Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Vi takker Inga Wolf for støtte til IT-infrastrukturen, Florian Beck for beregningsstøtte og Oda H. Schiøtz for kritisk lesning av manuskriptet. Finansiering ble gitt delvis gjennom et Alexander von Humboldt returners fellowship til Philipp S. Erdmann og et EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014 til Florian Wilfling. Anna Bieber ble støttet av et Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. fellowship.

<ol>
	<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+tomography:+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail.">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li><li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins.">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-correlative+light+and+electron+microscopy+workflow+for+cryo-focused+ion+beam+milled+adherent+cells.">Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 162, 273-302 (2021).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies.">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li><li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy.">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits.">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li><li>. Scientific volume imaging, Nyquist calculator Available from: <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>. 3DCT Available from: <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021)</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745 (2021).</li><li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae.">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0 (2019).</li><li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology.">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).</li><li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling.">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033 (2020).</li><li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286 (2020).</li><li>. tools3dct Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021)</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>B&#228;uerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions.">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions.">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li><li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crinkling:+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature.">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li><li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images.">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li><li>. Delmic METEOR Available from: <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021)</li><li>. iFLM Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021)</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association.">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li><li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging.">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714 (2021).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms.">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue.">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li><li>Wu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context.">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017 (2015).</li><li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision.">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li><li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins.">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li></ol>

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

1. Kritiske trinn i protokollen
Optimalisering av cellekultur og gitterstupeparametere er grunnleggende for denne arbeidsflyten. I begynnelsen av et prosjekt er det verdt å investere tid for å optimalisere merkingsstrategier, fordeling av celler og fiducialperler, og teste forskjellige rutenettforberedelses- og blottingsparametere. Arbeid med en optimalt stupfrosen prøve vil legge betydelig til rette for nedstrømsbehandling.
Når det gjelder ethvert TEM-eksperiment, er det nødvendig med glassprøver. For store pattedyrceller som HeLa, er 1-2 celler per rutenettkvadrat å foretrekke, men celler kan fortsatt være glassaktige ved høyere tetthet. Eventuelt kan vitrifisering forbedres i pattedyrceller (f.eks. HEK293, HeLa) ved å inkubere dem med 2,5-10% (v / v) glyserol tilsatt til kulturmediet 10 minutter før det stuper23. Hvis tilgjengelig, kan rutemønster brukes til å sikre perfekt plassering og distribusjon av cellene, og dermed forbedre vitrifikasjon og senere korrelasjon24.
Mens spesifikke celler kan velges under arbeidsflyten, vil for få celler som viser den biologiske egenskapen av interesse, redusere den totale gjennomstrømningen betydelig. For å forbedre korrelasjonen i POI-positive celler, bør tilstrekkelig lyse fluoroforer brukes. Dette er spesielt viktig på endogene uttrykksnivåer. Vi fant ut at under kryoforhold presterte mVenus ofte bedre enn EGFP på grunn av den økte lysstyrken25 og det hypsokrome skiftet, noe som holder den egnet for standard GFP-filteroppsett under kryoforhold26. For ikke-punktlignende målstrukturer bør også avveiningen mellom bølgelengde og lokaliseringsnøyaktighet (Abbe-diffraksjonsgrense) vurderes.
Effektiv 3D-korrelasjon krever også at nettene er mekanisk stabile og håndteres med stor forsiktighet. Mens standard gull- eller kobbergitter med karbonstøtte kan brukes, kan suksessraten økes betydelig ved å bruke stive SiO2-filmer , avhengig av prosjektet. Imidlertid er det ennå ikke endelig bestemt om (a) mekanisk stabilitet eller (b) matchende termiske ekspansjonskoeffisienter (substrat vs. film) for å redusere kryorynker27, er den mest avgjørende faktoren for vellykket 3D-korrelasjon. Videre, for å plukke opp skjøre Au-nett, kan polydimetylsiloksanbelagte retter brukes5.
I tillegg til å sikre prøvestabilitet, er et nøye valg av FLM-bildeparametere nødvendig for å oppnå fluorescensstabler av høy kvalitet som er egnet for optimal målretting under FIB-fresing. I denne forbindelse anbefales det også å teste forskjellige denoising28 - eller dekonvolusjonsteknikker på FLM-dataene, da det kan forbedre lokaliseringen av fiducials og cellulære signaler betydelig. Når fluorescenssignalet korreleres til FIB-SEM-bilder, er det viktig med en god prøvetaking av fiducialperler. De skal være godt fordelt rundt cellene og eventuelt i ulike z-høyder. Det er også god praksis å validere konsistensen av korrelasjonen ved å sjekke de forutsagte vs. faktiske posisjonene til perler som bevisst ble utelatt fra fiducialmodellen, men som tydelig kan korreleres med øyet. 3DCTs RMSE-verdier bør også alltid vurderes for å kontrollere registreringskonsistensen.
Siden avsetning av frest materiale og restvann fra FIB-SEM-kammeret (dvs. rekontaminering) øker den effektive lamelltykkelsen ved å tilsette amorft materiale på begge sider av det, reduserer finmalte lameller i mikroskopet i lengre tid generelt TEM-datakvaliteten på grunn av ytterligere elektronspredningshendelser. Følgelig utføres fresing oftest på en to-trinns måte: først blir alle posisjoner malt omtrent (dvs. til ca. 800 nm), og deretter fint (til ~ 150-250 nm), og rutenettet blir umiddelbart losset etter at den siste lamellen er fullført. Bedre korrelasjonssuksess kan imidlertid oppnås ved å behandle posisjonene av interesse på en stedsvis måte, og dermed utføre grov og fin fresing på samme lamell rett etter hverandre, siden dette ikke gir tid til bøying eller deformasjon. Dette reduserer imidlertid det maksimale antallet lameller som kan produseres per rutenett, avhengig av rekontamineringshastigheten til systemet. For en hastighet på 20 nm / t produseres 4-6 lameller innen 1-1,5 timer.
Bevegelse av hele risten eller de grovmalte lamellene >300 nm vil resultere i dårlig eller mislykket korrelasjon (se også begrensninger diskutert nedenfor). Det bør derfor kontrolleres jevnlig, for eksempel ved å sammenligne IB-bilder før, under og etter FIB-fresing. Nettsteder som viser betydelig bevegelse (>300 nm) bør kastes. Optimaliser prøveprepareringen (dvs. valg av rutenetttype, celletetthet og stupende parametere; se protokollseksjon 1) og fresestrategi for å unngå disse bevegelsene. Lamellbøying kan reduseres betydelig ved stedsvis fresing som beskrevet i trinn 3.6 og ved å redusere lamellbredden. Som nevnt tidligere, mens stressavlastningskutt15 er designet for å redusere lamellbøying, resulterer de ofte i en samordnet bevegelse av den frakoblede lamellen, og forhindrer dermed korrelasjon effektivt. Integrerte FLM-systemer kan brukes til å løse dette problemet.
2. Modifikasjoner og feilsøking av metoden
Det anbefales sterkt å utføre en grundig karakterisering av prøven i levende celleavbildning før du går til kryoforhold. Optimalisering av celleprøver, behandlingsskjemaer og å vite hva slags signal du kan forvente før du går inn i kryoarbeidsflyten, kan forbedre suksessraten betydelig.
I arbeidsflyten som presenteres her, brukes et frittstående fluorescensmikroskop med et kryotrinn til å avbilde prøvene, etterfulgt av en overføring av rutenettene til det fokuserte ionstrålemikroskopet. Det har imidlertid blitt testet på systemer der et fluorescensmikroskop er integrert i FIB-SEM-kammeret, og derfor er det ikke nødvendig med prøveoverføring for å skaffe fluorescensbilder 29,30,31. Ved hjelp av slike integrerte systemer kan interesseposisjoner avbildes under og etter FIB-fresing for å kontrollere tilstedeværelsen av målfluorescenssignalet uten å øke risikoen for kontaminering av de endelige lamellene. Det er imidlertid viktig å huske på de optiske parametrene til de brukte mikroskopene, da for eksempel et lavt NA-mål vil begrense presisjonen som fiducial perler og målsignaler kan lokaliseres med. Ikke desto mindre vil integrerte FLM-oppsett bidra til å håndtere små deformasjoner av rutenett og lameller, da FLM-stabler kontinuerlig kan oppdateres og sammenlignes med oppdaterte SEM- og IB-visninger.
Som et alternativ til fluorescensavbildning av lamellen mellom FIB-fresing og TEM-datainnsamling, kan post-TEM-korrelasjon brukes til å verifisere riktig plassering og fresing av lamellene 5,6.
Under alle trinnene i den korrelative arbeidsflyten, men spesielt under TEM, anbefales det å lage et overlegg av de projiserte fluorescensdataene på FIB-SEM/TEM-bildene. Slike klassiske CLEM-visninger hjelper til med å forstå mer intuitivt hvilken del av cellene som finnes i lamellene. Dette fungerer også som en nyttig tilregnelighetskontroll for å verifisere nøyaktigheten av korrelasjonen.
3. Begrensninger av metoden
Den 3D-korrelative FIB-tilnærmingen krever prøver som kan leveres med fiducial perler. Følgelig er denne metoden for tiden begrenset til stupfrosne rister. For høytrykks (HPF) frosne (vev) prøver, for tiden kan bare 2D-2D korrelasjoner utføres. Potensielt kan interne fiducial markører (f.eks. organeller, fargede lipiddråper) være en løsning på dette problemet32,33. Den endelige korrelasjonssuksessraten avhenger av mange faktorer, inkludert prøvekvaliteten, fluorescensmikroskopioppsettet, lamelltykkelsen og størrelsen på den målrettede strukturen. Korrelasjonsnøyaktigheten ved hjelp av den beskrevne 3D-registreringsmetoden er estimert til å være i området 200-300 nm på det endelige IB-bildet, omtrent tilsvarende den typiske tykkelsen på FIB-fresede lameller7. Følgelig vil cellulære strukturer som er mye mindre enn dette være vanskelig å målrette for øyeblikket. I tillegg reduserer overdreven bevegelse på fresestedet (>300 nm) også nøyaktigheten av korrelasjonen, et problem som potensielt kan løses med FLM-oppsett integrert i FIB / SEM-instrumenter. Lameller som viser sterk deformasjon eller bøyning under fresing, bør uansett utelukkes fra arbeidsflyten nedstrøms.
Samlet sett er kryofluorescensavbildning for tiden begrenset av Abbe-diffraksjonskriteriet. Med mer rutinemessig anvendelse (og kommersialisering) av superoppløste kryo-FLM-metoder, kan mer nøyaktig målretting av cellulære strukturer bli mulig, spesielt når integrert i FIB / SEM for on-the-fly drift.
4. Betydningen av metoden
Spesielt i forhold til ikke-målrettede og post-korrelasjonsteknikker, tillater den 3D-korrelerte FIB-fresemetoden valg av passende posisjoner før det tid- og ressurskrevende TEM-trinnet. Det muliggjør dermed mer effektiv datainnsamling og prosjektplanlegging. Videre legger de korrelerte fluorescensdataene til et lag med informasjon som kan være avgjørende for å tolke tomogrammene og for å integrere kryo-ET-resultatene i multiskalaprosjekter, spesielt når det gjelder ikke-strukturerte proteinsamlinger eller de som er for små for malmatching og subtomogramgjennomsnitt.
5. Betydning og potensielle fremtidige applikasjoner
I kombinasjon med avanserte arbeidsflyter som kryoløft ut av HPF-prøver 34,35, cryo-FIB-SEM volum 36 og superoppløselig fluorescensavbildning26,37,38,39, gir 3D-målrettet lamellpreparering utsikter til ikke bare å dissekere biologiske prosesser i isolerte celler, men også å gjøre vevs- og pasientprøver tilgjengelige for FIB-fresing og kryo-elektrontomografi. Som sådan vil det tillate disseksjon av patologiske prosesser ved høy oppløsning og dermed være en integrert byggestein mot en biopsi på nanoskala.

Fokusert ionstrålefresing tillater fremstilling av tynne biologiske prøver fra kryofaste prøver uten problemene som vanligvis er forbundet med mekaniske seksjoneringer som knivmerker og kompresjonsartefakter1. Når parret med kryo-elektrontomografi, muliggjør FIB-fresing høyoppløselige biologiske studier av cellulær morfologi og bestemmelse av strukturen til makromolekylære komplekser direkte fra celler ved sub-nanometeroppløsning 2,3,4. Mens rikelig arter, som ribosomer, lett finnes i tilfeldig kuttede FIB-lameller, er mange cellulære prosesser avhengige av samlokalisering av flere komplekser eller er lokalisert til bestemte steder i cellen. Følgelig kreves effektiv målretting for ikke å miste den biologiske egenskapen av interesse under freseprosessen og være begrenset til tilfeldige treff. En korrelativ tilnærming som kombinerer data fra skanningselektronmikroskopet (SEM)-FIB og et kryofluorescenslysmikroskop (FLM) er derfor nødvendig. Selv om det er mulig å utelate den opprinnelige korrelasjonen og kombinere FLM- og kryo-ET-data først etter TEM-oppkjøp5,6, muliggjør fluorescensstyrt fokusert ionstrålefresing et nøyaktig valg av freseområdet på forhånd, noe som resulterer i mer effektiv datainnsamling. Siden unnfangelsen7 hadde anvendelsen av 3D-korrelert FIB-fresing i biologiske studier vært begrenset til vi nylig rapporterte å identifisere et nytt væske-væske faseseparert (LLPS) rom i gjær ved hjelp av denne teknikken8.
Beskrevet her er en generalisert 3D-kryokorrelert lys- og elektronmikroskopi (CLEM) protokoll, som kan brukes til å studere et bredt spekter av prøver som spenner fra bakterier til gjær og pattedyrceller. Mens eksperimentene ble utført ved hjelp av et bestemt sett med instrumenter, er de enkelte trinnene ikke bundet til spesifikk maskinvare og kan enkelt overføres til andre systemer som en utvidelse til eksisterende protokoller 3,5. En liste over testet utstyr og foreslåtte innstillinger er gitt i materialfortegnelsen og tabell 1. De fire hovedtrinnene i rørledningen er (1) prøvepreparering, (2) lokalisering av egenskaper av interesse ved kryofluorescensmikroskopi, (3) 3D-korrelert fokusert ionstrålefresing og (4) lokalisering av målrettede strukturer for kryo-ET-datainnsamling på lamellene i kryotransmisjonselektronmikroskopet (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

Kryo-elektrontomografi (kryo-ET) har blitt den valgte metoden for å undersøke cellulær ultrastruktur og molekylære komplekser i deres innfødte, frosne hydrerte tilstand. Kryo-ET krever imidlertid at prøvene er tynne nok til ikke å spre eller blokkere den innfallende elektronstrålen. For tykke celleprøver kan dette oppnås ved kryofokusert ionstråle (FIB) fresing. Denne protokollen beskriver hvordan man målretter mot spesifikke cellulære steder under FIB-fresing ved hjelp av en 3D-korrelativ tilnærming, som kombinerer tredimensjonale fluorescensmikroskopidata med informasjon fra FIB-skanningselektronmikroskopet. Ved hjelp av denne teknikken kan sjeldne cellulære hendelser og strukturer målrettes med høy nøyaktighet og visualiseres ved molekylær oppløsning ved hjelp av kryotransmisjonselektronmikroskopi (cryo-TEM).

Protokollen gir en gjennomgang av rørledningen som brukes til å oppdage det EH-domeneholdige og endocytoseproteinet 1 (Ede1)-avhengige endocytiske proteinavsetningen (END) og dets nedbrytning og fangst i autofagiske legemer8. END er et væske-væske faseseparert rom i S. cerevisiae, som bufrer en rekke proteiner involvert i clathrin-mediert endocytose (CME) etter mislykkede endocytiske hendelser. En av hovedkomponentene er Ede1, som også fungerer som en CME-komponent og som en selektiv autofagireseptor for nedbrytning av dette nye LLPS-rommet. Følgelig ble en EGFP-fusjon av Ede1 (EGFP-Ede1) under kontroll av alkoholdehydrogenase (ADH) -promotoren brukt til å visualisere ENDs siden Ede1-overekspresjon forstyrrer de tidlige stadiene av endocytose og derfor konstitutivt induserer LLPS.
På et stupfrosset rutenett med EGFP-Ede1 overuttrykkende gjærceller og 1 μm fiducial markører ble fem posisjoner valgt for FLM-stakkoppkjøp i GFP-kanalen (figur 6A; TFS Korrsight; konfokalmodus, 300 nm fokustrinnstørrelse, 10 μm rekkevidde). Rutenettet ble overført til FIB-instrumentet (Quanta 3D FEG), og rutenettene som FLM-stabler var anskaffet for, ble identifisert ved å utføre en 2D-2D-korrelasjon mellom fluorescens- og SEM-rutenettoversiktene (sammenlign trinn 3.2).
For hver av de valgte rutene ble ionstrålebilder tatt ved lav strøm (10 pA, 1200x forstørrelse), og tilsvarende fiducialposisjoner ble registrert i 3DCT. Etter valg av posisjoner med den biologiske egenskapen av interesse og tilpasning av deres 3D-posisjon i FLM-stakken, ble den funnet transformasjonen påført antatte END-posisjoner, og stedene for lamellpreparasjon ble valgt (figur 6B). En FIB-stråle skråstilt 11° i forhold til rutenettoverflaten ble brukt i eksemplene vist her (45° FIB shuttle pre-tilt; 18° trinnhelling). Posisjoner av interesse ble overført, og FIB-mønstre ble tegnet manuelt (figur 6D) ved å måle avstanden til de forutsagte posisjonene i forhold til fremtredende landemerker i FIB-bildet (f.eks. hull, isforurensninger, fiducialperler). Nøyaktigheten av registreringen ble evaluert ved bevisst å utelate perler som tydelig kunne identifiseres i FLM- og IB-bildet, og deretter sammenligne deres faktiske og forutsagte posisjoner i ionstrålevisningen (f.eks. diamant i figur 6B, C). Korrelasjonen for kvadratet vist i figur 6C ble funnet å være nøyaktig (dvs. den forutsagte posisjonen til FLM-perleposisjoner falt perfekt sammen med deres tilsvarende IB-plassering og 3DCT rapporterte subpiksel-RMSE-verdier for registreringen). Dermed ble lameller kuttet ved de forutsagte posisjonene (Site B) og finmalt til en tykkelse på ~ 200 nm (endelig mønsterforskyvning).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> Figur 6: Representative resultater for 3D-korrelativ målretting av endocytiske proteinavleiringer (END) i gjær. (A) SEM oversikt over nettet før fresing. De fargede boksene indikerer rutenett for hvilke fluorescensstabler ble tatt på forhånd. (B-C) 3D-korrelasjon i et rutenett firkant. Etter å ha registrert flere tilsvarende fiduciale perler (fargede bokser) i FLM-dataene (B, her vist som maksimal intensitetsprojeksjon) og ionstrålebildet (C), ble nøyaktigheten av 3D-registreringen verifisert ved å forutsi posisjonen til perlen indikert med diamanten. Deretter ble posisjonene til målsignalet (røde sirkler) spådd i ionstrålevisningen for to potensielle fresesteder. (D) Zoom inn på område B som viser de anslåtte posisjonene til tre målpuncta (røde sirkler) og de første fresemønstrene (gule bokser). En fjerde fluorescens punctum ble spådd å være mye lavere enn den andre puncta og derfor ikke målrettet under fresing (grå sirkel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Etter vellykket FIB-fresing og overføring av nettet til kryo-transmisjonselektronmikroskopet (Titan Krios opererte på 300 kV og utstyrt med en Gatan K2 direkte elektrondetektor og Bioquantum energifilter), ble en rutenettoversikt registrert i SerialEM og brukt til å finne firkanter med lameller. For hver lamell ble det samlet inn oversiktsbilder, og FLM-dataene ble registrert i 3DCT (3D-2D) med tilsvarende fiducialperler. Posisjonene til de biologiske egenskapene av interesse (figur 7A) ble deretter forutsagt ved hjelp av transformasjonen beregnet fra fiducialperlene. Lamelloversikter registrert ved høyere forstørrelse ble sydd, og steder av interesse korrelerte ved hjelp av tydelig synlige landemerker (f.eks. fiducial perler). Alternativt kan klassiske CLEM-oversikter produseres i ulike programvarer10,12.
Basert på korrelasjonen ble det funnet fire potensielle steder for tomogramoppkjøp for lamellen vist i figur 7A. Dette inkluderer imidlertid også en posisjon som ikke var målrettet under den 3D-korrelerte FIB-fresingen (sammenlign figur 6D; grå sirkel) og en posisjon blokkert av isforurensning (figur 7; grå bokser). Følgelig kunne tomogrammer bare registreres for to posisjoner (figur 7B). Samlet sett ble det oppnådd en korrelasjonssuksess på ~ 75%, dvs. lameller som overlevde overføringen til TEM- og END-strukturene på de forutsagte stedene (12 korrelerte steder). Etter tomogramrekonstruksjon, segmentering og malmatching, kan individuelle END-strukturer visualiseres i sin opprinnelige kontekst (figur 7C, D). Dette inkluderer det fenestrerte endoplasmatiske retikulumet (ER) som omgir END, lipiddråper som av og til tar kontakt, og ribosomer, som er ekskludert fra LLPS-rommet. Samlet viser dette hvordan 3D-korrelativ FIB-fresing kan gi molekylær informasjon om sjeldne biologiske prosesser fra intakte celler.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> Figur 7: Representative resultater for visualisering av END med cryo-ET. (A) TEM-oversikten med lav forstørrelse av fresestedet vist i figur 6 kan lett korreleres med FLM maksimal intensitetsprojeksjon (figur 6B) for å lokalisere biologiske trekk av interesse (røde kryss). (B) I et andre trinn kan en høyere forstørrelse (sydd) visning korreleres, og posisjoner for tomogramoppkjøp (gule bokser) er satt opp. Steder som følge av signalet utenfor planet (grå boks, sammenlign figur 6D) ble ignorert. (VG Nett) Ved hjelp av denne 3D-korrelative FIB-tilnærmingen kan endocytisk proteinforekomst (END) visualiseres i sitt opprinnelige miljø. Strukturer som endoplasmatisk retikulum (ER), ribosomer, membraner og lipiddråper kan identifiseres og visualiseres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Innstillinger for plasmarenser</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG:</td>
			<td colspan="3">Radiofrekvens setiing: "HI", 30 s; N2 plasma</td>
		</tr><tr><td>Innstillinger for stempel</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">100% fuktighet; blotforce = 8; blottime = 10 s; ventetid 0 s; (Dette skal fungere for de fleste suspensjons- og adherentceller)</td>
		</tr><tr><td>FIB GIS-posisjoner og tidspunkter</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">Vipp = 0, Rotasjon = -180, Z-posisjon = 13,5, Temperatursettpunkt = 26,15° , Tid = 8 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">Vipp = 0, Rotasjon = -180, Z-posisjon = 9,8, Temperatursettpunkt = 28 ° C, Tid = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">Forhåndsdefinert posisjon for programvare, Temperatursettpunkt = 28° , Tid = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">Programvare forhåndsdefinert posisjon, Temperatursettpunkt = 28°, Tid = 7 s</td>
		</tr><tr><td>Innstillinger for FIB Sputter Coater</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quorumssystem:</td>
			<td colspan="3">I quorum prep kammer: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>Tomogram Oppkjøp</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi2</td>
			<td colspan="3">K2 kamera, Gatan Bioquantum energifilter</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eV spalte; dosesymmetrisk tiltskjema (Hagen) med 2° trinn; Start på +10° (lamellforvipp!) til +70°og -50°</td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Falcon 4; Selectris X energifilter</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eV spalte; dosesymmetrisk tiltskjema (Hagen) med 2° trinn; Start på +10° (lamellforvipp!) til +70° og -50°</td>
		</tr><tr><td>FLM-oppkjøp</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Korrsight (konfokal modus)</td>
			<td colspan="3">Mål: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; Parametere for stakkinnhenting: x-y pikselstørrelse = 161,25 nm, z-trinnstørrelse = 300 nm.</td>
		</tr><tr><td>Leica SP8 kryo-konfokal</td>
			<td colspan="3">Mål: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; Parametere for stakkinnhenting: x-y pikselstørrelse = 84 nm, z-trinnstørrelse = 300 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Liste over testet utstyr og foreslåtte innstillinger.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Her presenterer vi en rørledning for 3D-korrelativ fokusert ionstrålefresing for å veilede fremstillingen av cellulære prøver for kryo-elektrontomografi. 3D-posisjonen til fluorescerende merkede proteiner av interesse bestemmes først ved kryofluorescensmikroskopi, og deretter målrettet for fresing. Protokollen er egnet for pattedyr-, gjær- og bakterieceller.

Prøvepreparering ved 3D-korrelativ fokusert ionstrålefresing for høyoppløselig kryo-elektrontomografi

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

3D-korrelativ FIB-fresing gjør spesifikke og til og med sjeldne cellehendelser tilgjengelige for Cryo-TEM. Tillater åpenbaring av denne hendelsens ultrastruktur direkte i det opprinnelige miljøet. Den korrelative arbeidsflyten forbedrer suksessraten for å målrette mot sjeldne cellulære strukturer, og bidrar til å identifisere dem entydig i det overfylte cellulære miljøet.Å demonstrere prosedyren vil være Anna Bieber og Christina Capitanio, eksperter på korrelativ kryo-elektrontomografi. Begynn kryofluorescensmikroskopien av cellefrøgitterene ved å skaffe deg en bred feltoversikt i fluorescens og reflektert"-modus. Velg deretter passende rutenettruter med fluorescenssignal.Etter å ha forsikret deg om at cellene og perlene er jevnt fordelt mot midten av hver rute, velger du rutene på 200 nettgitter som er tilgjengelige både for FIB-SEM- og TEM-instrumentet, og som er minst tre kvadrater unna rutenettkanten. På hver av de valgte rutene får du en fluorescerende stabel med et passende fokusert trinn. Høye numeriske blenderåpningsmål bør brukes til å øke fotonantallet og lokaliseringsnøyaktigheten.På et konfokalmikroskop med numerisk blenderåpning 0,9 mål, få stabler med 300 nanometer trinnstørrelse og oversampling Nyquist-verdien. Ta opp flere fargestabler og lagre rutenett under flytende nitrogen til videre bruk. Bruk enten utskjærings- eller orienteringsmerkene for å sikre riktig orientering av rutenettet for senere plassering i TEM.Last ristene inn i kryo-FIB-SEM-instrumentet. Kontroller at freseretningen er vinkelrett på vippeaksen til TEM. For å belegge ristene med et beskyttende organometallisk lag, bruk en plasmakoder og gassinjeksjonssystem i sceneposisjonene som er forhåndsdefinert av FIB-SEM-oppsettet.Deretter registrerer du SEM-rutenettoversikten og utfører en 2D-korrelasjon med FLM-oversikter. Finn rutenettrutene ved å inspisere rutenettoversikter manuelt eller bruke en programvarepakke. Velg og fire tilsvarende posisjoner for rutene i rutenettoversikten FLM og SEM og beregn transformasjonen mellom de merkede punktene for FLM-SEM-korrelasjon.Plasser deretter markørene i midten av de tilsvarende rutenettrutene som FLM-stabler er anskaffet for, før du forutsier posisjonen i SEM-visningen. For hver korrelerte rutenettfirkant, ta et ionstrålebilde med lav strøm ved den valgte FIB-fresevinkelen og velg et synsfelt med ønsket posisjon og forstørrelse som samsvarer med fluorescensdataene. For 200 mesh-rutenett kan du hente FIB-SEM-data for å inneholde enkeltrutenett, inkludert rutenettstolpene.Ta deretter et SEM-bilde av samme firkant for å hjelpe til med identifisering av tilsvarende perler i fluorescens- og ionstrålevisningen. Utfør registrering av den rå eller deconvoled 3D FLM-stakken og 2D-ionstrålevisningen for hver posisjon med 3D-korrelasjonsverktøykassen, 3D CT, ved å laste inn den tilsvarende omskårne 3D FLM-stakken og ionstrålevisningen i 3D-CT.In fluorescensdataene, velg fire fiducialperler og høyreklikk på posisjonslisten for å bestemme 3D-posisjonen til perlene via Gaussisk montering av signalet i X, Y og Z. Velg deretter de tilsvarende perlene i ionstrålebildet for å utføre en innledende 3D-korrelasjon. På samme måte kan du legge til flere perler i registreringen for å kontrollere nøyaktigheten av korrelasjonen.Utelat noen fiducial perler som er tydelig identifiserbare i både fluorescens og ionstråle ved å sjekke deres forutsagte versus faktiske plassering i ionstrålebildet. I 3D CT kan rotmiddelkvadratfeil, eller RMSE-verdier, vises for å vurdere korrelasjonskonsistensen. Kontroller at RMSE-verdiene er små og i samme rekkefølge som lokaliseringsnøyaktighet.Velg deretter de målrettede mobilsignalene og tilpass 3D-posisjonen i FLM-stakken før du bruker transformasjonen til å forutsi målposisjonene i ionstrålevisningen. For hver korrelert firkant, overfør de forutsagte posisjonene til funksjonene av interesse til FIB-SEM-instrumentet for å plassere lamellfresemønstrene. Hvis det er flere signaler per celle, plasserer du mønstrene slik at de inkluderer maksimalt mulige interessepunkter i samme lamell.Grov frese lamellene etterfulgt av fin fresing for å få en endelig tykkelse på 150 til 250 nanometer. Sørg for at lamellorienteringen er vinkelrett på vippsaksen når du laster ristene inn i transmisjonselektronmikroskopet. Skaff rutenettmontasje og oversikter for hvert rutenett som inneholder lameller med passende forstørrelse og eksponeringstid for å visualisere fiducialperlene i TEM-bildene uten å legge vesentlig til den totale elektrondosen.Skaff deg TEM-kart med høy oppløsning for hver lamell. Registrer og 3D-2D korrelerer FLM-stakken med TEM-rutenettet og lamelloversiktene i 3D CT. Utfør korrelasjon mellom FLM og TEM fra lav til høy forstørrelse i TEM. Etter overføring av posisjonene, sett opp og kjør tilt-serien ved korrelerte posisjoner "bruk deretter en passende forstørrelse, defokus og total dose for å starte bildeopptaket ved pre-tilt bestemt av lamellen ved hjelp av et dosesymmetrisk tiltskjema.Følg enten manuell eller batchinnsamling av bilder. I den representative analysen er TEM-oversikten med lav forstørrelse vist å lokalisere biologiske egenskaper av interesse. Senere ble en høyere forstørrelsesvisning korrelert med FLM maksimal intensitetsprojeksjon og posisjoner for tomogramoppkjøp ble satt opp.I de oppkjøpte bildene kunne endocytisk proteininnskudd visualiseres i sitt opprinnelige miljø. Optimaliseringen av prøven er svært viktig. Gitterforberedelsen bør optimaliseres for å ha en god fordeling av celler som skal freses og et stort antall synlige fiducialperler i de fleste rutene.3D-korrelativ fresing har bidratt til å avsløre ultrastrukturen til forskjellige cellulære prosesser, for eksempel den trinnvise progresjonen av autofagi i hver celle, og den brukes til å fange et nytt fasedelt rom.

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo-elektron mikroskopi prøven forberedelse ved hjelp av en Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Gjøre og ikke gjøre av Cryo-elektronmikroskopi: En Primer på Prøvepreparering og High Quality datainnsamling for Macromolecular 3D Rekonstruksjon

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Utarbeidelse og Observasjon av Thick biologiske prøver av Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Isolering av Intakt Mitokondrier fra Skeletal Muscle av differensialsentrifugering for høy oppløsning respirometri Målinger

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering av DNA komprimering i Cyanobakterie av høyspent Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...