認して、相関の一貫性を検証することもお勧めします。登録の一貫性をチェックするために、3DCTのRMSE値も常に考慮する必要があります。
FIB-SEMチャンバーからの粉砕材料と残留水の堆積(すなわち、再汚染)は、その両側に非晶質材料を添加することによって有効ラメラの厚さを増加させるので、微細に粉砕されたラメラを顕微鏡に長時間保持すると、一般に、追加の電子散乱イベントのためにTEMデータの品質が低下します。したがって、フライス加工はほとんどの場合、2段階方式で行われます:最初に、すべての位置が大まかに(すなわち、約800nmまで)、次に細かく(~150-250nmまで)フライス加工され、最後のラメラが完了した後、グリッドがすぐにアンロードされます。ただし、対象位置をサイトごとに処理することで、曲げや変形の時間がなくなるため、同じラメラで荒削りと微細フライス加工を次々に直接実行することで、より良い相関の成功を達成できます。ただし、これにより、システムの再汚染率に応じて、グリッドごとに生成できるラメラの最大数が減少します。20 nm / hの速度の場合、1〜1.5時間以内に4〜6個のラメラが生成されます。
グリッド全体または粗粉砕ラメラ>300 nm)を移動すると、相関が不十分または失敗します(以下で説明する制限も参照)。したがって、FIBミリングの前、最中、および後にIB画像を比較するなどして、定期的にチェックする必要があります。大きな動き(>300 nm)を示す部位は廃棄する必要があります。サンプル調製(グリッドタイプ、セル密度、プランジパラメータの選択、プロトコルセクション1を参照)とミリング戦略を最適化して、これらの動きを回避します。ラメラの曲げは、ステップ3.6で説明したようにサイトワイズミリングを行い、ラメラ幅を小さくすることで大幅に減らすことができます。前述したように、応力緩和カット15 はラメラ曲げを低減するように設計されているが、それらはしばしば脱結合ラメラの協調運動をもたらし、それによって相関を効果的に防止する。この問題を解決するために、統合されたFLMシステムを使用できます。
2.メソッドの変更とトラブル
クライオ条件に移行する前に、生細胞イメージングでサンプルの徹底的な特性評価を行うことを強くお勧めします。細胞サンプル、処理スキームを最適化し、クライオワークフローに入る前にどのようなシグナルが予想されるかを知ることで、成功率を大幅に向上させることができます。
ここに示すワークフローでは、クライオステージを備えたスタンドアロンの蛍光顕微鏡を使用してサンプルを画像化し、続いてグリッドを集束イオンビーム顕微鏡に移します。ただし、蛍光顕微鏡がFIB-SEMチャンバーに組み込まれているシステムでテストされているため、蛍光画像を取得するためにサンプルの移動は必要ありません29、30、31。このような統合システムを使用して、FIBミリング中およびFIBミリング後に関心のある位置を画像化して、最終的なラメラを汚染するリスクを高めることなく、ターゲット蛍光シグナルの存在を確認することができます。ただし、NAの低い対物レンズは、基準ビーズとターゲット信号を局在化できる精度を制限するため、使用する顕微鏡の光学パラメータに留意することが重要です。それにもかかわらず、統合されたFLMセットアップは、FLMスタックを継続的に更新し、最新のSEMおよびIBビューと比較できるため、グリッドとラメラのわずかな変形にもより適切に対処するのに役立ちます。
FIBミリングとTEMデータ取得との間のラメラの蛍光イメージングの代替として、TEM後の相関を使用して、ラメラ5,6の正しい配置およびミリングを検証することができる。
相関ワークフローのすべてのステップ、特にTEM中は、FIB-SEM/TEM画像上に投影された蛍光データのオーバーレイを作成することをお勧めします。このような古典的なCLEMビューは、細胞のどの部分がラメラ内に含まれているかをより直感的に理解するのに役立ちます。これは、相関関係の精度を検証するための有用な健全性チェックとしても機能します。
3.メソッドの制限
3D相関FIBアプローチでは、基準ビーズを供給できるサンプルが必要です。したがって、この方法は現在、プランジ凍結グリッドに限定されています。高圧(HPF)凍結(組織)サンプルの場合、現在、2D-2D相関のみを実行できます。潜在的に、内部基準マーカー(例えば、細胞小器官、染色された脂肪滴)は、この問題に対する解決策となり得る32、33。最終的な相関の成功率は、サンプルの品質、蛍光顕微鏡のセットアップ、ラメラの厚さ、ターゲット構造のサイズなど、多くの要因によって異なります。記載された3Dレジストレーションアプローチを用いた相関精度は、最終的なIB画像上で200〜300nmの範囲にあると推定され、FIBミルドラメラ7の典型的な厚さにほぼ対応する。したがって、これよりもはるかに小さい細胞構造は、現時点では標的にすることは困難である。さらに、フライス加工部位(>300 nm)での過度の動きは相関の精度も低下させますが、この問題はFIB/SEM装置に統合されたFLMセットアップで対処できる可能性があります。フライス加工中に強い変形または曲げを示すラメラは、いずれの場合も、下流のワークフローから除外する必要があります。
全体として、クライオ蛍光イメージングは現在、アッベ回折基準によって制限されています。超分解クライオFLM法のより日常的な応用(および商品化)により、特にオンザフライ操作のためにFIB / SEMに統合された場合、細胞構造のより正確なターゲティングが可能になる可能性があります。
4.方法の意義
特に、非ターゲットおよび事後相関技術と比較して、3D相関FIBミリングアプローチにより、時間とリソースを消費するTEMステップの前に適切な位置を選択できます。これにより、より効率的なデータ収集とプロジェクト計画が可能になります。さらに、相関蛍光データは、トモグラムの解釈や、特に非構造化タンパク質アセンブリやテンプレートマッチングやサブトモグラム平均化には小さすぎるタンパク質アセンブリを扱う場合に、マルチスケールプロジェクトでクライオETの結果を統合するために重要な情報の層を追加します。
5. 重要性と将来の応用の可能性
HPFサンプル34,35からのクライオリフト、クライオFIB-SEMボリューム36、超解像蛍光イメージング26,37,38,39などの高度なワークフローと組み合わせることで、3Dターゲットラメラ調製は、単離された細胞内の生物学的プロセスを解剖するだけでなく、組織および患者のサンプルをFIBミリングおよびクライオ電子線トモグラフィーに利用できるようにする見通しを提供します。そのため、高解像度での病理学的プロセスの解剖を可能にし、ナノスケールでの生検に向けた不可欠な構成要素となります。

集束イオンビームミリングにより、ナイフマークや圧縮アーチファクトなどの機械的切片に一般的に関連する問題なしに、凍結固定された標本から薄い生物学的サンプルを調製できます1。クライオ電子線トモグラフィーと組み合わせると、FIBミリングは、細胞形態の高解像度生物学的研究と、サブナノメートルの分解能2,3,4で細胞内から直接高分子複合体の構造の決定を可能にします。リボソームなどの豊富な種は、ランダムに切断されたFIBラメラに容易に見られますが、多くの細胞プロセスは、いくつかの複合体の共局在に依存しているか、細胞内の特定の部位に局在しています。したがって、粉砕プロセス中に目的の生物学的特徴を失わず、ランダムヒットに限定するために、効率的なターゲティングが必要です。したがって、走査型電子顕微鏡(SEM)-FIBとクライオ蛍光光顕微鏡(FLM)のデータを組み合わせた相関的アプローチが必要です。初期相関を省略し、TEM取得後にのみFLMとクライオETのデータを組み合わせることができますが5,6、蛍光誘導集束イオンビームミリングにより、事前にミリング領域を正確に選択できるため、より効率的なデータ取得が可能になります。その構想7以来、生物学的研究における3D相関FIB粉砕の適用は、この技術を使用して酵母の新しい液液相分離(LLPS)コンパートメントを特定することを最近報告するまで制限されていました8。
ここでは、細菌から酵母や哺乳類細胞に至るまでのさまざまなサンプルの研究に使用できる、一般化された3Dクライオ相関光電子顕微鏡(CLEM)プロトコルについて説明します。実験は特定の機器セットを使用して実施されたが、個々のステップは特定のハードウェアにバインドされておらず、既存のプロトコル3、5の拡張として他のシステムに容易に転送することができる。テストされた機器と推奨される設定のリストは、 材料 表と 表1に記載されています。パイプラインの4つの重要なステップは、(1)サンプル調製、(2)クライオ蛍光顕微鏡による目的の特徴の局在化、(3)3D相関集束イオンビームミリング、および(4)クライオ透過電子顕微鏡でのラメラ上のクライオETデータ取得のためのターゲット構造の局在化です(図1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

クライオ電子線トモグラフィー(クライオET)は、細胞の微細構造と分子複合体を天然の凍結水和状態で調べるために最適な方法となっています。ただし、クライオETでは、入射電子ビームを散乱または遮断しないようにサンプルが十分に薄い必要があります。厚い細胞サンプルの場合、これはクライオ集束イオンビーム(FIB)ミリングによって達成できます。このプロトコルは、3次元蛍光顕微鏡データとFIB走査型電子顕微鏡からの情報を組み合わせた3D相関アプローチを使用して、FIBミリング中に特定の細胞部位を標的にする方法を説明しています。この技術を使用すると、クライオ透過電子顕微鏡(クライオTEM)を使用して、まれな細胞イベントや構造を高精度で標的化し、分子分解能で視覚化できます。

このプロトコルは、EHドメインを含むエンドサイトーシスタンパク質1(Ede1)依存性エンドサイトーシスタンパク質沈着(END)と、オートファジー小体におけるその分解およびトラップを発見するために使用されるパイプラインのウォークスルーを提供します8。ENDは 、S. cerevisiaeの液液相分離コンパートメントであり、エンドサイトーシスイベントが失敗した後のクラスリン媒介エンドサイトーシス(CME)に関与するさまざまなタンパク質をバッファーします。その主要成分の1つはEde1であり、CME成分として、またこの新しいLLPSコンパートメントの分解のための選択的オートファジー受容体としても機能します。そこで、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)プロモーターの制御下にあるEde1(EGFP-Ede1)のEGFP融合体を用いて、Ede1の過剰発現はエンドサイトーシスの初期段階を妨害し、したがって構成的にLLPSを誘導するため、ENDを可視化した。
EGFP-Ede1過剰発現酵母細胞および1μm基準マーカーを有するプランジ凍結グリッド上で、GFPチャネルにおけるFLMスタック取得のために5つの位置を選択しました(図6A;TFSコアサイト;共焦点モード、300 nmフォーカスステップサイズ、10 μm範囲)。グリッドをFIB装置(Quanta 3D FEG)に移し、蛍光とSEMグリッドの概要の2D-2D相関を実行することによって、FLMスタックが取得されたグリッド正方形を特定しました(ステップ3.2を比較します)。
選択した各正方形について、イオンビーム画像を低電流(10pA、1200倍の倍率)で撮影し、対応する基準位置を3DCTに登録しました。目的の生物学的特徴を持つ位置を選択し、FLMスタック内の3D位置に適合させた後、見つかった形質転換を推定END位置に適用し、ラメラ調製部位を選択しました(図6B)。グリッド表面に対して11°傾斜したFIBビームは、ここに示す例(45°FIBシャトルプレチルト、18°ステージチルト)で使用されました。関心のある位置を転送し、FIB画像内の目立つランドマーク(穴、氷の汚染、基準ビーズなど)に対する予測位置の距離を測定することにより、FIBパターンを手動で描画しました(図6D)。位置合わせの精度は、FLMおよびIB画像で明確に識別できるビーズを意図的に除外し、イオンビームビューで実際の位置と予測された位置を比較することによって評価されました(たとえば、 図6B、Cのダイヤモンド)。 図6C に示す正方形の相関は正確であることがわかった(すなわち、FLMビーズ位置の予測位置は、対応するIB位置と完全に一致し、3DCTは登録のためにサブピクセルRMSE値を報告した)。したがって、ラメラは予測された位置(サイトB)で切断され、~200nmの厚さ(最終パターンオフセット)に微細に粉砕されました。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> 図6:酵母におけるエンドサイトーシスタンパク質沈着物(END)の3D相関ターゲティングの代表的な結果。 (A)フライス加工前のグリッドのSEM概要。色付きのボックスは、蛍光スタックが事前に取得されたグリッドの正方形を示します。(B-C)グリッド正方形の3D相関。FLMデータ(B、ここでは最大強度投影として示されている)とイオンビーム画像(C)にいくつかの対応する基準ビーズ(色付きのボックス)を登録した後、ダイヤモンドで示されたビーズの位置を予測することによって3Dレジストレーションの精度を検証しました。次に、ターゲット信号の位置(赤い円)を、2つの潜在的なミリングサイトのイオンビームビューで予測しました。(D)3つのターゲット点状突起(赤い円)と初期ミリングパターン(黄色のボックス)の予測位置を示すサイトBの拡大。4番目の蛍光点状点は、他の点状突起よりもはるかに低いため、粉砕中に標的とされないと予測されました(灰色の円)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
FIBミリングとグリッドのクライオ透過電子顕微鏡への転送に成功した後(Titan Kriosは300 kVで動作し、Gatan K2直接電子検出器と生体量子エネルギーフィルターを装備)、グリッドの概要がSerialEMに記録され、ラメラのある正方形を見つけるために使用されました。各ラメラについて概観画像を取得し、対応する基準ビーズを用いてFLMデータを3DCT(3D-2D)に登録した。次に、関心のある生物学的特徴の位置(図7A)を、基準ビーズから計算された変換を使用して予測しました。より高い倍率で記録されたラメラの概観はステッチされ、関心のあるサイトははっきりと見えるランドマーク(例えば、基準ビーズ)を使用して相関しました。あるいは、古典的なCLEM概要を様々なソフトウェア10、12で作成することができる。
相関関係に基づいて、 図7Aに示すラメラについて、断層撮影のための4つの潜在的な部位が見出された。ただし、これには、3D相関FIBミリング中にターゲットとされなかった位置(図 6D、灰色の円を比較)と、氷の汚染によってブロックされた位置(図7、灰色のボックス)も含まれます。したがって、断層撮影は2つの位置についてしか記録できませんでした(図7B)。全体として、~75%の相関の成功、すなわち、TEMおよびEND構造への移行を生き延びたラメラが予測部位で見出され、達成された(12の相関部位)。断層撮影の再構築、セグメンテーション、テンプレートマッチングの後、個々のEND構造をネイティブコンテキスト内で視覚化できます(図7C、D)。これには、ENDを取り囲む開窓した小胞体(ER)、時折接触する脂肪滴、およびLLPSコンパートメントから除外されるリボソームが含まれます。まとめると、これは、3D相関FIBミリングが無傷の細胞からのまれな生物学的プロセスの分子レベルの情報をどのように提供できるかを示しています。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> 図7:クライオETでENDを可視化した代表的な結果。 (A)図6に示す粉砕部位の低倍率TEM概要は、FLM最大強度投影(図6B)と容易に相関して、目的の生物学的特徴を局在化させることができます(赤い十字)。(B)第2ステップでは、より高い倍率(ステッチ)ビューを相関させることができ、断層撮影のための位置(黄色のボックス)が設定されます。面外信号に起因する位置(灰色のボックス、図6Dと比較)は無視されました。(C-D)この3D相関FIBアプローチを使用すると、エンドサイトーシスタンパク質沈着(END)を天然環境で視覚化できます。小胞体(ER)、リボソーム、膜、脂肪滴などの構造を同定し、可視化することができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プラズマクリーナー設定</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>ハリックプラズマクリーナーPDG-3XG:</td>
			<td colspan="3">無線周波数設定:「HI」、30秒;N2プラズマ</td>
		</tr><tr><td>プランジャー設定</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">湿度100%;ブロトフォース= 8;ブロットタイム= 10秒;待ち時間0秒;(これはほとんどの懸濁細胞と接着細胞で機能するはずです)</td>
		</tr><tr><td>FIB GIS の位置とタイミング</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>クアンタ3D FEG:</td>
			<td colspan="3">傾き = 0、回転 = -180、Z 位置 = 13.5、温度設定値 = 26.15°、時間 = 8 s</td>
		</tr><tr><td>TFSシオス:</td>
			<td colspan="3">傾斜 = 0、回転 = -180、Z 位置 = 9.8、温度設定値 = 28°C、時間 = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">ソフトウェア定義済み位置、温度設定値= 28°、時間= 7秒</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">ソフトウェア定義済み位置、温度設定値= 28°、時間 = 7 s</td>
		</tr><tr><td>FIBスパッタコーター設定</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>クォーラムシステム:</td>
			<td colspan="3">クォーラム準備チャンバー内:10 mA、40秒</td>
		</tr><tr><td>TFSシオス:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0.2 ミリバール, 15 秒</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 秒</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 秒</td>
		</tr><tr><td>断層撮影</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>タイタンクリオスGi2</td>
			<td colspan="3">K2カメラ、ガタンバイオ量子エネルギーフィルター</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eVスリット;2°ステップの対称傾斜スキーム(ハーゲン)を投与する。+10°(ラメラプレチルト)から+70°および-50°まで開始</td>
		</tr><tr><td>タイタンクリオスGi4</td>
			<td colspan="3">ファルコン4;セレクトリスXエネルギーフィルター</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eVスリット;2°ステップの対称傾斜スキーム(ハーゲン)を投与する。+10°(ラメラプレチルト)から+70°および-50°まで開始</td>
		</tr><tr><td>FLMアクイジション</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>コアサイト(共焦点モード)</td>
			<td colspan="3">目的:ツァイスECプラン-ネオフラ40× / 0.9NAポール;スタック取得パラメータ:x-yピクセルサイズ= 161.25 nm、zステップサイズ= 300 nm。</td>
		</tr><tr><td>ライカSP8クライオコンフォーカル</td>
			<td colspan="3">対物レンズ: ライカ HCX PL APO 50x / 0.90 クレム;スタック取得パラメータ:x-yピクセルサイズ= 84 nm、zステップサイズ= 300 nm。</td>
		</tr></tbody></table>表1:テスト済み機器と推奨設定のリスト。

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Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

ここでは、クライオ電子線トモグラフィー用の細胞サンプルの調製をガイドするための3D相関集束イオンビームミリングのパイプラインを紹介します。目的の蛍光タグ付きタンパク質の3D位置は、まずクライオ蛍光顕微鏡で決定され、次にミリングの標的となります。このプロトコルは、哺乳類、酵母、および細菌細胞に適しています。

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

3D相関FIBミリングにより、特定の、さらにはまれな細胞イベントがクライオTEMにアクセス可能になります。このイベントの超構造をネイティブ環境内で直接明らかにすることができます。相関ワークフローは、希少な細胞構造を標的とする成功率を向上させ、混雑した細胞環境でそれらを明確に識別するのに役立ちます。この手順を実演するのは、相関クライオ電子線トモグラフィーの専門家であるアンナビーバーとクリスティーナキャピタニオです。細胞播種グリッドのクライオ蛍光顕微鏡観察は、蛍光および反射モードの広い視野概要を取得することから始めます。次に、蛍光シグナルを有する適切なグリッド正方形を選択する。セルとビーズが各正方形の中心に向かって均等に分布していることを確認した後、FIB-SEMとTEM機器の両方にアクセスでき、グリッドエッジから少なくとも3正方形離れている200メッシュグリッド上の正方形を選択します。選択されたグリッド正方形のそれぞれで、適切なフォーカスステップを有する蛍光スタックを取得する。高い開口数対物レンズを使用して、光子数と位置特定精度を高める必要があります。開口数0.9の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡で、300ナノメートルのステップサイズでナイキスト値をオーバーサンプリングしたスタックを取得します。複数のカラースタックを記録し、グリッドを液体窒素の下に保管します。カットアウトマークまたはオリエンテーションマークのいずれかを使用して、後でTEMに配置するためにグリッドの適切な向きを確保します。グリッドをクライオFIB-SEM装置にロードします。フライス加工方向がTEMの傾斜軸に垂直であることを確認してください。グリッドを保護有機金属層でコーティングするには、FIB-SEMセットアップで事前定義されたステージ位置でプラズマコーダーとガス注入システムを使用します。次に、SEM グリッド概要を記録し、FLM 概要との 2D 相関を実行します。記録されたグリッドの概要を手動で検査するか、ソフトウェアパッケージを使用して、グリッドの正方形を見つけます。FLMおよびSEMグリッド概要の正方形に対応する4つの位置を選択してマークし、FLM-SEM相関のためにマークされたポイント間の変換を計算します。次に、SEMビューでの位置を予測する前に、FLMスタックが取得された対応するグリッド正方形の中央にマーカーを配置します。相関グリッドの正方形ごとに、選択したFIBミリング角度で低電流イオンビーム画像を撮影し、蛍光データに一致する目的の位置と倍率の視野を選択します。200メッシュグリッドの場合、グリッドバーを含む単一のグリッド正方形を含むFIB-SEMデータを取得します。次に、同じ正方形のSEM画像を撮影して、蛍光およびイオンビームビューで対応するビーズの識別に役立てます。対応する再スライスされた3D FLMスタックとイオンビームビューを3Dでロードすることにより、3D相関ツールボックス、3D CTを使用して、生またはデコンボリューションされた3D FLMスタックと各位置の2Dイオンビームビューの登録を実行します 蛍光データ CT.In、4つの基準ビーズを選択し、位置リストを右クリックして、Xの信号のガウスフィッティングを介してビーズの3D位置を決定します。 次に、イオンビーム画像内の対応するビーズを選択して、最初の3D相関を実行します。同様に、登録にビーズを追加して、相関の精度を確認します。蛍光とイオンビームの両方で明確に識別可能な基準ビーズを除外し、イオンビーム画像内の予測位置と実際の位置を確認します。3D CTでは、二乗平均平方根誤差(RMSE値)を表示して、相関の一貫性を評価できます。RMSE 値が小さく、ローカリゼーション精度のオーダーであることを確認してください。次に、ターゲットのセルラー信号を選択し、FLMスタック内の3D位置を適合させてから、変換を適用してイオンビームビューのターゲット位置を予測します。相関する正方形ごとに、関心のある特徴の予測位置をFIB-SEM装置に転送して、ラメラミリングパターンを配置します。セルごとに複数の信号がある場合は、同じラメラに可能な限り最大の関心点が含まれるようにパターンを配置します。ラメラを粗く粉砕し、続いて微細粉砕して、150〜250ナノメートルの最終厚さを得る。グリッドを透過型電子顕微鏡にロードするときは、ラメラの向きが傾斜軸に垂直であることを確認してください。ラメラを含む各グリッド正方形のグリッドモンタージュと概要を適切な倍率と露光時間で取得し、総電子線量を大幅に増やすことなくTEM画像内の基準ビーズを視覚化します。各ラメラの高解像度TEMマップを取得します。レジスタと3D-2Dは、FLMスタックを3D CTのTEMグリッド正方形およびラメラオーバービューと相関させます。TEMでFLMとTEMの低倍率から高倍率までの相関を行います。位置を転送した後、相関位置でチルトシリーズをセットアップして実行します」次に、適切な倍率、デフォーカス、および総線量を使用して、線量対称傾斜スキームを使用してラメラによって決定されたプレチルトで画像取得を開始します。画像の手動取得またはバッチ取得に従います。代表的な分析では、粉砕部位の低倍率TEM概要が、関心のある生物学的特徴を局在化することが示されている。その後、より高い倍率のビューがFLMの最大強度投影と相関し、断層撮影のための位置が設定されました。取得した画像では、エンドサイトーシスタンパク質沈着物をその天然環境で視覚化することができました。サンプルの最適化は非常に重要です。グリッド調製は、ミルする細胞の分布が良好で、ほとんどのグリッドの正方形に多数の目に見える基準ビーズがあるように最適化する必要があります。3D相関ミリングは、各細胞におけるオートファジーの段階的な進行など、さまざまな細胞プロセスの微細構造を明らかにするのに役立ち、新しい相分離コンパートメントをキャプチャするために使用されます。

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