Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
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IT 인프라를 지원해 준 Inga Wolf, 컴퓨터 지원을 해준 Florian Beck, 원고를 비판적으로 읽어준 Oda H. Schiøtz에게 감사드립니다. 자금은 Philipp S. Erdmann의 Alexander von Humboldt 귀환 펠로우십과 Florian Wilfling의 EMBO 장기 펠로우십 ALTF 764-2014를 통해 부분적으로 제공되었습니다. 안나 비버(Anna Bieber)는 베링거인겔하임 재단(Boehringer Ingelheim Fonds) 박사 펠로우십의 지원을 받았다.

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

1. 프로토콜의 중요한 단계
세포 배양 및 그리드 플런징 파라미터의 최적화는 이 워크플로우의 기본입니다. 프로젝트를 시작할 때 태깅 전략, 세포 및 기준 비드의 분포를 최적화하고 다양한 그리드 준비 및 블로팅 매개변수를 테스트하는 데 시간을 투자할 가치가 있습니다. 최적으로 플런지 냉동 샘플로 작업하면 다운스트림 처리가 크게 용이해집니다.
모든 TEM 실험의 경우 유리체 샘플이 필요합니다. HeLa와 같은 대형 포유류 세포의 경우 격자 정사각형당 1-2개의 세포가 바람직하지만 세포는 여전히 더 높은 밀도에서 유리체일 수 있습니다. 임의로, 유리화는 포유류 세포(예를 들어, HEK293, HeLa)를 급락하기 10분 전에 배양 배지에 첨가된 2.5-10%(v/v) 글리세롤과 함께 배양함으로써 개선될 수 있다23. 가능하다면, 그리드 패터닝은 세포의 완벽한 배치 및 분포를 보장하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 따라 유리화 및 추후 상관관계를 개선한다(24).
워크플로우 중에 특정 세포를 선택할 수 있지만 관심 있는 생물학적 특징을 나타내는 세포가 너무 적으면 전체 처리량이 크게 감소합니다. POI 양성 세포의 상관관계를 개선하려면 충분히 밝은 형광단을 사용해야 합니다. 이것은 내인성 발현 수준에서 특히 중요합니다. 우리는 극저온 조건에서 mVenus가 증가된 밝기25 와 극면 변색 이동으로 인해 EGFP보다 더 나은 성능을 발휘하여 극저온 조건26에서 표준 GFP 필터 설정에 적합하다는 것을 발견했습니다. 점과 같은 표적 구조가 아닌 경우, 파장과 국소화 정확도(Abbe 회절 한계) 간의 균형도 고려해야 합니다.
효율적인 3D 상관 관계를 위해서는 그리드가 기계적으로 안정적이어야 하며 세심한 주의를 기울여 처리해야 합니다. 탄소 지지를 갖는 표준 금 또는 구리 그리드가 사용될 수 있지만, 프로젝트에 따라 더 단단한 SiO2 필름을 사용함으로써 성공률이 크게 증가 할 수있다. 그러나 (a) 기계적 안정성 또는 (b) 극저온주름을 줄이기 위한 열팽창 계수(기판 대 필름)의 일치가 성공적인 3D 상관관계를 위한 가장 중요한 요소인지 여부는 아직 결정적으로 결정되지 않았습니다. 또한, 깨지기 쉬운 Au 그리드를 집어 올리기 위해 폴리디메틸실록산 코팅 접시를 사용할 수 있습니다5.
샘플 안정성을 보장하는 것 외에도 FIB 밀링 중 최적의 타겟팅에 적합한 고품질 형광 스택을 얻으려면 FLM 이미징 매개 변수를 신중하게 선택해야합니다. 이와 관련하여, FLM 데이터에 대해 다양한 노이즈 제거28 또는 디콘볼루션 기술을 테스트하는 것도 권장되는데, 이는 기준점 및 세포 신호의 국소화를 상당히 향상시킬 수 있기 때문입니다. 형광 신호를 FIB-SEM 이미지와 연관시킬 때 기준 비드의 적절한 샘플링이 중요합니다. 그것들은 세포 주위에 잘 분포되어 있어야 하며 아마도 다른 z 높이에 있어야 합니다. 또한 신탁 모델에서 의도적으로 제외되었지만 눈으로 명확하게 상관 관계를 나타낼 수 있는 비드의 예측 위치와 실제 위치를 확인하여 상관 관계의 일관성을 검증하는 것이 좋습니다. 3DCT의 RMSE 값도 등록 일관성을 확인하기 위해 항상 고려되어야 합니다.
FIB-SEM 챔버에서 밀링된 재료와 잔류물을 증착(즉, 재오염)하면 양쪽에 비정질 재료를 추가하여 유효 라멜라 두께가 증가하기 때문에 현미경에서 미세 밀링된 라멜라를 장기간 유지하면 일반적으로 추가 전자 산란 이벤트로 인해 TEM 데이터 품질이 저하됩니다. 따라서, 밀링은 2-단계 방식으로 가장 자주 수행된다: 첫째, 모든 위치들은 대략적으로 (즉, 약 800 nm까지), 그 다음 미세하게 (~150-250 nm까지), 그리드는 마지막 라멜라가 완료된 후에 즉시 언로딩된다. 그러나 더 나은 상관 관계 성공은 관심 위치를 현장별 방식으로 처리하여 얻을 수 있으며, 따라서 굽힘 또는 변형을 위한 시간이 없기 때문에 동일한 라멜라에서 서로 직접 거칠고 미세한 밀링을 수행할 수 있습니다. 그러나 이것은 시스템의 재오염 속도에 따라 그리드당 생산할 수 있는 최대 라멜라 수를 줄입니다. 20 nm / h의 속도의 경우, 4-6 라멜라는 1-1.5 시간 이내에 생성됩니다.
전체 그리드 또는 거친 분쇄된 라멜라>300nm의 이동은 상관관계가 좋지 않거나 실패하는 결과를 초래합니다(아래에서 논의되는 제한 사항 참조). 따라서 FIB 밀링 전, 도중 및 후에 IB 이미지를 비교하여 정기적으로 점검해야합니다. 상당한 움직임(>300nm)을 보이는 부위는 폐기해야 합니다. 시료 전처리(즉, 그리드 유형, 세포 밀도 및 플런징 파라미터 선택, 프로토콜 섹션 1 참조)와 밀링 전략을 최적화하여 이러한 이동을 방지합니다. 라멜라 굽힘은 단계 3.6에 설명된 바와 같이 부위별 밀링에 의해 상당히 감소될 수 있고 라멜라 폭을 감소시킬 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 응력 완화 컷(15 )은 라멜라 굽힘을 감소시키기 위해 고안되었지만, 종종 분리된 라멜라의 조화로운 움직임을 초래하여 상관관계를 효과적으로 방지한다. 통합 FLM 시스템을 사용하여 이 문제를 해결할 수 있습니다.
2. 방법의 수정 및 문제 해결
극저온 조건으로 이동하기 전에 생세포 이미징에서 샘플의 철저한 특성화를 수행하는 것이 좋습니다. 세포 샘플, 처리 계획을 최적화하고 cryo-workflow에 들어가기 전에 어떤 종류의 신호를 기대해야 하는지 알면 성공률을 크게 향상시킬 수 있습니다.
여기에 제시된 워크플로우에서는 극저온 스테이지가 있는 독립형 형광 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화한 다음 그리드를 집속 이온빔 현미경으로 전송합니다. 그러나 형광 현미경이 FIB-SEM 챔버에 통합 된 시스템에서 테스트되었으므로 형광 이미지 29,30,31을 획득하기 위해 샘플 이동이 필요하지 않습니다. 이러한 통합 시스템을 사용하여 FIB 밀링 중 및 후에 관심 위치를 이미지화하여 최종 라멜라를 오염시킬 위험을 증가시키지 않고 표적 형광 신호의 존재를 확인할 수 있습니다. 그러나 사용된 현미경의 광학 파라미터를 염두에 두는 것이 중요한데, 예를 들어 NA 대물렌즈가 낮으면 기준 비드와 표적 신호의 위치를 파악할 수 있는 정밀도가 제한되기 때문입니다. 그럼에도 불구하고 통합 FLM 설정은 FLM 스택을 지속적으로 업데이트하고 최신 SEM 및 IB 보기와 비교할 수 있으므로 그리드 및 라멜라의 약간의 변형을 더 잘 처리하는 데 도움이 됩니다.
FIB 밀링과 TEM 데이터 수집 사이의 라멜라의 형광 이미징에 대한 대안으로, TEM 후 상관 관계를 사용하여 라멜라의 올바른 배치 및 밀링을 확인할 수 있습니다 5,6.
상관 워크플로우의 모든 단계에서, 특히 TEM 동안에는 FIB-SEM/TEM 이미지에 투영된 형광 데이터의 오버레이를 생성하는 것이 좋습니다. 이러한 고전적인 CLEM 관점은 세포의 어느 부분이 라멜라 내에 포함되어 있는지 보다 직관적으로 이해하는 데 도움이 됩니다. 이는 상관 관계의 정확성을 확인하는 데 유용한 온전성 검사 역할도 합니다.
3. 방법의 한계
3D 상관 FIB 접근법에는 기준 비드와 함께 제공 할 수있는 샘플이 필요합니다. 따라서, 이 방법은 현재 플런지 냉동 그리드로 제한된다. 고압(HPF) 냉동(조직) 샘플의 경우 현재 2D-2D 상관관계만 수행할 수 있습니다. 잠재적으로, 내부 기준 마커(예를 들어, 세포 소기관, 염색된 지질 방울)가 이 문제에 대한 해결책이 될 수 있다32,33. 최종 상관 관계 성공률은 샘플 품질, 형광 현미경 설정, 라멜라 두께 및 표적 구조의 크기를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 기술된 3D 정합 접근법을 사용한 상관 정확도는 최종 IB 이미지에서 200-300 nm의 범위인 것으로 추정되며, 이는 FIB-밀링된 라멜라의 전형적인 두께에 대략 대응한다7. 따라서 이보다 훨씬 작은 세포 구조는 현재로서는 표적으로 삼기 어려울 것입니다. 또한 밀링 현장(>300nm)에서의 과도한 움직임은 상관관계의 정확도를 감소시키는데, 이는 FIB/SEM 기기에 통합된 FLM 설정으로 잠재적으로 해결할 수 있는 문제입니다. 밀링 중에 강한 변형 또는 굽힘을 보이는 라멜라는 어떤 경우에도 다운스트림 워크플로에서 제외되어야 합니다.
전반적으로, 초저온 형광 이미징은 현재 Abbe 회절 기준에 의해 제한됩니다. 초분리능 Cryo-FLM 분석법의 보다 일상적인 적용(및 상용화)을 통해, 특히 온더플라이(on-the-fly) 작동을 위해 FIB/SEM에 통합될 때 세포 구조의 보다 정확한 표적화가 가능해질 수 있습니다.
4. 방법의 중요성
특히 비 표적 및 사후 상관 기술과 비교할 때 3D 상관 FIB 밀링 접근 방식을 사용하면 시간과 자원이 많이 소요되는 TEM 단계 전에 적절한 위치를 선택할 수 있습니다. 따라서 보다 효율적인 데이터 수집 및 프로젝트 계획이 가능합니다. 또한, 상관관계가 있는 형광 데이터는 특히 구조화되지 않은 단백질 어셈블리 또는 템플릿 매칭 및 서브토모그램 평균화를 위해 너무 작은 것을 다룰 때 단층 촬영을 해석하고 다중 스케일 프로젝트에서 Cryo-ET 결과를 통합하는 데 중요할 수 있는 정보 계층을 추가합니다.
5. 중요성과 잠재적인 미래 응용 분야
HPF 샘플 34,35, cryo-FIB-SEM 볼륨36 및 초고해상도 형광 이미징 26,37,38,39의 cryo-lift와 같은 고급 워크플로우와 함께 3D 표적 라멜라 준비는 분리된 세포에서 생물학적 과정을 해부할 뿐만 아니라 조직 및 환자 샘플을 FIB 밀링 및 초저온 전자 단층 촬영에 접근할 수 있도록 합니다. 따라서 고해상도에서 병리학적 과정을 해부할 수 있으므로 나노 규모의 생검을 위한 필수 구성 요소가 될 것입니다.

집속 이온빔 밀링을 사용하면 나이프 마크 및 압축 아티팩트와 같은 기계적 절단과 일반적으로 관련된 문제 없이 극저온 고정 시편에서 얇은 생물학적 샘플을 준비할 수 있습니다1. 초저온 전자 단층 촬영과 함께 사용하면 FIB 밀링은 세포 형태에 대한 고해상도 생물학적 연구와 나노 미터 미만의 분해능 2,3,4에서 세포 내에서 직접 거대 분자 복합체의 구조를 결정할 수 있습니다. 리보솜과 같은 풍부한 종은 무작위로 절단된 FIB 라멜라에서 쉽게 발견되지만 많은 세포 과정은 여러 복합체의 공동 국소화에 의존하거나 세포 내의 특정 부위에 국한됩니다. 결과적으로, 효율적인 타겟팅은 밀링 공정 동안 관심있는 생물학적 특징을 잃지 않고 무작위 타격으로 제한되지 않도록 요구된다. 따라서 주사 전자 현미경 (SEM) -FIB와 극저온 형광 광학 현미경 (FLM)의 데이터를 결합하는 상관 접근법이 필요합니다. TEM 획득5,6 후에만 초기 상관관계를 생략하고 FLM과 Cryo-ET 데이터를 결합할 수 있지만, 형광 유도 집속 이온빔 밀링을 사용하면 밀링 영역을 미리 정확하게 선택할 수 있으므로 보다 효율적인 데이터 수집이 가능합니다. 개념7 이후, 생물학적 연구에서 3D 상관 FIB 밀링의 적용은 최근에이 기술을 사용하여 효모에서 새로운 액체 - 액체 상 분리 (LLPS) 구획을 확인했다고보고 할 때까지 제한되었습니다8.
여기에 설명된 것은 박테리아에서 효모 및 포유류 세포에 이르는 다양한 샘플을 연구하는 데 사용할 수 있는 일반화된 3D 초저온 상관 광 및 전자 현미경(CLEM) 프로토콜입니다. 실험은 특정 세트의 기기를 사용하여 수행되었지만, 개별 단계는 특정 하드웨어에 구속되지 않으며 기존 프로토콜(3,5)에 대한 확장으로서 다른 시스템으로 쉽게 전송될 수 있습니다. 테스트된 장비 및 제안된 설정 목록은 재료 표와 표 1에 나와 있습니다. 파이프라인의 4가지 주요 단계는 (1) 시료 전처리, (2) 극저온 형광 현미경을 통한 관심 특징의 국소화, (3) 3D 상관 집속 이온빔 밀링, (4) 극저온 투과 전자 현미경의 라멜라에 대한 Cryo-ET 데이터 수집을 위한 표적 구조의 국소화입니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

초저온 전자 단층 촬영(Cryo-ET)은 원래의 냉동 수화 상태에서 세포 미세 구조 및 분자 복합체를 조사하기 위해 선택되는 방법이 되었습니다. 그러나 Cryo-ET는 입사 전자빔이 산란되거나 차단되지 않을 만큼 샘플이 얇아야 합니다. 두꺼운 세포 샘플의 경우 극저온 집속 이온 빔(FIB) 밀링을 통해 이를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 3D 상관 접근법을 사용하여 FIB 밀링 중에 특정 세포 부위를 표적으로 삼는 방법을 설명합니다.이 접근법은 3 차원 형광 현미경 데이터와 FIB 주사 전자 현미경의 정보를 결합합니다. 이 기술을 사용하면 희귀 세포 이벤트 및 구조를 높은 정확도로 표적화하고 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM)을 사용하여 분자 분해능으로 시각화할 수 있습니다.

이 프로토콜은 EH 도메인 함유 및 엔도사이토시스 단백질 1(Ede1)-의존성 세포내 단백질 침착(END)과 자가포식체(autophagic bodies)에서의 분해 및 포획을 발견하는 데 사용되는 파이프라인에 대한 안내를 제공한다8. END는 S. cerevisiae의 액체-액체 상 분리 구획으로, 실패한 내세포 사건 후 클라트린 매개 엔도사이토시스(CME)에 관여하는 다양한 단백질을 완충합니다. 주요 구성 요소 중 하나는 Ede1이며, 이는 CME 구성 요소 및 이 새로운 LLPS 구획의 분해를 위한 선택적 자가포식 수용체의 두 배입니다. 따라서, 알코올 탈수소효소(ADH) 프로모터의 제어 하에 Ede1(EGFP-Ede1)의 EGFP 융합을 사용하여 END를 시각화했는데, 이는 Ede1 과발현이 엔도사이토시스의 초기 단계를 방해하여 LLPS를 구성적으로 유도하기 때문입니다.
EGFP-Ede1 과발현 효모 세포 및 1μm 기준 마커가 있는 플런지 동결 그리드에서 GFP 채널에서 FLM 스택 획득을 위해 5개의 위치를 선택했습니다(그림 6A; TFS Corrsight; 공초점 모드, 300nm 초점 스텝 크기, 10μm 범위). 그리드는 FIB 기기 (Quanta 3D FEG)로 전송되었고, FLM 스택이 획득 된 그리드 사각형은 형광 및 SEM 그리드 개요의 2D-2D 상관 관계를 수행하여 식별되었습니다 (3.2 단계 비교).
선택된 사각형 각각에 대해 이온 빔 이미지를 낮은 전류 (10 pA, 1200x 배율)로 촬영하고 해당 기준 위치를 3DCT에 등록했습니다. 관심 있는 생물학적 특징을 가진 위치를 선택하고 FLM 스택 내에서 3D 위치를 맞춘 후 발견된 변형을 추정 END 위치에 적용하고 라멜라 준비를 위한 부위를 선택했습니다(그림 6B). 그리드 표면에 대해 11 ° 기울어 진 FIB 빔이 여기에 표시된 예에서 사용되었습니다 (45 ° FIB 셔틀 사전 기울기, 18 ° 스테이지 기울기). 관심있는 위치가 전송되었고, FIB 패턴은 FIB 이미지에서 눈에 띄는 랜드 마크 (예 : 구멍, 얼음 오염, 기준 비드)에 대한 예측 된 위치의 거리를 측정하여 수동으로 그려졌습니다 (그림 6D). 등록의 정확도는 FLM 및 IB 이미지에서 명확하게 식별할 수 있는 비드를 의도적으로 생략한 다음 이온 빔 보기에서 실제 위치와 예측된 위치를 비교하여 평가되었습니다(예: 그림 6B, C의 다이아몬드). 도 6C 에 도시된 정사각형에 대한 상관은 정확한 것으로 밝혀졌다(즉, FLM 비드 위치의 예측된 위치는 그들의 대응하는 IB 위치 및 3DCT가 등록을 위해 보고한 서브-픽셀 RMSE 값과 완벽하게 일치하였다). 따라서, 라멜라는 예측된 위치(부위 B)에서 절단되고 ~200nm의 두께로 미세 밀링되었습니다(최종 패턴 오프셋).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> 그림 6: 효모에서 세포내 단백질 침전물(END)의 3D 상관 표적화에 대한 대표적인 결과. (A) 밀링 전 그리드의 SEM 개요. 색상이 있는 상자는 형광 스택을 미리 가져온 격자 사각형을 나타냅니다. (B-C) 그리드 사각형의 3D 상관 관계. FLM 데이터(B, 여기서는 최대 강도 투영으로 표시됨)와 이온빔 이미지(C)에 여러 개의 해당 기준 비드(컬러 박스)를 등록한 후, 다이아몬드로 표시된 비드의 위치를 예측하여 3D 등록의 정확성을 검증했습니다. 다음으로, 타겟 신호의 위치(빨간색 원)를 두 개의 잠재적 밀링 사이트에 대한 이온 빔 뷰에서 예측했습니다. (D) 3개의 표적 점점(빨간색 원)과 초기 밀링 패턴(노란색 상자)의 예측 위치를 보여주는 사이트 B의 확대. 네 번째 형광 펑크텀은 다른 펑타보다 훨씬 낮을 것으로 예측되어 밀링 동안 표적화되지 않았습니다(회색 원). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
성공적인 FIB 밀링 및 그리드를 극저온 투과 전자 현미경 (Titan Krios는 300kV에서 작동하고 Gatan K2 직접 전자 검출기 및 Bioquantum 에너지 필터 장착)으로 전송 한 후 그리드 개요를 SerialEM에 기록하고 라멜라가있는 사각형을 찾는 데 사용했습니다. 각 라멜라에 대해 개요 이미지를 획득하고 해당 기준 비드를 사용하여 FLM 데이터를 3DCT(3D-2D)에 등록했습니다. 관심있는 생물학적 특징의 위치 (그림 7A)는 그 후 기준 비드로부터 계산 된 변환을 사용하여 예측되었다. 더 높은 배율로 기록된 라멜라 개요를 스티칭하고 관심 부위를 명확하게 보이는 랜드마크(예: 기준점 구슬)를 사용하여 상관 관계를 파악했습니다. 대안적으로, 고전적인 CLEM 개요는 다양한 소프트웨어(10, 12)에서 생성될 수 있다.
상관관계에 기초하여, 도 7A에 도시된 라멜라에 대해 단층촬영 획득을 위한 4개의 잠재적 부위가 발견되었다. 그러나 여기에는 3D 상관 FIB 밀링 중에 타겟팅되지 않은 위치 (그림 6D 비교, 회색 원)와 얼음 오염으로 차단 된 위치 (그림 7, 회색 상자)도 포함됩니다. 따라서 단층 촬영은 두 위치에 대해서만 기록할 수 있었습니다(그림 7B). 전반적으로, ~75%의 상관관계 성공, 즉 TEM 및 END 구조로의 전달에서 살아남은 라멜라가 예측 부위에서 발견되었습니다(12개의 상관 부위). 단층 구조 재구성, 세분화 및 템플릿 매칭 후 개별 END 구조를 기본 컨텍스트 내에서 시각화할 수 있습니다(그림 7C,D). 여기에는 END를 둘러싸고 있는 천공된 소포체(ER), 때때로 접촉하는 지질 방울, LLPS 구획에서 제외되는 리보솜이 포함됩니다. 종합하면, 이것은 3D 상관 FIB 밀링이 손상되지 않은 세포에서 희귀 한 생물학적 과정에 대한 분자 수준 정보를 제공 할 수있는 방법을 보여줍니다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> 그림 7: cryo-ET로 END를 시각화한 대표적인 결과. (A) 그림 6에 표시된 밀링 현장의 저배율 TEM 개요는 FLM 최대 강도 투영(그림 6B)과 쉽게 상관관계를 파악하여 관심 있는 생물학적 특징(적십자)을 국소화할 수 있습니다. (B) 두 번째 단계에서는 더 높은 배율(스티치) 뷰를 상호 연관시킬 수 있으며 단층 촬영 위치(노란색 상자)를 설정할 수 있습니다. 면외 신호(회색 상자, 그림 6D 비교)로 인한 위치는 무시되었습니다. (C-D) 이 3D 상관 FIB 접근법을 사용하여 내세포 단백질 침착 (END)을 기본 환경에서 시각화 할 수 있습니다. 소포체(ER), 리보솜, 막 및 지질 방울과 같은 구조를 식별하고 시각화할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>플라즈마 클리너 설정</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick 플라즈마 클리너 PDG-3XG :</td>
			<td colspan="3">고주파 setiing: "HI", 30초; N2 플라즈마</td>
		</tr><tr><td>플런저 설정</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV 크랙:</td>
			<td colspan="3">100% 습도; 얼룩 = 8; 블로트 타임 = 10초; 대기 시간 0초; (이것은 대부분의 현탁 및 부착 세포에서 작동해야 함)</td>
		</tr><tr><td>FIB GIS 위치 및 타이밍</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG 크랙:</td>
			<td colspan="3">틸트 = 0, 회전 = -180, Z 위치 = 13.5, 온도 설정값 = 26.15°, 시간 = 8초</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios 크랙:</td>
			<td colspan="3">틸트 = 0, 회전 = -180, Z 위치 = 9.8, 온도 설정값 = 28°C, 시간 = 7초</td>
		</tr><tr><td>TFS 아퀼로스 1:</td>
			<td colspan="3">소프트웨어 사전 정의 위치, 온도 설정값 = 28°, 시간 = 7초</td>
		</tr><tr><td>TFS 아퀼로스 2:</td>
			<td colspan="3">소프트웨어 사전 정의 위치, 온도 설정값 = 28°, 시간 = 7초</td>
		</tr><tr><td>FIB 스퍼터 코터 설정</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>쿼럼 시스템:</td>
			<td colspan="3">쿼럼 준비 챔버: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios 크랙:</td>
			<td colspan="3">10W, 500V, 250mA, 0.2mbar, 15초</td>
		</tr><tr><td>TFS 아퀼로스 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10mA, 10Pa, 15초</td>
		</tr><tr><td>TFS 아퀼로스 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10mA, 10Pa, 15초</td>
		</tr><tr><td>단층 촬영</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>타이탄 크리오스 Gi2</td>
			<td colspan="3">K2 카메라, Gatan Bioquantum 에너지 필터</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eV 슬릿; 2° 단계의 선량 대칭 기울기 방식(Hagen); +10°(라멜라 사전 기울기!)에서 +70° 및 -50°까지 시작</td>
		</tr><tr><td>타이탄 크리오스 Gi4</td>
			<td colspan="3">팔콘 4; Selectris X 에너지 필터</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eV 슬릿; 2° 단계의 선량 대칭 기울기 방식(Hagen); +10°(라멜라 사전 기울기)에서 시작하여 +70° 및 -50°까지</td>
		</tr><tr><td>FLM 인수</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Corrsight(컨포칼 모드)</td>
			<td colspan="3">목표: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; 스택 획득 매개변수: xy 픽셀 크기 = 161.25nm, z 스텝 크기 = 300nm.</td>
		</tr><tr><td>라이카 SP8 Cryo-Confocal</td>
			<td colspan="3">대물렌즈: 라이카 HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; 스택 획득 파라미터: xy 픽셀 크기 = 84nm, z 스텝 크기 = 300nm.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 테스트된 장비 및 제안된 설정 목록.

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Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

3D 상관 FIB 밀링은 Cryo-TEM에서 특정 및 희귀 한 세포 이벤트에 액세스 할 수 있도록합니다. 이 이벤트의 울트라 구조를 네이티브 환경 내에서 직접 드러낼 수 있습니다. 상관 워크플로는 희귀 세포 구조를 표적으로 삼는 성공률을 높이고 혼잡한 세포 환경에서 이를 명확하게 식별하는 데 도움이 됩니다.이 절차를 시연하는 것은 상관 극저온 전자 단층 촬영 전문가 인 Anna Bieber와 Christina Capitanio가 될 것입니다. 세포 시드 그리드의 cryo-fluorescence microscopy를 시작하여 형광 및 반사 모드에서 넓은 필드 개요를 획득합니다. 그런 다음 형광 신호가 있는 적절한 그리드 사각형을 선택합니다.세포와 비드가 각 사각형의 중심을 향해 고르게 분포되어 있는지 확인한 후 FIB-SEM 및 TEM 기기 모두에 액세스할 수 있고 그리드 가장자리에서 최소 3개의 사각형 떨어져 있는 200개의 메쉬 그리드에서 사각형을 선택합니다. 선택한 각 그리드 사각형에서 적절한 초점 단계로 형광 스택을 획득합니다. 높은 개구수 대물렌즈는 광자 수와 위치 정확도를 높이는 데 사용해야 합니다.개구수가 0.9인 컨포칼 현미경에서 300나노미터 스텝 크기의 스택을 획득하고 나이퀴스트 값을 오버샘플링합니다. 여러 색상 스택을 기록하고 나중에 사용할 때까지 액체 질소 아래에 그리드를 보관하십시오. 컷아웃 또는 방향 표시를 사용하여 나중에 TEM에 배치할 수 있도록 그리드의 올바른 방향을 확인합니다.그리드를 cryo FIB-SEM 기기에 로드합니다. 밀링 방향이 TEM의 틸트 축에 수직인지 확인하십시오. 그리드를 보호 유기 금속 층으로 코팅하려면 FIB-SEM 설정에 의해 사전 정의 된 스테이지 위치에서 플라즈마 코더 및 가스 주입 시스템을 사용하십시오.그런 다음 SEM 그리드 개요를 기록하고 FLM 개요와 2D 상관 관계를 수행합니다. 기록된 그리드 개요를 수동으로 검사하거나 소프트웨어 패키지를 사용하여 그리드 사각형을 찾습니다. FLM 및 SEM 그리드 개요에서 사각형에 해당하는 4개의 위치를 선택하여 표시하고 FLM-SEM 상관에 대해 표시된 점 간의 변환을 계산합니다.그런 다음 SEM 뷰에서 마커의 위치를 예측하기 전에 FLM 스택을 획득한 해당 그리드 사각형의 중앙에 마커를 배치합니다. 각 상관 그리드 사각형에 대해 선택한 FIB 밀링 각도에서 저전류 이온 빔 이미지를 촬영하고 형광 데이터와 일치하는 원하는 위치 및 배율로 시야를 선택합니다. 200 메쉬 그리드의 경우 FIB-SEM 데이터를 수집하여 그리드 막대를 포함한 단일 그리드 사각형을 포함합니다.그런 다음 동일한 사각형의 SEM 이미지를 촬영하여 형광 및 이온 빔 보기에서 해당 비드를 식별하는 데 도움이 됩니다. 3D 상관 관계 도구 상자인 3D CT를 사용하여 각 위치에 대한 원시 또는 디컨볼루션된 3D FLM 스택 및 2D 이온 빔 뷰의 정합을 수행하고, 해당 재슬라이스된 3D FLM 스택 및 이온 빔 뷰를 3D CT.In 형광 데이터로 로드하고, 4개의 기준 비드를 선택하고 위치 목록을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 X에서 신호의 가우시안 피팅을 통해 비드의 3D 위치를 결정합니다. 그런 다음 이온 빔 이미지에서 해당 비드를 선택하여 초기 3D 상관 관계를 수행합니다. 마찬가지로, 상관 관계의 정확성을 확인하기 위해 등록에 더 많은 비드를 추가합니다.형광과 이온빔 모두에서 명확하게 식별할 수 있는 일부 기준 비드는 이온빔 이미지에서 예측된 위치와 실제 위치를 확인하여 생략합니다. 3D CT에서는 상관 관계 일관성을 평가하기 위해 평균 제곱근 오차" 또는 RMSE 값을 볼 수 있습니다. RMSE 값이 작고 지역화 정확도 정도인지 확인합니다.다음으로, 타겟 셀룰러 신호를 선택하고 변환을 적용하기 전에 FLM 스택에 3D 위치를 피팅하여 이온 빔 뷰에서 타겟 위치를 예측합니다. 각 상관 사각형에 대해 관심 있는 특징의 예측된 위치를 FIB-SEM 기기로 전송하여 라멜라 밀링 패턴을 배치합니다. 셀당 여러 신호가 있는 경우 동일한 라멜라에 가능한 최대 관심 지점을 포함하도록 패턴을 배치합니다.라멜라를 거칠게 밀링한 후 미세 밀링하여 150 내지 250 나노미터의 최종 두께를 얻었다. 그리드를 투과 전자 현미경에 로드할 때 라멜라 방향이 기울기 축에 수직인지 확인하십시오. 적절한 배율과 노출 시간으로 라멜라를 포함하는 각 그리드 사각형에 대한 그리드 몽타주 및 개요를 획득하여 총 전자 선량에 크게 추가하지 않고 TEM 이미지에서 기준 비드를 시각화합니다.각 라멜라의 고해상도 TEM 맵을 획득합니다. 레지스터 및 3D-2D는 FLM 스택을 3D CT의 TEM 그리드 사각형 및 라멜라 개요와 상호 연관시킵니다. TEM에서 저배율에서 고배율까지 FLM과 TEM 간의 상관 관계를 수행합니다. 위치를 옮긴 후 상관 위치에서 틸트 시리즈를 설정하고 실행한 다음 적절한 배율, 디포커스 및 총 선량을 사용하여 선량 대칭 틸트 방식을 사용하여 라멜라에 의해 결정된 사전 기울기에서 이미지 획득을 시작합니다.이미지의 수동 또는 일괄 수집을 따릅니다. 대표적인 분석에서, 밀링 현장의 저배율 TEM 개요는 관심있는 생물학적 특징을 국소화시키는 것으로 나타났다. 나중에 더 높은 배율 보기가 FLM 최대 강도 투영과 상관관계가 있었고 단층 촬영 위치가 설정되었습니다.획득 된 이미지에서, endocytic 단백질 침전물은 원래 환경에서 시각화 될 수 있습니다. 샘플의 최적화는 매우 중요합니다. 그리드 준비는 밀링할 셀이 잘 분포되어 있고 대부분의 그리드 사각형에 많은 수의 기준점 비드가 보이도록 최적화되어야 합니다.3D 상관 밀링은 각 세포에서 자가포식의 단계별 진행과 같은 다양한 세포 과정의 울트라 구조를 밝히는 데 도움이 되었으며, 새로운 상 분리 구획을 캡처하는 데 사용됩니다.

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Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...