Name: sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

BT altyapısını desteklediği için Inga Wolf'a, hesaplama desteği için Florian Beck'e ve makalenin eleştirel okuması için Oda H. Schiøtz'a teşekkür ederiz. Finansman kısmen Alexander von Humboldt'un Philipp S. Erdmann'a geri dönenler bursu ve Florian Wilfling'e EMBO Uzun Vadeli Bursu ALTF 764-2014 aracılığıyla sağlandı. Anna Bieber, Boehringer Ingelheim Fonds Ph.D. bursu tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+tomography:+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail.">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li><li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins.">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li><li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+&#197;+in+cells.">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 &#197; in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li><li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-correlative+light+and+electron+microscopy+workflow+for+cryo-focused+ion+beam+milled+adherent+cells.">Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells.</a> Methods in Cell Biology. 162, 273-302 (2021).</li><li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies.">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li><li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy.">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits.">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li><li>. Scientific volume imaging, Nyquist calculator Available from: <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icy:+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research.">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li><li>. 3DCT Available from: <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021)</li><li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows.">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745 (2021).</li><li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae.">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0 (2019).</li><li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology.">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).</li><li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling.">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033 (2020).</li><li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography.">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286 (2020).</li><li>. tools3dct Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021)</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements.">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li><li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CorRelator:+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy.">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709 (2021).</li><li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging.">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li><li>B&#228;uerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions.">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li><li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies.">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions.">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li><li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-crinkling:+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature.">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li><li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images.">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li><li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIE-scope,+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB/SEM+microscopy.">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li><li>. Delmic METEOR Available from: <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021)</li><li>. iFLM Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021)</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association.">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li><li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging.">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714 (2021).</li><li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms.">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li><li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue.">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li><li>Wu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells.">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context.">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017 (2015).</li><li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision.">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li><li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins.">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

1. Protokoldeki kritik adımlar
Hücre kültürü ve ızgara daldırma parametrelerinin optimizasyonu bu iş akışı için esastır. Bir projenin başlangıcında, etiketleme stratejilerini, hücrelerin ve referans boncuklarının dağılımını optimize etmek ve farklı ızgara hazırlama ve lekeleme parametrelerini test etmek için zaman ayırmaya değer. Optimum şekilde daldırılarak dondurulan bir numuneyle çalışmak, sonraki işlemleri önemli ölçüde kolaylaştıracaktır.
Herhangi bir TEM deneyinde olduğu gibi, vitreus örnekleri gereklidir. HeLa gibi büyük memeli hücreleri için, ızgara karesi başına 1-2 hücre tercih edilir, ancak hücreler yine de daha yüksek yoğunlukta camsı olabilir. İsteğe bağlı olarak, memeli hücrelerinde (örneğin, HEK293, HeLa) vitrifikasyon,23 daldırmadan 10 dakika önce kültür ortamına eklenen %2.5-10 (h/h) gliserol ile inkübe edilerek iyileştirilebilir. Mümkünse, hücrelerin mükemmel yerleşimini ve dağılımını sağlamak için ızgara deseni kullanılabilir, böylece vitrifikasyonu ve daha sonra korelasyonu iyileştirir24.
İş akışı sırasında belirli hücreler seçilebilse de, ilgilenilen biyolojik özelliği gösteren çok az sayıda hücre genel verimi önemli ölçüde azaltacaktır. POI pozitif hücrelerde korelasyonu geliştirmek için yeterince parlak floroforlar kullanılmalıdır. Bu özellikle endojen ekspresyon seviyelerinde önemlidir. Kriyo koşulları altında, mVenüs'ün artan parlaklığı 25 ve kriyokoşulları 26 altında standart GFP filtre kurulumları için uygun olmasını sağlayan hipsokromik kayması nedeniyle genellikle EGFP'den daha iyi performans gösterdiğini bulduk. Nokta benzeri olmayan hedef yapılar için, dalga boyu ve lokalizasyon doğruluğu (Abbe kırınım sınırı) arasındaki değiş tokuş da dikkate alınmalıdır.
Verimli 3D korelasyon ayrıca ızgaraların mekanik olarak kararlı olmasını ve büyük bir özenle ele alınmasını gerektirir. Karbon destekli standart altın veya bakır ızgaralar kullanılabilirken, projeye bağlı olarak daha sert SiO2 filmler kullanılarak başarı oranı önemli ölçüde artırılabilir. Bununla birlikte, (a) mekanik stabilitenin veya (b) kriyo-kırışıklığı27 azaltmak için eşleşen termal genleşme katsayılarının (substrat ve film) başarılı 3D korelasyonu için en önemli faktör olup olmadığı henüz kesin olarak belirlenmemiştir. Ayrıca, kırılgan Au ızgaralarını toplamak için polidimetilsiloksan kaplı kaplar kullanılabilir5.
Numune stabilitesini sağlamanın yanı sıra, FIB frezeleme sırasında optimum hedefleme için uygun olan yüksek kaliteli floresan yığınları elde etmek için FLM görüntüleme parametrelerinin dikkatli bir şekilde seçilmesi gerekir. Bu bağlamda, FLM verileri üzerinde farklı gürültü giderme28 veya evrişim giderme tekniklerinin test edilmesi de tavsiye edilir, çünkü bu, referansların ve hücresel sinyallerin lokalizasyonunu önemli ölçüde iyileştirebilir. Floresan sinyalini FIB-SEM görüntüleriyle ilişkilendirirken, referans boncuklarının iyi bir örneklemesi önemlidir. Hücrelerin etrafına ve muhtemelen farklı z yüksekliklerinde iyi dağılmış olmalıdırlar. Ayrıca, kasıtlı olarak referans modelinin dışında bırakılan ancak gözle açıkça ilişkilendirilebilen boncukların tahmin edilen ve gerçek konumlarını kontrol ederek korelasyonun tutarlılığını doğrulamak da iyi bir uygulamadır. Kayıt tutarlılığını kontrol etmek için 3DCT'nin RMSE değerleri de her zaman dikkate alınmalıdır.
Öğütülmüş malzemenin ve artık suyun FIB-SEM odasından birikmesi (yani yeniden kontaminasyon), her iki tarafına amorf malzeme ekleyerek etkili lamel kalınlığını artırdığından, ince öğütülmüş lamellerin mikroskopta uzun süre tutulması, ek elektron saçılma olayları nedeniyle genellikle TEM veri kalitesini düşürür. Buna göre, frezeleme çoğunlukla iki aşamalı bir şekilde gerçekleştirilir: ilk olarak, tüm pozisyonlar kabaca (yani yaklaşık 800 nm'ye kadar) ve daha sonra ince bir şekilde (~150-250 nm'ye kadar) frezelenir ve son lamel tamamlandıktan hemen sonra ızgara boşaltılır. Bununla birlikte, daha iyi korelasyon başarısı, ilgilenilen pozisyonların saha bazında işlenmesiyle elde edilebilir, bu nedenle aynı lamel üzerinde doğrudan birbiri ardına kaba ve ince frezeleme yapılır, çünkü bu, bükülme veya deformasyon için zaman bırakmaz. Ancak bu, sistemin yeniden kirlenme oranına bağlı olarak ızgara başına üretilebilecek maksimum lamel sayısını azaltır. 20 nm/s hız için 1-1,5 saat içinde 4-6 lamel üretilir.
Tüm ızgaranın veya kaba öğütülmüş lamellerin >300 nm) hareketi, zayıf veya başarısız korelasyona neden olacaktır (ayrıca aşağıda tartışılan sınırlamalara bakınız). Bu nedenle, örneğin FIB frezeleme öncesinde, sırasında ve sonrasında IB görüntüleri karşılaştırılarak düzenli olarak kontrol edilmelidir. Önemli hareket (>300 nm) gösteren siteler atılmalıdır. Bu hareketlerden kaçınmak için numune hazırlamayı (yani, ızgara tipi, hücre yoğunluğu ve dalma parametrelerinin seçimi; protokol bölüm 1'e bakın) ve frezeleme stratejisini optimize edin. Lamel bükülmesi, adım 3.6'da açıklandığı gibi saha bazında frezeleme ve lamel genişliğinin azaltılması ile önemli ölçüde azaltılabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, gerilim giderici kesimler15 lamel bükülmesini azaltmak için tasarlanmış olsa da, genellikle ayrılmış lamelin uyumlu bir hareketine neden olur ve böylece korelasyonu etkili bir şekilde önler. Bu sorunu çözmek için entegre FLM sistemleri kullanılabilir.
2. Yöntemin değiştirilmesi ve sorun giderme
Kriyo koşullarına gitmeden önce canlı hücre görüntülemede numunenin kapsamlı bir karakterizasyonunun yapılması şiddetle tavsiye edilir. Hücresel numuneleri, tedavi şemalarını optimize etmek ve kriyo iş akışına girmeden önce ne tür bir sinyal bekleneceğini bilmek, başarı oranını önemli ölçüde artırabilir.
Burada sunulan iş akışında, numuneleri görüntülemek için kriyo aşamalı bağımsız bir floresan mikroskobu kullanılır, ardından ızgaralar odaklanmış iyon ışını mikroskobuna aktarılır. Bununla birlikte, FIB-SEM odasına bir floresan mikroskobunun entegre edildiği sistemlerde test edilmiştir ve bu nedenle floresan görüntülerielde etmek için numune transferi gerekmez 29,30,31. Bu tür entegre sistemler kullanılarak, son lamelleri kirletme riskini artırmadan hedef floresan sinyalinin varlığını kontrol etmek için FIB frezeleme sırasında ve sonrasında ilgilenilen konumlar görüntülenebilir. Bununla birlikte, kullanılan mikroskopların optik parametrelerini akılda tutmak önemlidir, çünkü örneğin, düşük bir NA objektifi, referans boncuklarının ve hedef sinyallerin lokalize edilebileceği hassasiyeti sınırlayacaktır. Bununla birlikte, FLM yığınları sürekli olarak güncellenebildiğinden ve güncel SEM ve IB görünümleriyle karşılaştırılabildiğinden, entegre FLM kurulumları, ızgaraların ve lamellerin hafif deformasyonlarıyla daha iyi başa çıkmaya yardımcı olacaktır.
FIB frezeleme ve TEM veri toplama arasındaki lamelin floresan görüntülemesine alternatif olarak, lamellerin doğru yerleştirildiğini ve frezelendiğini doğrulamak için TEM sonrası korelasyon kullanılabilir 5,6.
Bağıntılı iş akışının tüm adımlarında, ancak özellikle TEM sırasında, FIB-SEM/TEM görüntülerinde yansıtılan floresan verilerinin bir katmanının oluşturulması önerilir. Bu tür klasik CLEM görünümleri, hücrelerin hangi kısmının lamellerin içinde bulunduğunu daha sezgisel olarak anlamaya yardımcı olur. Bu aynı zamanda korelasyonun doğruluğunu doğrulamak için yararlı bir akıl sağlığı kontrolü görevi görür.
3. Yöntemin sınırlamaları
3D bağıntılı FIB yaklaşımı, referans boncuklarla sağlanabilen numuneler gerektirir. Buna göre, bu yöntem şu anda daldırmalı donmuş ızgaralarla sınırlıdır. Yüksek basınçlı (HPF) dondurulmuş (doku) numuneler için şu anda sadece 2D-2D korelasyonları gerçekleştirilebilir. Potansiyel olarak, dahili referans belirteçleri (örneğin, organeller, lekeli lipit damlacıkları) bu soruna bir çözüm olabilir32,33. Nihai korelasyon başarı oranı, numune kalitesi, floresan mikroskobu kurulumu, lamel kalınlığı ve hedeflenen yapının boyutu dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Açıklanan 3D kayıt yaklaşımını kullanan korelasyon doğruluğunun, nihai IB görüntüsünde 200-300 nm aralığında olduğu tahmin edilmektedir, bu da kabaca FIB ile öğütülmüş lamellerin tipik kalınlığınakarşılık gelir 7. Buna göre, bundan çok daha küçük hücresel yapıların şu anda hedeflenmesi zor olacaktır. Ek olarak, frezeleme sahasındaki aşırı hareket (>300 nm), FIB/SEM cihazlarına entegre FLM kurulumlarıyla potansiyel olarak ele alınabilecek bir sorun olan korelasyonun doğruluğunu da azaltır. Frezeleme sırasında güçlü deformasyon veya bükülme gösteren lameller, her durumda, sonraki iş akışından hariç tutulmalıdır.
Genel olarak, kriyo-floresan görüntüleme şu anda Abbe kırınım kriteri ile sınırlıdır. Süper çözülmüş kriyo-FLM yöntemlerinin daha rutin uygulaması (ve ticarileştirilmesi) ile, özellikle anında operasyon için FIB / SEM'e entegre edildiğinde, hücresel yapıların daha doğru hedeflenmesi mümkün olabilir.
4. Yöntemin önemi
Özellikle hedefsiz ve korelasyon sonrası tekniklerle karşılaştırıldığında, 3D korelasyonlu FIB frezeleme yaklaşımı, zaman ve kaynak tüketen TEM adımından önce uygun pozisyonların seçilmesine olanak tanır. Böylece daha verimli veri toplama ve proje planlaması sağlar. Ayrıca, ilişkili floresan verileri, tomogramları yorumlamak ve kriyo-ET sonuçlarını çok ölçekli projelere entegre etmek için, özellikle yapılandırılmamış protein düzenekleri veya şablon eşleştirme ve subtomogram ortalaması için çok küçük olanlarla uğraşırken çok önemli olabilecek bir bilgi katmanı ekler.
5. Önemi ve gelecekteki potansiyel uygulamaları
HPF numunelerinden kriyo-kaldırma 34,35, kriyo-FIB-SEM hacim 36 ve süper çözünürlüklü floresan görüntüleme26,37,38,39 gibi gelişmiş iş akışlarıyla birlikte, 3D hedefli lamel hazırlama, yalnızca izole hücrelerdeki biyolojik süreçleri diseksiyon değil, aynı zamanda doku ve hasta numunelerini FIB frezeleme ve kriyo-elektron tomografisi için erişilebilir hale getirme olasılığı sunar. Bu nedenle, patolojik süreçlerin yüksek çözünürlükte diseksiyonuna izin verecek ve böylece nano ölçekte bir biyopsiye doğru ayrılmaz bir yapı taşı olacaktır.

Odaklanmış iyon ışını frezeleme, bıçak izleri ve sıkıştırma artefaktları gibi mekanik kesitlerle yaygın olarak ilişkilendirilen problemler olmadan kriyo ile sabitlenmiş numunelerden ince biyolojik numunelerin hazırlanmasına olanak tanır1. Kriyo-elektron tomografisi ile eşleştirildiğinde, FIB frezeleme, hücresel morfolojinin yüksek çözünürlüklü biyolojik çalışmalarını ve makromoleküler komplekslerin yapısının doğrudan hücrelerin içinden nanometre altı çözünürlükte 2,3,4 belirlenmesini sağlar. Ribozomlar gibi bol miktarda bulunan türler rastgele kesilmiş FIB lamellerinde kolayca bulunurken, birçok hücresel süreç birkaç kompleksin kolokalizasyonuna dayanır veya hücre içindeki belirli bölgelere lokalize edilir. Sonuç olarak, öğütme işlemi sırasında ilgilenilen biyolojik özelliği kaybetmemek ve rastgele vuruşlarla sınırlı kalmak için verimli hedefleme gereklidir. Bu nedenle, taramalı elektron mikroskobu (SEM)-FIB ve bir kriyo-floresan ışık mikroskobundan (FLM) gelen verileri birleştiren bağıntılı bir yaklaşım gereklidir. İlk korelasyonu atlamak ve FLM ve cryo-ET verilerini ancak TEM 5,6 ediniminden sonra birleştirmek mümkün olsa da, floresan kılavuzlu odaklanmış iyon ışını frezeleme, frezeleme alanının önceden doğru bir şekilde seçilmesini sağlayarak daha verimli veri toplama sağlar. Anlayışından bu yana, biyolojik çalışmalarda 3D ile ilişkili FIB öğütme uygulaması, yakın zamanda bu tekniği kullanarak mayada yeni bir sıvı-sıvı fazla ayrılmış (LLPS) bölme tanımladığımızı bildirene kadar sınırlıydı8.
Burada açıklanan, bakterilerden mayalara ve memeli hücrelerine kadar çok çeşitli örnekleri incelemek için kullanılabilen genelleştirilmiş bir 3D kriyo ile ilişkili ışık ve elektron mikroskobu (CLEM) protokolüdür. Deneyler belirli bir dizi cihaz kullanılarak gerçekleştirilirken, bireysel adımlar belirli bir donanıma bağlı değildir ve mevcut protokollerinbir uzantısı olarak diğer sistemlere kolayca aktarılabilir 3,5. Test edilen ekipmanın ve önerilen ayarların bir listesi Malzeme Tablosu ve Tablo 1'de verilmiştir. Boru hattının dört temel adımı, (1) numune hazırlama, (2) kriyo-floresan mikroskobu ile ilgilenilen özelliklerin lokalizasyonu, (3) 3D ile ilişkili odaklanmış iyon ışını öğütme ve (4) kriyo-transmisyon elektron mikroskobunda lameller üzerinde kriyo-ET veri toplama için hedeflenen yapıların lokalizasyonudur (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Autogrids</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific / Homemade</td>
			<td>1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-rings</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1036171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne COOH</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>65011</td>
			<td>recommended 1 &#181;m fiducial beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM Grids R1/4 SiO2</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-S13nAu20-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Aquilos 2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Quanta 3D FEG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB Scios</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FIB Alternative 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>Camera/Filter Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 with cryo module</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner PDC-3XG</td>
			<td>Harrick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Sheet (0.25 mm)</td>
			<td>plastx24.de</td>
			<td>11645</td>
			<td>Cut to same dimensions as filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>TEM Alternative 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Imager&#160; EM Cryo CLEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>FLM Alternative 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>alternativevly, use manaual plunger</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10311807</td>
			<td>55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation by 3d-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel ultrastrüktür ve moleküler kompleksleri doğal, dondurulmuş-hidratlı hallerinde araştırmak için tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, cryo-ET, numunelerin gelen elektron ışınını dağıtmayacak veya engellemeyecek kadar ince olmasını gerektirir. Kalın hücresel numuneler için bu, kriyo odaklı iyon ışını (FIB) öğütme ile elde edilebilir. Bu protokol, üç boyutlu floresan mikroskobu verilerini FIB taramalı elektron mikroskobundan gelen bilgilerle birleştiren 3D bağıntılı bir yaklaşım kullanarak FIB frezeleme sırasında belirli hücresel bölgelerin nasıl hedefleneceğini açıklar. Bu teknik kullanılarak, nadir hücresel olaylar ve yapılar yüksek doğrulukla hedeflenebilir ve kriyo-transmisyon elektron mikroskobu (kriyo-TEM) kullanılarak moleküler çözünürlükte görselleştirilebilir.

Protokol, EH alanı içeren ve endositoz proteini 1 (Ede1) bağımlı endositik protein birikintisini (END) ve otofajik cisimlerdebozunmasını ve sıkışmasını keşfetmek için kullanılan boru hattının bir incelemesini sağlar 8. END, S. cerevisiae'de sıvı-sıvı fazla ayrılmış bir bölmedir ve başarısız endositik olaylardan sonra klatrin aracılı endositozda (CME) yer alan çeşitli proteinleri tamponlar. Ana bileşenlerinden biri, bir CME bileşeni ve bu yeni LLPS bölmesinin bozulması için seçici bir otofaji reseptörü olarak ikiye katlanan Ede1'dir. Buna göre, Ede1 aşırı ekspresyonu endositozun erken aşamalarına müdahale ettiğinden ve bu nedenle yapısal olarak LLPS'yi indüklediğinden, END'leri görselleştirmek için alkol dehidrojenaz (ADH) promotörü kontrolü altında Ede1'in (EGFP-Ede1) bir EGFP füzyonu kullanıldı.
EGFP-Ede1 aşırı eksprese eden maya hücreleri ve 1 μm referans belirteçleri ile daldırmada donmuş bir ızgarada, GFP kanalında FLM yığını alımı için beş konum seçildi (Şekil 6A; TFS Görüşü; konfokal mod, 300 nm odak adımı boyutu, 10 μm aralığı). Izgara, FIB cihazına (Quanta 3D FEG) aktarıldı ve FLM yığınlarının elde edildiği ızgara kareleri, floresan ve SEM ızgara genel bakışlarının 2D-2D korelasyonu gerçekleştirilerek tanımlandı (adım 3.2'yi karşılaştırın).
Seçilen karelerin her biri için, iyon ışını görüntüleri düşük bir akımda (10 pA, 1200x büyütme) alındı ve karşılık gelen referans konumları 3DCT'de kaydedildi. İlgilenilen biyolojik özelliğe sahip konumların seçilmesinden ve FLM yığını içindeki 3 boyutlu konumlarına yerleştirilmesinden sonra, bulunan dönüşüm varsayılan END konumlarına uygulandı ve lamel hazırlama alanları seçildi (Şekil 6B). Burada gösterilen örneklerde ızgara yüzeyine göre 11° eğimli bir FIB kirişi kullanılmıştır (45° FIB mekik ön eğimi; 18° kademe eğimi). İlgilenilen pozisyonlar aktarıldı ve FIB desenleri, FIB görüntüsündeki belirgin yer işaretlerine (örneğin, delikler, buz kirlilikleri, referans boncukları) göre tahmin edilen konumların mesafesi ölçülerek manuel olarak çizildi (Şekil 6D). Kaydın doğruluğu, FLM ve IB görüntüsünde açıkça tanımlanabilen boncukların kasıtlı olarak dışarıda bırakılması ve ardından iyon ışını görünümünde gerçek ve tahmin edilen konumlarının karşılaştırılmasıyla değerlendirildi (örneğin, Şekil 6B, C'deki elmas). Şekil 6C'de gösterilen karenin korelasyonunun doğru olduğu bulundu (yani, FLM boncuk konumlarının tahmin edilen konumu, karşılık gelen IB konumları ve kayıt için 3DCT tarafından bildirilen alt piksel RMSE değerleri ile mükemmel bir şekilde çakıştı). Böylece, lameller tahmin edilen konumlarda (B Bölgesi) kesildi ve ~200 nm kalınlığa kadar ince frezelendi (son model ofseti).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg"> Şekil 6: Mayadaki endositik protein birikintilerinin (END) 3D bağıntılı hedeflemesi için temsili sonuçlar. (A) Frezelemeden önce ızgaraya SEM genel bakışı. Renkli kutular, floresan yığınlarının önceden alındığı ızgara karelerini gösterir. (B-C) Bir ızgara karede 3B korelasyon. FLM verilerine (B, burada maksimum yoğunluk projeksiyonu olarak gösterilmiştir) ve iyon ışını görüntüsüne (C) karşılık gelen birkaç referans boncuğu (renkli kutular) kaydettikten sonra, 3D kaydın doğruluğu, elmasla gösterilen boncuğun konumu tahmin edilerek doğrulandı. Daha sonra, iki potansiyel öğütme sahası için iyon ışını görünümünde hedef sinyalin konumları (kırmızı daireler) tahmin edildi. (D) Üç hedef noktanın (kırmızı daireler) ve ilk frezeleme modellerinin (sarı kutular) tahmin edilen konumlarını gösteren B Sahasının yakınlaştırılması. Dördüncü bir floresan punktumun diğer punktadan çok daha düşük olduğu ve bu nedenle frezeleme sırasında hedeflenmediği tahmin edildi (gri daire). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Başarılı bir FIB frezelemesi ve ızgaranın kriyo-transmisyon elektron mikroskobuna aktarılmasından sonra (Titan Krios 300 kV'da çalıştırıldı ve bir Gatan K2 doğrudan elektron dedektörü ve Bioquantum enerji filtresi ile donatıldı), SerialEM'de bir ızgaraya genel bakış kaydedildi ve lamelli kareleri bulmak için kullanıldı. Her lamel için genel bakış görüntüleri elde edildi ve FLM verileri, karşılık gelen referans boncukları kullanılarak 3DCT'ye (3D-2D) kaydedildi. İlgilenilen biyolojik özelliklerin konumları (Şekil 7A) daha sonra referans boncuklarından hesaplanan dönüşüm kullanılarak tahmin edildi. Daha yüksek büyütme oranlarında kaydedilen lamel görünümleri dikildi ve ilgi çekici yerler açıkça görülebilen yer işaretleri (örneğin, referans boncukları) kullanılarak ilişkilendirildi. Alternatif olarak, klasik CLEM genel bakışları çeşitli yazılımlarda üretilebilir10,12.
Korelasyona dayanarak, Şekil 7A'da gösterilen lamel için tomogram edinimi için dört potansiyel bölge bulundu. Bununla birlikte, bu aynı zamanda 3D ile ilişkili FIB-frezeleme sırasında hedeflenmeyen bir konumu (Şekil 6D; gri daireyi karşılaştırın) ve buz kirliliği tarafından engellenen bir konumu (Şekil 7; gri kutular) içerir. Buna göre, tomogramlar sadece iki pozisyon için kaydedilebilirdi (Şekil 7B). Genel olarak, ~%75'lik bir korelasyon başarısı, yani TEM ve END yapılarına transferden kurtulan lameller tahmin edilen bölgelerde bulundu (12 ilişkili bölge). Tomogram rekonstrüksiyonu, segmentasyon ve şablon eşleştirmeden sonra, bireysel END yapıları kendi doğal bağlamları içinde görselleştirilebilir (Şekil 7C,D). Bu, END'i çevreleyen fenestrat endoplazmik retikulumu (ER), ara sıra temas eden lipid damlacıklarını ve LLPS bölmesinden çıkarılan ribozomları içerir. Birlikte ele alındığında, bu, 3D bağıntılı FIB frezelemenin, bozulmamış hücrelerden nadir biyolojik süreçlerin moleküler düzeyde bilgisini nasıl sağlayabileceğini gösterir.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg"> Şekil 7: END'i cryo-ET ile görselleştirmek için temsili sonuçlar. (A) Şekil 6'da gösterilen öğütme sahasının düşük büyütmeli TEM genel görünümü, ilgilenilen biyolojik özellikleri (kırmızı çarpılar) lokalize etmek için FLM maksimum yoğunluk projeksiyonu (Şekil 6B) ile kolayca ilişkilendirilebilir. (B) İkinci adımda, daha yüksek büyütmeli (dikişli) bir görünüm ilişkilendirilebilir ve tomogram alımı için konumlar (sarı kutular) ayarlanır. Düzlem dışı sinyalden kaynaklanan konumlar (gri kutu, Şekil 6D'yi karşılaştırın) göz ardı edildi. (C-D) Bu 3D bağıntılı FIB yaklaşımını kullanarak, endositik protein birikimi (END) doğal ortamında görselleştirilebilir. Endoplazmik retikulum (ER), ribozomlar, zarlar ve lipid damlacıkları gibi yapılar tanımlanabilir ve görselleştirilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plazma Temizleyici Ayarları</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Harrick Plazma Temizleyici PDG-3XG:</td>
			<td colspan="3">Radyo Frekansı ayarı: "HI", 30 s; N2 plazma</td>
		</tr><tr><td>Piston Ayarları</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">% 100 nem; leke kuvveti = 8; lekelenme süresi = 10 sn; bekleme süresi 0 sn; (bu, çoğu süspansiyon ve yapışkan hücre için çalışmalıdır)</td>
		</tr><tr><td>FIB CBS Pozisyonları ve Zamanlamaları</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">Eğim = 0, Dönüş = -180, Z konumu = 13.5, Sıcaklık ayar noktası = 26.15° , Zaman = 8 sn</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">Eğim = 0, Döndürme = -180, Z konumu = 9,8, Sıcaklık ayar noktası =28°C, Süre = 7 sn</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">Yazılım önceden tanımlanmış konum, Sıcaklık ayar noktası = 28° , Zaman = 7 sn</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">Yazılım önceden tanımlanmış konum, Sıcaklık ayar noktası = 28°, Süre = 7 sn</td>
		</tr><tr><td>FIB Püskürtme Kaplayıcı Ayarları</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Çekirdek Sistemi:</td>
			<td colspan="3">Çekirdek hazırlık odasında: 10 mA, 40 s</td>
		</tr><tr><td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 sn</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 sn</td>
		</tr><tr><td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1kV, 10 mA, 10 Pa, 15 sn</td>
		</tr><tr><td>Tomogram Alımı</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi2</td>
			<td colspan="3">K2 kamera, Gatan Bioquantum enerji filtresi</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">20 eV yarık; 2 ° adımlarla doz simetrik eğim şeması (Hagen); +10°'den (lamel ön eğim!) +70° ve -50°'ye kadar başlayın</td>
		</tr><tr><td>Titan Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Şahin 4; Selectris X enerji filtresi</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">10 eV yarık; 2 ° adımlarla doz simetrik eğim şeması (Hagen); +10°'den (lamel ön eğim!) +70° ve -50°'ye kadar başlayın</td>
		</tr><tr><td>FLM Satın Alma</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Corrsight (Konfokal Mod)</td>
			<td colspan="3">Amaç: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; Yığın toplama parametreleri: xy piksel boyutu = 161.25 nm, z adım boyutu = 300 nm.</td>
		</tr><tr><td>Leica SP8 Kriyo-Konfokal</td>
			<td colspan="3">Amaç: Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM; Yığın toplama parametreleri: xy piksel boyutu = 84 nm, z adım boyutu = 300 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Test edilen ekipmanların ve önerilen ayarların listesi.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography at JoVE.com

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

3D bağıntılı FIB frezeleme, spesifik ve hatta nadir hücresel olayları Cryo-TEM için erişilebilir hale getirir. Bu olayın ultra yapısının doğrudan yerel ortamda açığa çıkmasına izin vermek. Bağıntılı iş akışı, nadir hücresel yapıları hedeflemenin başarı oranını artırır ve kalabalık hücresel ortamda bunların açık bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olur.Prosedürü gösteren, korelasyon kriyo-elektron tomografisinde uzman olan Anna Bieber ve Christina Capitanio olacak. Floresan ve yansıyan "modunda geniş bir alan genel bakışı elde ederek hücre tohumlu ızgaraların kriyo-floresan mikroskobuna başlayın. Ardından, floresan sinyalli uygun ızgara karelerini seçin.Hücrelerin ve boncukların her karenin merkezine doğru eşit olarak dağıldığından emin olduktan sonra, hem FIB-SEM hem de TEM cihazı tarafından erişilebilen ve ızgara kenarından en az üç kare uzakta olan 200 gözenekli ızgaradaki kareleri seçin. Seçilen ızgara karelerinin her birinde, uygun bir odaklanmış adıma sahip bir floresan yığını elde edin. Foton sayısını ve lokalizasyon doğruluğunu artırmak için yüksek sayısal açıklık hedefleri kullanılmalıdır.Sayısal açıklığı 0.9 objektif olan konfokal bir mikroskopta, 300 nanometre adım boyutuna sahip yığınlar elde edin ve Nyquist değerini aşırı örnekleyin. Birden fazla renk yığını kaydedin ve ızgaraları daha fazla kullanana kadar sıvı nitrojen altında saklayın. Daha sonra TEM'e yerleştirmek üzere ızgaranın doğru şekilde yönlendirilmesini sağlamak için kesme veya yönlendirme işaretlerini kullanın.Izgaraları kriyo FIB-SEM cihazına yükleyin. Frezeleme yönünün TEM'in eğim eksenine dik olduğundan emin olun. Izgaraları koruyucu bir organometalik tabaka ile kaplamak için, FIB-SEM kurulumu tarafından önceden tanımlanmış aşama konumlarında bir plazma kodlayıcı ve gaz enjeksiyon sistemi kullanın.Ardından, SEM ızgarasına genel bakışı kaydedin ve FLM genel bakışlarıyla bir 2B korelasyon gerçekleştirin. Kayıtlı ızgara genel bakışlarını manuel olarak inceleyerek veya bir yazılım paketi kullanarak ızgara karelerini bulun. FLM ve SEM ızgara genel görünümündeki kareler için karşılık gelen dört konumu seçin ve işaretleyin ve FLM-SEM korelasyonu için işaretli noktalar arasındaki dönüşümü hesaplayın.Ardından, işaretçileri, SEM görünümündeki konumlarını tahmin etmeden önce FLM yığınlarının alındığı ilgili ızgara karelerinin ortasına yerleştirin. Her ilişkili ızgara karesi için, tercih edilen FIB frezeleme açısında düşük akımlı bir iyon ışını görüntüsü alın ve floresan verileriyle eşleşen istenen konum ve büyütmeye sahip bir görüş alanı seçin. 200 kafes ızgarası için, ızgara çubukları da dahil olmak üzere tek ızgara kareleri içerecek şekilde FIB-SEM verilerini alın.Ardından, floresan ve iyon ışını görünümünde karşılık gelen boncukların tanımlanmasına yardımcı olması için aynı karenin bir SEM görüntüsünü alın. Floresan verileri CT.In karşılık gelen yeniden dilimlenmiş 3D FLM yığınını ve iyon ışını görünümünü 3D olarak yükleyerek, 3D korelasyon araç kutusu, 3D CT ile her konum için ham veya dekonvoled 3D FLM yığınının ve 2D iyon ışını görünümünün kaydını gerçekleştirin, dört referans boncuğu seçin ve sinyalin X'e Gauss uydurması yoluyla boncukların 3D konumunu belirlemek için konumlar listesine sağ tıklayın, Y ve Z.Ardından, ilk 3D korelasyonu gerçekleştirmek için iyon ışını görüntüsündeki ilgili boncukları seçin. Benzer şekilde, korelasyonun doğruluğunu kontrol etmek için kayda daha fazla boncuk ekleyin.İyon ışını görüntüsünde tahmin edilen ve gerçek konumlarını kontrol ederek hem floresan hem de iyon ışınında açıkça tanımlanabilen bazı referans boncuklarını dışarıda bırakın. 3D CT'de, korelasyon tutarlılığını değerlendirmek için "ortalama karekök hatası" veya RMSE değerleri görüntülenebilir. RMSE değerlerinin küçük olduğundan ve yerelleştirme doğruluğu sırasına göre olduğundan emin olun.Ardından, iyon ışını görünümünde hedef konumları tahmin etmek için dönüştürmeyi uygulamadan önce hedeflenen hücresel sinyalleri seçin ve 3B konumu FLM yığınına sığdırın. Her ilişkili kare için, lamel frezeleme modellerini yerleştirmek için ilgilenilen özelliklerin tahmin edilen konumlarını FIB-SEM cihazına aktarın. Hücre başına birden fazla sinyal varsa, desenleri aynı lameldeki mümkün olan maksimum ilgi noktalarını içerecek şekilde yerleştirin.Lamellerin kaba frezelenmesi ve ardından 150 ila 250 nanometre nihai kalınlık elde etmek için ince frezeleme. Izgaraları transmisyon elektron mikroskobuna yüklerken lamel yönünün eğim eksenine dik olduğundan emin olun. Toplam elektron dozuna önemli ölçüde katkıda bulunmadan TEM görüntülerindeki referans boncuklarını görselleştirmek için uygun büyütme ve pozlama süresine sahip lameller içeren her ızgara karesi için ızgara montajı ve genel bakışlar elde edin.Her lamelin yüksek çözünürlüklü TEM haritalarını edinin. Kayıt ve 3D-2D, FLM yığınını TEM ızgara karesi ve 3D CT'deki lamel genel bakışlarıyla ilişkilendirir. TEM'de FLM ve TEM arasında düşükten yükseğe doğru korelasyon gerçekleştirin. Konumları aktardıktan sonra, ilişkili konumlarda eğim serisini ayarlayın ve çalıştırın", ardından bir doz simetrik eğim şeması kullanarak lamel tarafından belirlenen ön eğimde görüntü alımını başlatmak için uygun bir büyütme, bulanıklaştırma ve toplam doz kullanın.Görüntülerin manuel veya toplu olarak alınmasını takip edin. Temsili analizde, öğütme sahasının düşük büyütmeli TEM'e genel bakışının, ilgilenilen biyolojik özellikleri lokalize ettiği gösterilmiştir. Daha sonra, daha yüksek bir büyütme görünümü, FLM maksimum yoğunluk projeksiyonu ile ilişkilendirildi ve tomogram alımı için pozisyonlar ayarlandı.Elde edilen görüntülerde, endositik protein birikimi doğal ortamında görselleştirilebilir. Numunenin optimizasyonu çok önemlidir. Izgara hazırlığı, öğütülecek hücrelerin iyi bir dağılımına ve çoğu ızgara karesinde çok sayıda görünür referans boncuğuna sahip olacak şekilde optimize edilmelidir.3D bağıntılı frezeleme, her hücrede otofajinin adım adım ilerlemesi gibi farklı hücresel süreçlerin ultra yapısını ortaya çıkarmaya yardımcı oldu ve yeni bir faz ayrılmış bölmeyi yakalamak için kullanıldı.

Research

JoVE Journal

Biology

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Bitki damarları ve Üç Boyutlu Yapı ve Fonksiyon Visualize&#39;a Yüksek Çözünürlüklü Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...