Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Une partie de ce travail a été réalisée au Laboratoire de biologie marine avec le soutien du Laboratoire de biologie marine, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (numéro de subvention 5600373), et un don de la Fondation Simons.

Cette étude a reçu l’approbation du Comité d’examen des établissements partenaires (Protocole no 2018P002934). Le critère d’inclusion comprenait les patients adultes atteints de fibrose kystique qui ont fourni un consentement éclairé écrit pour l’étude. Il n’y avait pas de critère d’exclusion. Selon les lignes directrices du protocole, tous les échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des patients atteints de fibrose kystique lors d’une visite ambulatoire programmée chez leur fou...

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	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

Dans cette étude, un modèle in vitro a été développé pour étudier l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes pulmonaires. Ce modèle, basé sur des expectorations artificielles et le stockage quotidien de flacons de sérum, maintient des concentrations élevées d’oxygène et favorise la croissance des microbes identifiés dans les expectorations du PWCF.
Cette approche comporte plusieurs étapes critiques. Le premier est le choix d’utiliser la stérilisat...

La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique caractérisée par une incapacité à éliminer le mucus épais des poumons, entraînant des infections répétées et un déclin progressif de la fonction pulmonaire qui entraîne souvent la nécessité d’une transplantation pulmonaire ou de la mort. Le microbiome des voies respiratoires des personnes atteintes de mucoviscidose (FCP) semble suivre l’activité de la maladie1, avec une réduction de la diversité microbienne associée à des résultats indésirables à long terme2,3. Dans les études cliniques de la PWF, l’oxygénothérapie supplémentaire a été associée à une maladie plus avancée4,5, bien que traditionnellement, l’utilisation de l’oxygénothérapie ait été considérée comme un simple marqueur de la gravité de la maladie6. Des études récentes issues d’un essai clinique sur des patients atteints d’insuffisance respiratoire ont montré que des niveaux d’oxygène plus élevés sont paradoxalement associés à une augmentation des infections bactériennes graves et à une mortalité plus élevée7,ce qui suggère que l’oxygène supplémentaire peut contribuer à la pathogenèse de la maladie. L’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome pulmonaire de la fibrose kystique et les communautés microbiennes pulmonaires et des voies respiratoires associées n’a pas été bien étudié.
Les études mécanistes ne peuvent souvent pas être effectuées directement sur des sujets humains en raison de difficultés logistiques et de problèmes éthiques potentiels associés à des interventions d’avantages ou de préjudices médicaux inconnus. Les approches translationnelles qui intègrent des échantillons biologiques humains dans des systèmes modèles peuvent offrir des informations biologiques importantes dans ces cas. Bien que la capacité d’utiliser ou de tolérer l’oxygène ait traditionnellement été un élément important de la classification microbienne, on sait peu de choses sur la façon dont l’introduction thérapeutique d’oxygène supplémentaire dans l’environnement pourrait perturber les communautés microbiennes des voies respiratoires. Pour faire la lumière sur les effets inconnus de l’oxygène supplémentaire sur les microbiomes des voies respiratoires du PWCF, nous devions relever deux défis majeurs; premièrement, la création d’un milieu de culture qui se rapproche physiologiquement de la composition des expectorations de la FK; deuxièmement, la création d’un système modèle qui permet le maintien de concentrations élevées d’oxygène en culture sur de longues périodes de temps.
Les milieux d’expectorations artificielles (ASM) sont largement utilisés pour émuler les expectorations pulmonaires ex vivo8,9,10, mais il n’y a pas de consensus clair sur une recette spécifique. Ce protocole décrit une recette et une stratégie de préparation de milieu d’expectorations artificielles soigneusement conçues pour se rapprocher physiologiquement des expectorations de pwCF. Le tableau 1 présente les valeurs de recette choisies en fonction de la littérature publiée. Les composants chimiques de base et le pH ont été appariés aux valeurs identifiées par les études sur les expectorations humaines de FK11,12,13. Des nutriments physiologiques à faible concentration ont été ajoutés à l’aide de jaune d’œuf, qui a été inclus comme 0,25% du volume final10, ainsi que des mélanges de vitamines et de métaux traces14,15. La mucine, le composant clé des expectorations16,a été incluse à 1% p/v14. Bien que nécessitant plus de main-d’œuvre, la stérilisation par filtre a été choisie par rapport à la pratique plus conventionnelle de la stérilisation thermique pour réduire les problèmes potentiels liés à la dénaturation induite par la chaleur des composants essentiels des milieux10. Un avantage supplémentaire de la stérilisation par filtre est qu’elle génère des milieux transparents (la stérilisation thermique peut créer des milieux troubles en raison de la précipitation et de la coagulation des sels et des protéines), ce qui permet d’utiliser ces milieux d’expectorations artificiels pour suivre la croissance microbienne en fonction de l’augmentation de la turbidité.
Ce système modèle pour la culture hyperoxique est basé sur des techniques de culture anaérobie où l’oxygène est ajouté plutôt que retiré, créant un modèle pour l’effet de l’utilisation supplémentaire d’oxygène pour pwCF. La figure 1 et le protocole d’épargnance en oxygène qui y est associé décrivent les composants d’un système de lutte contre l’oxygène, qui peut être obtenu à faible coût auprès des fournisseurs généraux de laboratoires et d’hôpitaux. Ce système permet de mélanger de l’oxygène comprimé et de l’air à des concentrations fixes allant de 21% à 100% d’oxygène. L’intégration d’un capteur d’oxygène permet de vérifier la concentration du mélange de gaz de sortie, ainsi que de vérifier la composition du gaz sortant des bouteilles de sérum préalablement épargnées pour vérifier que les conditions d’oxygène ont été maintenues dans la plage souhaitée.
Ce protocole décrit les procédures pour créer un milieu d’expectorations artificielles, la construction et l’utilisation d’un système de stockage d’oxygène et l’application des deux pour cultiver des expectorations de FIBRO dans des conditions d’oxygène différentiel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

On pense que les communautés microbiennes des voies respiratoires jouent un rôle important dans la progression de la fibrose kystique (FK) et d’autres maladies pulmonaires chroniques. Les microbes ont traditionnellement été classés en fonction de leur capacité à utiliser ou à tolérer l’oxygène. L’oxygène supplémentaire est un traitement médical courant administré aux personnes atteintes de fibrose kystique (PWF); cependant, les études existantes sur l’oxygène et le microbiome des voies respiratoires se sont concentrées sur la façon dont l’hypoxie (faible teneur en oxygène) plutôt que l’hyperoxie (oxygène élevé) affecte les communautés microbiennes pulmonaires anaérobies principalement aérobies et facultatives. Pour combler cette lacune critique en matière de connaissances, ce protocole a été élaboré à l’aide d’un milieu d’expectorations artificielles qui imite la composition des expectorations du PWCF. L’utilisation de la stérilisation par filtre, qui donne un milieu transparent, permet des méthodes optiques pour suivre la croissance de microbes unicellulaires dans des cultures en suspension. Pour créer des conditions hyperoxiques, ce système modèle tire parti des techniques de culture anaérobie établies pour étudier les conditions hyperoxiques; au lieu d’éliminer l’oxygène, l’oxygène est ajouté aux cultures par barbotage quotidien de bouteilles de sérum avec un mélange d’oxygène comprimé et d’air. Les expectorations de 50 pwCF ont subi un éparpillement quotidien pendant une période de 72 heures pour vérifier la capacité de ce modèle à maintenir des conditions d’oxygène différentielles. Le séquençage métagénomique shotgun a été effectué sur des échantillons d’expectorations cultivées et non cultivées de 11 pwCF afin de vérifier la capacité de ce milieu à soutenir la croissance des microbes commensaux et pathogènes couramment présents dans les expectorations de la fibrose kystique. Des courbes de croissance ont été obtenues à partir de 112 isolats obtenus à partir de pwCF pour vérifier la capacité de ce milieu d’expectorations artificielles à soutenir la croissance d’agents pathogènes courants de la fibrose kystique. Nous constatons que ce modèle peut cultiver une grande variété d’agents pathogènes et de commensaux dans les expectorations de FK, récupère une communauté très similaire aux expectorations non cultivées dans des conditions normoxiques et crée différents phénotypes de culture dans des conditions d’oxygène variables. Cette nouvelle approche pourrait permettre de mieux comprendre les effets imprévus induits par l’utilisation de l’oxygène dans le PWCF sur les communautés microbiennes des voies respiratoires et les agents pathogènes respiratoires courants.

Ces protocoles ont été appliqués à 50 échantillons d’expectorations expectorées provenant de pwCF présentant des soins de routine à une clinique ambulatoire de fibrose kystique au Massachusetts General Hospital à Boston, Massachusetts. Les expectorations de chaque patient ont été cultivées dans des conditions d’oxygène de 21%, 50% et 100% en utilisant le milieu d’expectorations artificielles, avec des aliquotes de 0,5 mL prélevées sur chaque culture à 24 h, 48 h et 72 h de temps de culture pour les ...

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Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

L’objectif de ce protocole est de développer un système modèle pour l’effet de l’hyperoxie sur les communautés microbiennes des voies respiratoires de la fibrose kystique. Le milieu d’expectorations artificielles émule la composition des expectorations, et les conditions de culture hyperoxique modélisent les effets de l’oxygène supplémentaire sur les communautés microbiennes pulmonaires.

Conception et développement d’un modèle pour étudier l’effet de l’oxygène supplémentaire sur le microbiome des voies respiratoires de la fibrose kystique

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Ces protocoles sont conçus pour modéliser les effets in vitro de l’utilisation supplémentaire d’oxygène sur le microbiome pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose. Cette recette de média est conçue pour refléter la composition physiologique des expectorations chez les personnes atteintes de mucoviscidose. Le processus de sparging introduit la capacité de cultiver dans différentes conditions d’oxygène.Les altérations du milieu des expectorations artificielles lui permettent d’imiter d’autres maladies pulmonaires chroniques et de modéliser des communautés microbiennes dans d’autres conditions, telles que des concentrations de glucose différentes chez les patients atteints concomitants de fibrose kystique et de diabète. Un aperçu des étapes de préparation des milieux d’expectorations artificielles montre le mélange de l’ASCM, de l’ASMM et de l’ASBM préparés. Le tampon de vadrouille est utilisé pour titrer le pH à 6,3 et la stérilisation du filtre du milieu est effectuée dans une chambre froide sur un agitateur orbital.Pour commencer, préparez un milieu d’expectorations artificielles en ajoutant 250 millilitres d’ASCM à la bouteille d’un litre contenant de l’ASMM. Ajoutez ensuite 250 millilitres d’ASBM à la bouteille moyenne. Titrer le milieu avec un tampon de base à une molaire pour atteindre un pH de 6,3 sur un papier pH.Réfrigérer les expectorations artificielles à quatre degrés Celsius jusqu’à filtration. Ensuite, pour commencer le processus de filtration, transférez 200 millilitres de milieu d’expectorations artificielles non filtrées à un système de filtration sous vide avec un filtre de taille de pore de 0,22 micromètre. Après avoir connecté le système de filtration à la pompe à vide, allumez la pompe à vide, puis placez la chambre sur un agitateur orbital, en secouant à 90 rotations par minute dans une chambre froide à quatre degrés Celsius.Changez le filtre après que 350 millilitres de milieu sont filtrés pour surmonter le problème de colmatage. Après une quantité considérable est filtrée, à un milieu supplémentaire de 150 millilitres pour la filtration. Répétez la filtration avec des chambres supplémentaires jusqu’à ce que tous les fluides soient filtrés.Vue d’ensemble de l’épargnant l’épargne d’oxygène démontrant l’ajout d’expectorations du patient à un milieu d’expectorations artificielles dans un flacon de sérum autoclavé. Ensuite, éparpillez le flacon de sérum scellé avec un mélange de gaz. Enfin, le flacon de sérum est incubé pour obtenir la culture Alec Watts à l’intervalle de 24 heures pour le séquençage ultérieur de la métagénomique.Pour commencer la culture de flacons de sérum, étiquetez les flacons de sérum autoclavés de 500 millilitres avec les identificateurs d’échantillon, la date et l’heure de l’inoculation et le pourcentage d’oxygène cible. Dans une hotte biologique, ajouter 24 millilitres de milieu d’expectorations artificielles à chaque flacon de sérum mis en place. Pour obtenir un volume d’échantillon suffisant pour chaque condition de culture, si nécessaire, diluer l’échantillon avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile, puis homogénéiser les expectorations avec une aiguille de calibre 18 et ajouter un millilitre des expectorations du patient à chaque flacon de sérum.Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler stérile, placez les bouchons en caoutchouc autoclavés sur le dessus de chaque bouteille de sérum, appuyez sur les bouchons en caoutchouc sans toucher le dessous du bouchon. Après avoir retiré les bouteilles de la hotte, appliquez et sertissez les joints en aluminium. Retirez la pièce maîtresse des joints et essuyez le haut des bouteilles avec une lingette à l’alcool et passez le sceau de la bouteille à travers une flamme de brûleur Bunsen.Maintenant, fixez une aiguille stérile de calibre 18 à une seringue de liste de piston avec un filtre, insérez d’abord la seringue de libération de gaz apposée dans le flacon. Maintenant, fixez une aiguille stérile de calibre 18 à la sortie de gaz du système et insérez également l’aiguille de sortie de gaz dans la bouteille. Acheminez les jonctions en T des réservoirs à travers le moniteur d’oxygène.Après avoir vérifié la concentration cible d’oxygène circulant dans le système, ciblez environ cinq litres par minute de débit de gaz. Redirigez les jonctions en T des réservoirs jusqu’à la sortie de gaz. Lorsque le gaz commence à circuler dans le flacon de sérum, portez une attention particulière au manomètre et, si la pression augmente de manière inattendue, éteignez immédiatement le système.Après avoir couru, l’oxygène s’écoule à travers le flacon de sérum pendant une minute à cinq litres par minute, les réglages permettent 10 échanges d’air et garantissent que l’atmosphère interne atteint la concentration souhaitée de 100% d’oxygène. Retirez le dégagement de gaz, aiguille de calibre 18. Après avoir laissé la pression dans le flacon de sérum s’accumuler dans une atmosphère, retirez immédiatement l’aiguille de sortie de gaz.Incuber les flacons de sérum dans un agitateur d’incubateur à 37 degrés Celsius à 150 rotations par minute pendant 3, 24 heures d’intervalle. Alec Watts est prélevé à chaque intervalle de 24 heures pour l’analyse en aval et les échantillons sont respargedés à chaque fois. L’exemple ici montre à quoi peut ressembler une culture avant et après l’incubation.Les niveaux d’oxygène et de pH sortant ont été mesurés au cours du processus de culture pour les échantillons d’expectorations maintenus à 37 degrés Celsius. Avec des intervalles de 12 heures et de 24 heures, les concentrations d’oxygène ont été approximativement maintenues au fil du temps avec une baisse modérée de la concentration en oxygène observée pour les trois conditions. Les niveaux de pH mesurés se situaient dans la plage physiologique sans changements significatifs au fil du temps.La comparaison de la charge microbienne, de la diversité et de la composition de la communauté entre les expectorations non cultivées et cultivées a révélé une augmentation de 20 fois de la charge microbienne dans les expectorations cultivées. Les mesures de la diversité indiquaient la préservation de la composition de la communauté avec un minimum de différences mondiales introduites par le processus culturel. L’analyse comparative des 120 espèces microbiennes dans les expectorations cultivées et non cultivées a été réalisée par séquençage métagénomique.46 de ces espèces ont été identifiées dans des échantillons non cultivés et cultivés. Alors que 35 ont été exclusivement identifiés dans des échantillons non cultivés et 39 ont été exclusivement identifiés dans des échantillons cultivés. Des courbes de croissance à base d’absorbants ont été générées pour les agents pathogènes pulmonaires courants de la FK cultivés dans des milieux d’expectorations artificiels à partir d’isolats d’échantillons de patients à une concentration normale d’oxygène de 21 %.Aucun changement au fil du temps dans la densité optique à 600 nanomètres dans l’ASM seul le contrôle négatif a indiqué une culture sans contamination. Les modèles typiques de courbe de croissance observés indiquent que le milieu ASM peut être utilisé pour la génération de courbes de croissance à l’aide de méthodes optiques. Le séquençage métagénomique est utilisé ici pour décrire la composition de la communauté microbienne.D’autres techniques telles que le séquençage métatranscriptomique peuvent être utilisées pour évaluer l’expression des gènes ou la métabolomique pour évaluer la production de métabolites.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotopique aortique transplantation: un modèle de rat pour étudier le développement de la vasculopathie chronique

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Recherche

Médecine

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Le diméthylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Modèle chez le rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topique Airway anesthésie pour intubation Awake-endoscopique Utilisation du Spray-as-you-go Technique avec débit élevé d&#39;oxygène

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Un modèle trophoblastiques humaines primaires pour étudier l’effet de l’Inflammation associées à l’obésité maternelle sur la réglementation de l’autophagie dans le Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Un modèle murin d’exposition foetale à l’inflammation maternelle pour étudier les effets de la chorioamnionite aiguë sur le développement intestinal nouveau-né