Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Agradecemos a Inga Wolf pelo suporte à infraestrutura de TI, a Florian Beck pelo suporte computacional e a Oda H. Schiøtz pela leitura crítica do manuscrito. O financiamento foi fornecido em parte através de uma bolsa de retorno Alexander von Humboldt para Philipp S. Erdmann e uma bolsa de longo prazo EMBO ALTF 764-2014 para Florian Wilfling. Anna Bieber foi apoiada por uma bolsa de doutorado da Boehringer Ingelheim Fonds.

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

1. Etapas críticas do protocolo
A otimização da cultura de células e dos parâmetros de imersão da grade é fundamental para esse fluxo de trabalho. No início de um projeto, vale a pena investir tempo para otimizar as estratégias de marcação, a distribuição de células e contas fiduciais e testar diferentes parâmetros de preparação de grade e blotting. Trabalhar com uma amostra congelada por imersão ideal facilitará significativamente o processamento a jusante.
Como para qualquer experimento de MET, amostras vítreas são necessárias. Para células de mamíferos de grande porte, como HeLa, 1-2 células por quadrado de grade são preferíveis, mas as células ainda podem ser vítreas em maior densidade. Opcionalmente, a vitrificação pode ser melhorada em células de mamíferos (por exemplo, HEK293, HeLa) incubando-as com glicerol a 2,5-10% (v/v) adicionado ao meio de cultura 10 minutos antes de mergulhar23. Se disponível, a padronização em grade pode ser usada para garantir o perfeito posicionamento e distribuição das células, melhorando assim a vitrificação e posterior correlação24.
Embora células específicas possam ser selecionadas durante o fluxo de trabalho, poucas células que mostram a característica biológica de interesse reduzirão significativamente a taxa de transferência geral. Para melhorar a correlação em células positivas para POI, fluoróforos suficientemente brilhantes devem ser usados. Isto é especialmente importante a níveis de expressão endógena. Descobrimos que, sob condições criocômicas, o mVenus frequentemente teve um desempenho melhor do que o EGFP devido ao seu maior brilho25 e ao deslocamento hipsocrômico, que o mantém adequado para configurações de filtro GFP padrão sob condições criocômicas26. Para estruturas alvo não pontuais, o trade-off entre comprimento de onda e precisão de localização (limite de difração de Abbe) também deve ser considerado.
A correlação 3D eficiente também requer que as grades sejam mecanicamente estáveis e sejam manuseadas com muito cuidado. Enquanto grades padrão de ouro ou cobre com suporte de carbono podem ser usadas, a taxa de sucesso pode ser significativamente aumentada usando filmes SiO2 mais rígidos, dependendo do projeto. No entanto, ainda não foi conclusivamente determinado se (a) estabilidade mecânica ou (b) coeficientes de expansão térmica compatíveis (substrato vs. filme) para reduzir o crioenrugamento27, é o fator mais crucial para o sucesso da correlação 3D. Além disso, para pegar grades de Au frágeis, podem ser usados pratos revestidos de polidimetilsiloxano5.
Além de garantir a estabilidade da amostra, uma escolha cuidadosa dos parâmetros de imagem FLM é necessária para obter pilhas de fluorescência de alta qualidade que sejam adequadas para o direcionamento ideal durante a fresagem FIB. A este respeito, o teste de diferentes técnicas de denoização28 ou deconvolução nos dados FLM também é aconselhado, pois pode melhorar consideravelmente a localização de fiduciais e sinais celulares. Ao correlacionar o sinal de fluorescência com imagens FIB-MEV, uma boa amostragem de esferas fiduciais é importante. Eles devem estar bem distribuídos ao redor das células e, possivelmente, em diferentes alturas z. Também é uma boa prática validar a consistência da correlação, verificando as posições previstas versus reais de contas que foram deliberadamente deixadas de fora do modelo fiducial, mas podem ser claramente correlacionadas a olho nu. Os valores RMSE da 3DCT também devem ser sempre considerados para verificar a consistência do registro.
Como a deposição de material moído e água residual da câmara de MEV-FIB (isto é, recontaminação) aumenta a espessura efetiva da lamela pela adição de material amorfo a ambos os lados dela, manter lamelas moídas finas no microscópio por um tempo prolongado geralmente reduz a qualidade dos dados de MET devido a eventos adicionais de espalhamento de elétrons. Assim, a fresagem é mais frequentemente realizada em duas etapas: primeiro, todas as posições são fresadas aproximadamente (ou seja, para cerca de 800 nm), e depois finamente (para ~150-250 nm), e a grade é imediatamente descarregada após a última lamela ter sido concluída. Um melhor sucesso de correlação pode, no entanto, ser alcançado processando as posições de interesse de maneira local, realizando assim a fresagem áspera e fina na mesma lamela diretamente após a outra, uma vez que isso não deixa tempo para flexão ou deformação. Isso, no entanto, reduz o número máximo de lamelas que podem ser produzidas por rede, dependendo da taxa de recontaminação do sistema. Para uma taxa de 20 nm/h, 4-6 lamelas são produzidas dentro de 1-1,5 h.
O movimento de toda a grade ou das lamelas rugosas >300 nm resultará em correlação fraca ou malsucedida (veja também as limitações discutidas abaixo). Portanto, deve ser verificado regularmente, por exemplo, comparando imagens IB antes, durante e após a fresagem FIB. Sítios que apresentem movimentação significativa (>300 nm) devem ser descartados. Otimize a preparação da amostra (ou seja, escolha do tipo de grade, densidade celular e parâmetros de imersão; ver protocolo seção 1) e estratégia de fresagem para evitar esses movimentos. A flexão da lamela pode ser significativamente reduzida pela fresagem local, conforme descrito na etapa 3.6, e pela redução da largura da lamela. Como mencionado anteriormente, embora os cortes de alívio de tensão15 tenham sido projetados para reduzir a flexão da lamela, eles geralmente resultam em um movimento concertado da lamela desacoplada, impedindo assim efetivamente a correlação. Sistemas FLM integrados podem ser usados para resolver esse problema.
2. Modificações e resolução de problemas do método
É altamente recomendável realizar uma caracterização completa da amostra em imagens de células vivas antes de ir para criocondições. Otimizar as amostras celulares, esquemas de tratamento e saber que tipo de sinal esperar antes de entrar no criofluxo de trabalho pode melhorar substancialmente sua taxa de sucesso.
No fluxo de trabalho aqui apresentado, um microscópio de fluorescência autônomo com um estágio criogênico é usado para obter imagens das amostras, seguido por uma transferência das grades para o microscópio de feixe de íons focalizado. Entretanto, tem sido testado em sistemas em que um microscópio de fluorescência é integrado à câmara de MEV-FIB e, portanto, não é necessária transferência de amostra para a aquisição de imagens de fluorescência 29,30,31. Usando tais sistemas integrados, as posições de interesse podem ser fotografadas durante e após a fresagem FIB para verificar a presença do sinal de fluorescência alvo sem aumentar o risco de contaminação das lamelas finais. No entanto, é importante ter em mente os parâmetros ópticos dos microscópios utilizados, pois, por exemplo, uma objetiva de NA baixa limitará a precisão com que esferas fiduciais e sinais alvo podem ser localizados. No entanto, as configurações FLM integradas ajudarão a lidar melhor também com pequenas deformações de grades e lamelas, já que as pilhas FLM podem ser continuamente atualizadas e comparadas com visualizações SEM e IB atualizadas.
Como alternativa à imagem de fluorescência da lamela entre a fresagem de FIB e a aquisição de dados de MET, a correlação pós-MET pode ser usada para verificar o correto posicionamento e moagem das lamelas 5,6.
Durante todas as etapas do fluxo de trabalho correlativo, mas especialmente durante o MET, recomenda-se criar uma sobreposição dos dados de fluorescência projetados nas imagens de MEV/FIB. Essas visões clássicas do CLEM ajudam a entender de forma mais intuitiva qual parte das células está contida dentro das lamelas. Isso também serve como uma verificação de sanidade útil para verificar a precisão da correlação.
3. Limitações do método
A abordagem FIB correlativa 3D requer amostras que podem ser fornecidas com esferas fiduciais. Assim, este método é atualmente restrito a grades congeladas por imersão. Para amostras congeladas (tecido) de alta pressão (HPF), atualmente, apenas correlações 2D-2D podem ser realizadas. Potencialmente, marcadores fiduciais internos (por exemplo, organelas, gotículas lipídicas coradas) poderiam ser uma solução para esse problema32,33. A taxa de sucesso da correlação final depende de muitos fatores, incluindo a qualidade da amostra, a configuração da microscopia de fluorescência, a espessura da lamela e o tamanho da estrutura alvo. Estima-se que a precisão de correlação usando a abordagem de registro 3D descrita esteja na faixa de 200-300 nm na imagem IB final, correspondendo aproximadamente à espessura típica das lamelas fresadas com FIB7. Assim, estruturas celulares muito menores do que isso serão difíceis de atingir no momento. Além disso, o movimento excessivo no local de fresagem (>300 nm) também reduz a precisão da correlação, um problema que pode ser potencialmente resolvido com configurações FLM integradas em instrumentos FIB/MEV. Lamelas que apresentem forte deformação ou flexão durante a fresagem devem, em qualquer caso, ser excluídas do fluxo de trabalho a jusante.
Em geral, a criofluorescência é atualmente limitada pelo critério de difração de Abbe. Com a aplicação mais rotineira (e comercialização) de métodos crio-FLM super-resolvidos, o direcionamento mais preciso de estruturas celulares pode se tornar possível, especialmente quando integrado ao FIB/MEV para operação em tempo real.
4. Importância do método
Especialmente em comparação com técnicas não direcionadas e pós-correlação, a abordagem de fresagem FIB correlacionada em 3D permite a seleção de posições adequadas antes da etapa de ETM que consome tempo e recursos. Com isso, possibilita uma coleta de dados e um planejamento de projetos mais eficientes. Além disso, os dados de fluorescência correlacionados adicionam uma camada de informação que pode ser crucial para interpretar os tomogramas e integrar os resultados do crio-ET em projetos multiescala, especialmente quando se trata de conjuntos de proteínas não estruturadas ou muito pequenas para correspondência de modelos e média de subtomograma.
5. Importância e potenciais aplicações futuras
Em combinação com fluxos de trabalho avançados, como crio-lift de amostras de HPF 34,35, crio-FIB-SEM volume 36 e imagem de fluorescência de super-resolução26,37,38,39, a preparação de lamela direcionada em 3D oferece a perspectiva de não apenas dissecar processos biológicos em células isoladas, mas também tornar amostras de tecidos e pacientes acessíveis à fresagem de FIB e à tomografia crio-eletrônica. Como tal, permitirá a dissecção de processos patológicos em alta resolução e, portanto, será um bloco de construção integral para uma biópsia na nanoescala.

A fresagem por feixe iônico focalizado permite a preparação de amostras biológicas finas a partir de corpos de prova criofixados sem os problemas comumente associados a cortes mecânicos, como marcas de faca e artefatos de compressão1. Quando emparelhada com a tomografia crioeletrônica, a moagem FIB permite estudos biológicos de alta resolução da morfologia celular e determinação da estrutura de complexos macromoleculares diretamente do interior das células em resolução subnanométrica2,3,4. Enquanto espécies abundantes, como ribossomos, são facilmente encontradas em lamelas FIB cortadas aleatoriamente, muitos processos celulares dependem da colocalização de vários complexos ou estão localizados em locais específicos dentro da célula. Consequentemente, o direcionamento eficiente é necessário para não perder a característica biológica de interesse durante o processo de moagem e ser limitado a acertos aleatórios. Uma abordagem correlativa que combine dados do microscópio eletrônico de varredura (MEV)-FIB e um microscópio de luz criofluorescência (FLM) é, portanto, necessária. Embora seja possível omitir a correlação inicial e combinar dados de FLM e crio-ET somente após a aquisição de MET5,6, a fresagem por feixe de íons focalizado guiada por fluorescência permite uma seleção precisa da área de moagem previamente, resultando em uma aquisição de dados mais eficiente. Desde sua concepção7, a aplicação da moagem FIB correlacionada em 3D em estudos biológicos era limitada até recentemente relatarmos a identificação de um novo compartimento líquido-líquido separado por fase (LLPS) em leveduras usando esta técnica8.
Descrito aqui é um protocolo de microscopia de luz e eletrônica (CLEM) criocorrelacionada 3D generalizada, que pode ser usado para estudar uma ampla variedade de amostras que variam de bactérias a leveduras e células de mamíferos. Embora os experimentos tenham sido realizados com um determinado conjunto de instrumentos, os passos individuais não estão vinculados a hardware específico e podem ser facilmente transferidos para outros sistemas como uma extensão dos protocolos existentes 3,5. Uma lista dos equipamentos testados e configurações sugeridas são fornecidas na Tabela de Materiais e na Tabela 1. As quatro etapas principais da tubulação são (1) preparação da amostra, (2) localização de características de interesse por microscopia de criofluorescência, (3) fresagem por feixe de íons focalizado correlacionado em 3D e (4) localização das estruturas alvo para aquisição de dados de crio-ET nas lamelas no microscópio eletrônico de criotransmissão (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

A tomografia crioeletrônica (crio-TE) tornou-se o método de escolha para investigar a ultraestrutura celular e complexos moleculares em seu estado nativo congelado-hidratado. No entanto, o crio-ET requer que as amostras sejam finas o suficiente para não espalhar ou bloquear o feixe de elétrons incidente. Para amostras celulares espessas, isso pode ser obtido por fresagem por feixe de íons criofocado (FIB). Este protocolo descreve como atingir sítios celulares específicos durante a fresagem de FIB usando uma abordagem correlativa 3D, que combina dados de microscopia de fluorescência tridimensional com informações do microscópio eletrônico de varredura de FIB. Usando esta técnica, eventos e estruturas celulares raras podem ser alvo com alta precisão e visualizados em resolução molecular usando microscopia eletrônica de criotransmissão (crio-TEM).

O protocolo fornece um passo a passo do pipeline usado para descobrir o depósito endocítico dependente de proteína endocítica (END) dependente da proteína 1 (Ede1) contendo o domínio EH e sua degradação e aprisionamento em corpos autofágicos8. O END é um compartimento líquido-líquido separado por fase em S. cerevisiae, que tampona uma variedade de proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina (CME) após eventos endocíticos malsucedidos. Um de seus principais componentes é o Ede1, que funciona como componente da EMC e como receptor seletivo de autofagia para a degradação desse novo compartimento de LLPS. Assim, uma fusão EGFP de Ede1 (EGFP-Ede1) sob o controle do promotor da álcool desidrogenase (ADH) foi usada para visualizar ENDs, uma vez que a superexpressão de Ede1 interfere nos estágios iniciais da endocitose e, portanto, induz constitutivamente LLPS.
Em uma grade congelada por imersão com células de levedura superexpressando EGFP-Ede1 e marcadores fiduciais de 1 μm, cinco posições foram selecionadas para aquisição da pilha FLM no canal GFP (Figura 6A; TFS Corrsight; modo confocal, tamanho do passo de foco de 300 nm, faixa de 10 μm). A grade foi transferida para o instrumento FIB (Quanta 3D FEG), e os quadrados de grade para os quais as pilhas FLM foram adquiridas foram identificados realizando uma correlação 2D-2D das visões gerais da fluorescência e da grade de MEV (compare o passo 3.2).
Para cada um dos quadrados escolhidos, imagens de feixe de íons foram obtidas em baixa corrente (10 pA, aumento de 1200x), e as posições fiduciais correspondentes foram registradas em 3DCT. Após a seleção das posições com a característica biológica de interesse e ajuste de sua posição 3D dentro da pilha FLM, a transformação encontrada foi aplicada às posições END putativas, e os locais para preparação da lamela foram selecionados (Figura 6B). Uma viga FIB inclinada de 11° em relação à superfície da grade foi usada nos exemplos mostrados aqui (45° FIB shuttle pré-tilt; 18° stage tilt). As posições de interesse foram transferidas, e os padrões de FIB foram desenhados manualmente (Figura 6D) medindo a distância das posições previstas em relação aos pontos proeminentes na imagem FIB (por exemplo, furos, contaminações por gelo, contas fiduciais). A precisão do registro foi avaliada deixando deliberadamente de fora esferas que pudessem ser claramente identificadas na imagem FLM e IB e, em seguida, comparando suas posições reais e previstas na visão do feixe de íons (por exemplo, diamante na Figura 6B,C). A correlação para o quadrado mostrado na Figura 6C mostrou-se precisa (ou seja, a posição prevista das posições das contas FLM coincidiu perfeitamente com sua localização IB correspondente e os valores RMSE subpixel relatados pelo 3DCT para o registro). Assim, as lamelas foram cortadas nas posições preditas (Sítio B) e moídas finamente até uma espessura de ~200 nm (deslocamento padrão final).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos para direcionamento correlativo 3D de depósitos de proteínas endocíticas (END) em leveduras. (A) Visão geral da rede antes da fresagem. As caixas coloridas indicam quadrados de grade para os quais as pilhas de fluorescência foram tomadas de antemão. (B-C) Correlação 3D em um quadrado de grade. Após o registro de várias esferas fiduciais correspondentes (caixas coloridas) nos dados de FLM (B, mostrado aqui como projeção de intensidade máxima) e na imagem do feixe de íons (C), a precisão do registro 3D foi verificada prevendo a posição do talão indicado com o diamante. Em seguida, as posições do sinal alvo (círculos vermelhos) foram previstas no corte do feixe de íons para dois potenciais locais de fresagem. (D) Zoom do Sítio B mostrando as posições previstas de três pontos alvo (círculos vermelhos) e os padrões iniciais de fresagem (caixas amarelas). Um quarto ponto de fluorescência foi previsto para ser muito mais baixo do que o outro ponto e, portanto, não visado durante a fresagem (círculo cinza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Após a moagem FIB bem sucedida e a transferência da grade para o microscópio eletrônico de criotransmissão (Titan Krios operado a 300 kV e equipado com um detector de elétrons direto Gatan K2 e filtro de energia Bioquantum), uma visão geral da grade foi registrada no SerialEM e usada para localizar quadrados com lamelas. Para cada lamela, imagens panorâmicas foram adquiridas, e os dados de FLM foram registrados em 3DCT (3D-2D) usando esferas fiduciais correspondentes. As posições das características biológicas de interesse (Figura 7A) foram então previstas usando a transformação calculada a partir das esferas fiduciais. Visões gerais de lamelas registradas em maior ampliação foram costuradas, e locais de interesse correlacionados usando pontos de referência claramente visíveis (por exemplo, contas fiduciais). Alternativamente, visões clássicas do CLEM podem ser produzidas em vários softwares10,12.
Com base na correlação, foram encontrados quatro sítios potenciais para aquisição do tomograma para a lamela mostrada na Figura 7A. No entanto, isso também inclui uma posição que não foi alvo durante a moagem FIB correlacionada em 3D (compare a Figura 6D; círculo cinza) e uma posição bloqueada por contaminação por gelo (Figura 7; caixas cinzas). Assim, os tomogramas só puderam ser registrados para duas posições (Figura 7B). No geral, obteve-se um sucesso de correlação de ~75%, ou seja, lamelas que sobreviveram à transferência para as estruturas TEM e END nos locais previstos, foi alcançado (12 sítios correlacionados). Após a reconstrução do tomograma, segmentação e correspondência de moldes, estruturas END individuais podem ser visualizadas dentro de seu contexto nativo (Figura 7C,D). Isso inclui o retículo endoplasmático (RE) fenestracionado ao redor da END, gotículas lipídicas ocasionalmente fazendo contato e ribossomos, que são excluídos do compartimento LLPS. Em conjunto, isso mostra como a moagem de FIB correlativo 3D pode fornecer informações em nível molecular de processos biológicos raros de células intactas.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> Figura 7: Resultados representativos para visualização da END com crio-TE. (A) A visão geral do ETM de baixa magnificação do local de moagem mostrada na Figura 6 pode ser prontamente correlacionada com a projeção de intensidade máxima da FLM (Figura 6B) para localizar características biológicas de interesse (cruzes vermelhas). (B) Em uma segunda etapa, pode-se correlacionar uma visão de maior ampliação (costurada) e configurar posições para aquisição do tomograma (caixas amarelas). Os locais resultantes do sinal fora do plano (caixa cinza, compare a Figura 6D) foram ignorados. (C-D) Usando esta abordagem FIB correlativa 3D, o depósito de proteína endocítica (END) pode ser visualizado em seu ambiente nativo. Estruturas como retículo endoplasmático (RE), ribossomos, membranas e gotículas lipídicas podem ser identificadas e visualizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Configurações do Plasma Cleaner</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG :</td>
			<td colspan="3">Seleção de radiofrequência: "HI", 30 s; Plasma N2</td>
		</tr><tr><td>Configurações do êmbolo</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">100% de umidade; força de mancha = 8; blottime = 10 s; tempo de espera 0 s; (isso deve funcionar para a maioria das células de suspensão e aderentes)</td>
		</tr><tr><td>Posições e Timings SIG FIB</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">Inclinação = 0, Rotação = -180, Posição Z = 13,5, Setpoint de temperatura = 26,15° , Tempo = 8 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">Inclinação = 0, Rotação = -180, Posição Z = 9,8, Setpoint de temperatura = 28° C, Tempo = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">Posição pré-definida pelo software, Setpoint de temperatura = 28°, Tempo = 7 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">Posição pré-definida pelo software, Setpoint de temperatura = 28°, Tempo = 7 s</td>
		</tr><tr><td>FIB Sputter Coater Configurações</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Sistema de quorum:</td>
			<td colspan="3">Na câmara de preparação do quorum: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr><tr><td>Aquisição da Tomogram</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Titã Krios Gi2</td>
			<td colspan="3">Câmera K2, filtro de energia Gatan Bioquantum</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eV de fenda; esquema de inclinação simétrica da dose (Hagen) com passos de 2°; Comece em +10° (pré-inclinação da lamela!) até +70° e -50°</td>
		</tr><tr><td>Titã Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Falcão 4; Filtro de energia Selectris X</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eV de fenda; esquema de inclinação simétrica da dose (Hagen) com passos de 2°; Comece em +10° (pré-inclinação da lamela!) até +70° e -50°</td>
		</tr><tr><td>Aquisição da FLM</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Corrsight (Modo Confocal)</td>
			<td colspan="3">Objetivo: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol; Parâmetros de aquisição da pilha: tamanho do pixel x-y = 161,25 nm, tamanho do passo z = 300 nm.</td>
		</tr><tr><td>Leica SP8 Crio-Confocal</td>
			<td colspan="3">Objetivo: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Parâmetros de aquisição da pilha: tamanho do pixel x-y = 84 nm, tamanho do passo z = 300 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista de equipamentos testados e configurações sugeridas.

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Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Aqui, apresentamos um pipeline para fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D na orientação da preparação de amostras celulares para tomografia crio-eletrônica. A posição 3D das proteínas fluorescentemente marcadas de interesse é primeiramente determinada por microscopia de criofluorescência e, em seguida, direcionada para moagem. O protocolo é adequado para células de mamíferos, leveduras e bactérias.

Preparação de amostras por fresagem de feixe de íons com foco correlativo 3D para tomografia crioeletrônica de alta resolução

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

A fresagem FIB correlativa 3D torna eventos celulares específicos e até raros acessíveis ao Cryo-TEM. Permitindo a revelação da ultra estrutura deste evento diretamente dentro do ambiente nativo. O fluxo de trabalho correlativo melhora a taxa de sucesso de atingir estruturas celulares raras e ajuda a identificá-las inequivocamente no ambiente celular lotado.Quem demonstrará o procedimento serão Anna Bieber e Christina Capitanio, especialistas em tomografia crioeletrônica correlativa. Comece a microscopia de criofluorescência das grades semeadas de células, adquirindo uma ampla visão geral de campo em modo fluorescência e refletido. Em seguida, selecione quadrados de grade adequados com sinal de fluorescência.Depois de garantir que as células e contas estejam uniformemente distribuídas em direção ao centro de cada quadrado, escolha os quadrados em 200 grades de malha que sejam acessíveis tanto ao instrumento FIB-SEM quanto ao instrumento MET, e estejam a pelo menos três quadrados de distância da borda da grade. Em cada um dos quadrados de grade selecionados, adquira uma pilha fluorescente com uma etapa focada apropriada. Objetivas de alta abertura numérica devem ser usadas para aumentar a contagem de fótons e a precisão de localização.Em um microscópio confocal com objetiva de abertura numérica 0,9, adquira pilhas com tamanho de passo de 300 nanômetros e superapele o valor de Nyquist. Registre várias pilhas de cores e armazene grades sob nitrogênio líquido até uso posterior. Use as marcas de recorte ou de orientação para garantir a orientação adequada da grade para posterior colocação no TEM.Carregue as grades no instrumento cryo FIB-SEM. Certifique-se de que a direção da fresagem seja perpendicular ao eixo de inclinação do MET. Para revestir as grades com uma camada organometálica protetora, use um codificador de plasma e um sistema de injeção de gás nas posições de estágio pré-definidas pela configuração FIB-MEV.Em seguida, registre a visão geral da grade do SEM e execute uma correlação 2D com as visões gerais do FLM. Encontre os quadrados de grade inspecionando manualmente as visões gerais de grade gravadas ou usando um pacote de software. Selecione e marque quatro posições correspondentes para os quadrados na visão geral da grade FLM e SEM e calcule a transformação entre os pontos marcados para correlação FLM-MEV.Em seguida, coloque os marcadores no centro dos quadrados de grade correspondentes para os quais as pilhas FLM foram adquiridas antes de prever sua posição na visualização MEV. Para cada quadrado de grade correlacionado, pegue uma imagem de feixe de íons de baixa corrente no ângulo de fresagem FIB de escolha e selecione um campo de visão com a posição e ampliação desejadas que correspondam aos dados de fluorescência. Para 200 grades de malha, adquira dados FIB-SEM para conter quadrados de grade única, incluindo as barras de grade.Em seguida, pegue uma imagem de MEV do mesmo quadrado para ajudar na identificação das esferas correspondentes na visão de fluorescência e feixe de íons. Execute o registro da pilha FLM 3D bruta ou desconvolizada e da visualização do feixe de íons 2D para cada posição com a caixa de ferramentas de correlação 3D, 3D CT, carregando a pilha FLM 3D fatiada correspondente e a visualização do feixe de íons em 3D CT.In os dados de fluorescência, selecione quatro contas fiduciais e clique com o botão direito do mouse na lista de posições para determinar a posição 3D das contas via encaixe gaussiano do sinal em X, Y e Z.Em seguida, selecione as contas correspondentes na imagem do feixe de íons para realizar uma correlação 3D inicial. Da mesma forma, adicione mais contas ao registro para verificar a precisão da correlação.Deixe de fora algumas esferas fiduciais claramente identificáveis tanto na fluorescência quanto no feixe de íons, verificando sua localização prevista versus real na imagem do feixe de íons. Na TC 3D, os valores de root mean square error, ou RMSE, podem ser visualizados para avaliar a consistência da correlação. Verifique se os valores RMSE são pequenos e na ordem de precisão de localização.Em seguida, selecione os sinais celulares de destino e ajuste a posição 3D na pilha FLM antes de aplicar a transformação para prever as posições do alvo na visualização do feixe de íons. Para cada quadrado correlacionado, transfira as posições previstas das características de interesse para o instrumento FIB-MEV para colocar os padrões de moagem de lamelas. Se houver vários sinais por célula, coloque os padrões para incluir o máximo possível de pontos de interesse na mesma lamela.Moinho áspero das lamelas seguido de moagem fina para obter uma espessura final de 150 a 250 nanômetros. Certifique-se de que a orientação da lamela seja perpendicular ao eixo de inclinação ao carregar as grades no microscópio eletrônico de transmissão. Adquira montagem de grade e visões gerais para cada quadrado de grade contendo lamelas com ampliação e tempo de exposição adequados para visualizar as esferas fiduciais nas imagens de MET sem aumentar significativamente a dose total de elétrons.Adquira mapas TEM de alta resolução de cada lamela. Registre e correlacione em 3D-2D a pilha FLM com o quadrado da grade TEM e as visões gerais da lamela em TC 3D. Realizar correlação entre FLM e ETM de baixa a alta magnificação em MET. Após a transferência das posições, set-up e série de inclinação de corrida em posições correlacionadas, utilizar uma magnificação, desfocagem e dose total apropriadas para iniciar a aquisição da imagem na pré-inclinação determinada pela lamela usando um esquema de inclinação simétrica de dose.Acompanhe a aquisição manual ou em lote das imagens. Na análise representativa, a visão geral do ETM de baixa magnificação do local de moagem é mostrada para localizar características biológicas de interesse. Posteriormente, correlacionou-se uma maior magnificação com a projeção da intensidade máxima da FLM e foram estabelecidas posições para aquisição do tomograma.Nas imagens adquiridas, o depósito proteico endocítico pôde ser visualizado em seu ambiente nativo. A otimização da amostra é muito importante. A preparação da grade deve ser otimizada para ter uma boa distribuição de células para moagem e um bom número de contas fiduciais visíveis na maioria dos quadrados da grade.A fresagem correlativa 3D ajudou a revelar a ultraestrutura de diferentes processos celulares, como a progressão passo a passo da autofagia em cada célula, e é usada para capturar um novo compartimento separado de fase.

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