Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

En del af dette arbejde blev udført på Marine Biological Lab med støtte fra Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (tilskudsnummer 5600373) og en gave fra Simons Foundation.

Denne undersøgelse fik godkendelse fra Partners Institutional Review Board (protokol nr. 2018P002934). Inklusionskriteriet omfattede voksne patienter med cystisk fibrose, som gav skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen. Der var ikke noget udelukkelseskriterium. Ifølge protokollen retningslinjer, alle spyt prøver blev indsamlet fra patienter med cystisk fibrose under en planlagt ambulant besøg med deres kliniske udbyder.
1. Kunstig spyt medium forberedelse
<p class="jove_content...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

I denne undersøgelse blev der udviklet en in vitro-model for at studere hyperoxiaens virkning på lungemikrobielle samfund. Denne model, der er baseret på kunstigt spyt medium og daglig sparging af serumflasker, opretholder forhøjede iltkoncentrationer og understøtter væksten af mikrober identificeret i spyt fra pwCF.
Der er flere kritiske trin i denne tilgang. For det første er valget om at bruge filtersterilisering i stedet for varmesterilisering af det kunstige spytmedie. Fil...

Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sygdom karakteriseret ved en manglende evne til at rydde tyk slim fra lungerne, hvilket fører til gentagne infektioner og progressiv lungefunktion tilbagegang, der ofte resulterer i behovet for lungetransplantation eller død. Luftvejens mikrobiom hos mennesker med cystisk fibrose (pwCF) synes at spore sygdomsaktivitet1, med en reduktion i mikrobiel mangfoldighed forbundet med negative langsigtede resultater2,3. I kliniske undersøgelser af pwCF, supplerende iltbehandling har været forbundet med mere avanceret sygdom4,5, men traditionelt, brugen af iltbehandling er blevet betragtet som blot en markør for sygdommens sværhedsgrad6. Nylige undersøgelser fra et klinisk forsøg med patienter med respirationssvigt har vist, at højere patientens iltniveau paradoksalt nok er forbundet med en stigning i alvorlige bakterieinfektioner og højere dødelighed7, hvilket tyder på, at supplerende ilt kan bidrage til sygdomspatogenese. Effekten af supplerende ilt på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge-og luftveje mikrobielle samfund er ikke blevet godt undersøgt.
Mekanistiske undersøgelser kan ofte ikke udføres direkte på mennesker på grund af logistiske vanskeligheder og potentielle etiske spørgsmål forbundet med interventioner af ukendt medicinsk fordel eller skade. Translationelle tilgange, der integrerer menneskelige biospecimens i modelsystemer, kan give vigtig biologisk indsigt i disse tilfælde. Mens evnen til at bruge eller tolerere ilt traditionelt har været en vigtig del af mikrobielle klassificering, lidt vides om, hvordan den terapeutiske indførelse af supplerende ilt til miljøet kan forstyrre luftvejene mikrobielle samfund. For at kaste lys over de ukendte virkninger af supplerende ilt på luftvejene mikrobiomer af pwCF, vi havde brug for at løse to store udfordringer; for det første oprettelsen af et kulturmedium, der fysiologisk tilnærmer sammensætningen af CF sputum; for det andet oprettelsen af et modelsystem, der gør det muligt at opretholde forhøjede iltkoncentrationer i kulturen over længere tid.
Kunstige spytmedier (ASM) bruges i vid udstrækning til at efterligne lungesputum ex vivo8,9,10, men der er ingen klar konsensus om en bestemt opskrift. Denne protokol beskriver en kunstig spyt medium opskrift og forberedelse strategi omhyggeligt designet til fysiologisk omtrentlige spyt fra pwCF. Tabel 1 skitserer de valgte opskriftsværdier baseret på udgivet litteratur. Grundlæggende kemiske komponenter og pH blev matchet med værdier, der blev identificeret ved undersøgelser af human CF sputum11,12,13. Lav koncentration fysiologiske næringsstoffer blev tilsat ved hjælp af æggeblomme, som blev inkluderet som 0,25% af det endelige volumen10, samt vitamin og spormetal blander14,15. Mucin, den vigtigste komponent i spyt16, blev inkluderet på 1% w /v14. Selvom mere arbejdskrævende, filter sterilisering blev valgt over de mere konventionelle praksis med varme sterilisering for at reducere potentielle problemer fra varme-induceret denaturering af væsentlige mediekomponenter10. En yderligere fordel ved filtersterilisering er, at det genererer medier, der er gennemsigtige (varmesterilisering kan skabe uklare medier på grund af nedbør og koagulering af salte og proteiner), hvilket gør det muligt at bruge dette kunstige spytmedier til at følge mikrobiel vækst baseret på stigninger i turbiditet.
Dette modelsystem til den hyperoxiske kultur er baseret på anaerobe dyrkningsteknikker, hvor ilt tilsættes i stedet for at fjernes, hvilket skaber en model for effekten af supplerende iltforbrug til pwCF. Figur 1 og den tilhørende iltskåringsprotokol skitserer komponenterne i et iltskåringssystem, som kan opnås til lave omkostninger fra almindelige laboratorie- og hospitalsleverandører. Dette system gør det muligt at blande trykluft og luft til faste koncentrationer fra 21%-100% ilt. Integrationen af en iltsensor gør det muligt at kontrollere koncentrationen af outputgasblandingen samt kontrollere udstrømningsgassammensætningen af tidligere sparrede serumflasker for at kontrollere, at iltforholdene er blevet opretholdt inden for det ønskede interval.
Denne protokol skitserer procedurer for at skabe et kunstigt spyt medium, opførelse og brug af en ilt sparging system, og anvendelsen af både til kultur CF spyt under differentierede ilt betingelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Luftvejs mikrobielle samfund menes at spille en vigtig rolle i udviklingen af cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesygdomme. Mikrober er traditionelt blevet klassificeret baseret på deres evne til at bruge eller tolerere ilt. Supplerende ilt er en almindelig medicinsk behandling administreres til mennesker med cystisk fibrose (pwCF); men eksisterende undersøgelser af ilt og luftvejene mikrobiom har fokuseret på, hvordan hypoxi (lavt iltindhold) snarere end hyperoxi (høj ilt) påvirker overvejende aerob og fakultetet anaerob lunge mikrobielle samfund. For at løse dette kritiske videnskløft blev denne protokol udviklet ved hjælp af et kunstigt spytmedie, der efterligner sammensætningen af spyt fra pwCF. Brugen af filtersterilisering, som giver et gennemsigtigt medium, gør det muligt for optiske metoder at følge væksten af encellede mikrober i suspensionskulturer. For at skabe hyperoxiske tilstande drager dette modelsystem fordel af etablerede anaerobe dyrkningsteknikker til at studere hyperoxiske tilstande; i stedet for at fjerne ilt tilsættes ilt til kulturer ved daglig sparging af serumflasker med en blanding af trykluft og luft. Sputum fra 50 pwCF gennemgik daglig sparging i en 72-timers periode for at kontrollere denne models evne til at opretholde differentierede iltforhold. Shotgun metagenomic sekventering blev udført på kultiverede og uncultured spyt prøver fra 11 pwCF at kontrollere evnen til dette medium til at støtte væksten af commensale og patogene mikrober almindeligt forekommende i cystisk fibrose spyt. Vækstkurver blev opnået fra 112 isolater opnået fra pwCF for at kontrollere dette kunstige spytmediums evne til at understøtte væksten af almindelige cystisk fibrosepatogener. Vi finder, at denne model kan kultur en bred vifte af patogener og commensals i CF spyt, genvinder et samfund meget lig uncultured spyt under normoxiske forhold, og skaber forskellige kultur fænotyper under varierende ilt betingelser. Denne nye tilgang kan føre til en bedre forståelse af uventede virkninger forårsaget af brugen af ilt i pwCF på luftvejsmikrobielle samfund og almindelige respiratoriske patogener.

Disse protokoller blev anvendt på 50 eksprentes sputum prøver fra pwCF præsentere for rutinemæssig pleje til en ambulant cystisk fibrose klinik på Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Hver patients spyt blev kultiveret under 21%, 50% og 100% iltforhold ved hjælp af det kunstige spytmedium, med 0,5 mL aliquots taget fra hver kultur ved 24 timer, 48 timer og 72 timers kulturtid til test. Kulturer blev fotograferet, da der blev foretaget ekstraktioner for at spore visuelle ændringer. Derudover blev...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Målet med denne protokol er at udvikle et modelsystem for effekten af hyperoxi på cystisk fibrose luftvejs mikrobielle samfund. Kunstigt spyt medium emulerer sammensætningen af spyt, og hyperoxiske kulturforhold modellerer virkningerne af supplerende ilt på lungemikrobielle samfund.

Design og udvikling af en model til at studere effekten af supplerende ilt på cystisk fibrose Luftvejene Mikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Disse protokoller er designet til at modellere in vitro virkninger af supplerende iltforbrug på lungemikrobiomet af cystisk fibrose patienter. Denne medieopskrift er skræddersyet til at afspejle den fysiologiske sammensætning af spyt for mennesker, der lever med cystisk fibrose. Spargingprocessen introducerer evnen til at kultur under forskellige iltforhold.Ændringer til kunstigt spyt medium gør det muligt at efterligne andre kroniske lungesygdomme og model mikrobielle samfund under andre betingelser, såsom forskellige glukose koncentrationer i samtidig cystisk fibrose og diabetes patienter. En oversigt over trinene til kunstigt spyt medium forberedelse viser blandingen af den forberedte ASCM, ASMM og ASBM. Mopperbufferen bruges til at titrere pH til 6,3 og filtersterilisering af mediet udføres i et koldt rum på en orbital shaker.Til at begynde med skal du forberede et kunstigt spytmedium ved at tilføje 250 milliliter ASCM til den en liters flaske, der indeholder ASMM. Tilsæt derefter 250 milliliter ASBM til mediumflasken. Titrere mediet med en grundlæggende molar mops buffer for at nå en pH-6.3 på et pH-papir.Nedkøl det kunstige spytmedium ved fire grader Celsius indtil filtrering. Derefter for at starte filtreringsprocessen overføres 200 milliliter ufiltreret kunstigt spytmedium til et vakuumfiltreringssystem med et 0,22 mikrometer porestørrelsesfilter. Efter tilslutning af filtreringssystemet til vakuumpumpen skal du tænde vakuumpumpen og derefter placere kammeret på en orbital shaker og ryste ved 90 rotationer i minuttet i et koldt rum ved fire grader Celsius.Skift filteret efter 350 milliliter medium bliver filtreret for at overvinde tilstopning problem. Efter en betydelig mængde er filtreret, på en ekstra 150 milliliter medium til filtrering. Gentag filtrering med ekstra kamre, indtil alle medier er filtreret.Oversigt over iltskåring, der demonstrerer tilsætning af patientens spyt til kunstigt spytmedium i en autoklavet serumflaske. Spar derefter den forseglede serumflaske med en gasblanding. Endelig inkuberes serumflasken for at opnå kultur Alec Watts med 24 timers interval for efterfølgende metagenomsekvensering.For at starte serum flaske kultur sparging, mærke 500 milliliter autoklavet serum flasker med prøve identifikatorer, dato og klokkeslæt for podning og mål ilt procent. I en biologisk hætte tilsættes 24 milliliter af det kunstige spytmedie til hver serumflaske, der sættes op. For at opnå et tilstrækkeligt prøvevolumen for hver kulturtilstand fortyndes prøven om nødvendigt med steril fosfatbufferet saltvand, homogeniseret spyt med en 18-gauge nål og tilsæt en milliliter af patientens spyt til hver serumflaske.Ved hjælp af steril pincet skal du derefter placere de autoklavede gummipropper på toppen af hver serumflaske, trykke gummipropperne ned uden at røre undersiden af proppen. Efter fjernelse af flaskerne fra emhætten, anvende og krympe aluminium sæler. Fjern tætningernes midtpunkt, og tør toppen af flaskerne af med en spritstappe, og før flaskeforseglingen gennem en Bunsen-brænderflamme.Nu fastgør en steril, 18 gauge nål til et stempelliste sprøjte med et filter, indsætte den anbragte gas frigivelse sprøjte i flasken først. Nu fastgør en steril, 18 gauge nål til gasudgangen fra systemet og indsætte gas output nål i flasken så godt. Før T-krydsene fra tankene gennem iltmonitoren.Efter at have kontrolleret målet ilt koncentration flyder gennem systemet, mål cirka fem liter i minuttet af gasstrømmen. Omdiriger T-krydsene fra tankene til gasudgangen. Når gassen begynder at strømme gennem serumflasken, skal du være meget opmærksom på trykmåleren, og hvis trykket stiger uventet, skal du straks slukke for systemet.Efter at have kørt, sparer ilt gennem serumflasken i et minut ved fem liter i minuttet, indstillingerne giver mulighed for 10 luftudvekslinger og sikrer, at den indre atmosfære når den ønskede koncentration på 100% ilt. Fjern gasudslip, 18 gauge nål. Når trykket i serumflasken er blevet til en atmosfære, skal gasudgangsnålen straks fjernes.Inkuber serumflaskerne i 37 grader Celsius inkubator shaker ved 150 rotationer i minuttet i 3, 24 timers intervaller. Alec Watts tages ved hvert 24 timers interval for downstream-analyse, og prøverne resparges hver gang. Eksemplet her viser, hvordan en kultur kan se ud før og efter inkubation.Udstrømnings oxygen- og pH-niveauerne blev målt i løbet af kulturprocessen for spytprøver, der blev opretholdt ved 37 grader Celsius. Med både sparging intervaller på 12 timer og 24 timer, ilt koncentrationer blev ca vedligeholdt over tid med et moderat fald i ilt koncentration observeret for alle tre betingelser. De målte pH-niveauer var inden for det fysiologiske område uden væsentlige ændringer over tid.Sammenligningen af mikrobiel belastning, mangfoldighed og samfundssammensætning mellem uncultured og kultiveret spyt afslørede en 20 gange stigning i mikrobiel belastning i kultiveret spyt. Mangfoldighedsmålinger indikerede bevarelse af samfundets sammensætning med minimale globale forskelle indført af kulturprocessen. Sammenlignende analyse af de 120 mikrobielle arter i kultiveret og uncultured spyt blev udført ved meta genomisk sekventering.46 af disse arter blev identificeret i både ikke-dyrkede og kultiverede prøver. Mens 35 udelukkende blev identificeret i ikke-dyrkede prøver, og 39 udelukkende blev identificeret i kultiverede prøver. Absorberende baserede vækstkurver blev genereret for almindelige CF lungepatogener, der dyrkes i kunstige spytmedier fra patientprøveisolater under normal iltkoncentration på 21%.Ingen ændring over tid i den optiske tæthed ved 600 nanometer i ASM kun negativ kontrol angivet forurening fri kultur. De typiske vækstkurve mønstre observeret angiver, at ASM medium kan bruges til generering af vækstkurver ved hjælp af optiske metoder. Den metagenomic sekventering bruges her til at beskrive mikrobielle samfund sammensætning.Andre teknikker såsom metatranscriptomisk sekventering kan bruges til at evaluere genekspression eller metabolomics til at evaluere metabolitproduktion.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkører i en dyremodel for at afsløre Neurale, hæmatologisk, og adfærdsmæssige korrelater til PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Den dimethylnitrosamin induceret leverfibrose Model i Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Aktuel Airway Anæstesi til Awake-endoskopisk Intubation Brug af Spray-as-you-go teknik med høj Oxygen Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

En primær menneskelige trofoblast Model til at studere effekten af Inflammation forbundet med maternel fedme på regulering af Autophagy i moderkagen

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generation af menneskers Nasal epitelcelle Spheroids for individualiseret cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator undersøgelse

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...