Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Ein Teil dieser Arbeit wurde im Marine Biological Lab mit Unterstützung des Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (Fördernummer 5600373) und einem Geschenk der Simons Foundation durchgeführt.

Diese Studie wurde vom Partners Institutional Review Board genehmigt (Protokoll Nr. 2018P002934). Einschlusskriterium umfasste erwachsene Patienten mit Mukoviszidose, die eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung für die Studie erteilten. Es gab kein Ausschlusskriterium. Gemäß den Protokollrichtlinien wurden alle Sputumproben von Patienten mit Mukoviszidose während eines geplanten ambulanten Besuchs bei ihrem klinischen Anbieter gesammelt.
1. Künstliche Sputum Medium Vorbereitung
...

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	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

In dieser Studie wurde ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Lungengemeinschaften zu untersuchen. Dieses Modell, das auf künstlichem Sputummedium und täglichem Sparging von Serumflaschen basiert, hält erhöhte Sauerstoffkonzentrationen aufrecht und unterstützt das Wachstum von Mikroben, die im Sputum von pwCF identifiziert wurden.
Es gibt mehrere kritische Schritte dieses Ansatzes. Erstens ist die Wahl, Filter-Sterilisation anstelle von Hitze...

Mukoviszidose (CF) ist eine genetische Erkrankung, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, dicken Schleim aus der Lunge zu entfernen, was zu wiederholten Infektionen und fortschreitendem Rückgang der Lungenfunktion führt, was oft zu einer Lungentransplantation oder zum Tod führt. Das Atemwegsmikrobiom von Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) scheint die Krankheitsaktivität1zu verfolgen, wobei eine Verringerung der mikrobiellen Vielfalt mit unerwünschten Langzeitergebnissen verbunden ist2,3. In klinischen Studien mit pwCF wurde die ergänzende Sauerstofftherapie mit fortgeschrittenerenErkrankungen inVerbindung gebracht 4,5, obwohl traditionell die Verwendung der Sauerstofftherapie einfach als Marker für die Schwere der Erkrankung angesehen wurde6. Jüngste Studien aus einer klinischen Studie mit Patienten mit Atemversagen haben gezeigt, dass ein höherer Sauerstoffgehalt bei Patienten paradoxerweise mit einer Zunahme schwerer bakterieller Infektionen und einer höheren Mortalität verbunden ist7, was darauf hindeutet, dass zusätzlicher Sauerstoff zur Pathogenese der Krankheit beitragen kann. Die Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Lungenmikrobiom und die damit verbundenen mikrobiellen Lungen- und Atemwegsgemeinschaften wurde nicht gut untersucht.
Mechanistische Studien können aufgrund logistischer Schwierigkeiten und potenzieller ethischer Probleme im Zusammenhang mit Interventionen mit unbekanntem medizinischem Nutzen oder Schaden oft nicht direkt am Menschen durchgeführt werden. Translationale Ansätze, die menschliche Bioproben in Modellsysteme integrieren, können in diesen Fällen wichtige biologische Erkenntnisse liefern. Während die Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, traditionell ein wichtiger Bestandteil der mikrobiellen Klassifizierung war, ist wenig darüber bekannt, wie die therapeutische Einführung von zusätzlichem Sauerstoff in die Umwelt mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege stören könnte. Um die unbekannten Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf die Atemwegsmikrobiome von pwCF zu beleuchten, mussten wir uns zwei großen Herausforderungen stellen; erstens die Schaffung eines Kulturmediums, das sich physiologisch der Zusammensetzung von CF-Sputum annähert; zweitens die Schaffung eines Modellsystems, das die Aufrechterhaltung erhöhter Sauerstoffkonzentrationen in Kultur über längere Zeiträume ermöglicht.
Künstliche Sputummedien (ASM) werden häufig verwendet, um Lungenputum ex vivo8,9,10zu emulieren , aber es gibt keinen klaren Konsens über ein bestimmtes Rezept. Dieses Protokoll beschreibt eine künstliche Sputum-Medium-Rezeptur und Zubereitungsstrategie, die sorgfältig entwickelt wurde, um Sputum von pwCF physiologisch anzunähern. Tabelle 1 zeigt die ausgewählten Rezeptwerte basierend auf veröffentlichter Literatur. Grundlegende chemische Komponenten und pH-Wert wurden mit Werten abgeglichen, die durch Studien an menschlichem CF-Sputum11,12,13 identifiziertwurden. Niedrige Konzentration physiologische Nährstoffe wurden unter Verwendung von Eigelb, das als 0,25% des Endvolumens10enthalten war, sowie Vitamin- und Spurenmetallmischungen14,15hinzugefügt. Mucin, die Schlüsselkomponente von Sputum16,wurde mit 1% w/v14eingeschlossen. Obwohl arbeitsintensiver, wurde die Filtersterilisation der konventionelleren Praxis der Wärmesterilisation vorgezogen, um potenzielle Probleme durch hitzeinduzierte Denaturierung wesentlicher Medienkomponenten zu reduzieren10. Ein zusätzlicher Vorteil der Filtersterilisation besteht darin, dass transparente Medien erzeugt werden (Die Wärmesterilisation kann aufgrund der Ausfällung und Koagulation von Salzen und Proteinen trübe Medien erzeugen), so dass diese künstlichen Auswurfmedien verwendet werden können, um das mikrobielle Wachstum auf der Grundlage einer Erhöhung der Trübung zu verfolgen.
Dieses Modellsystem für die hyperoxische Kultur basiert auf anaeroben Kultivierungstechniken, bei denen Sauerstoff hinzugefügt und nicht entfernt wird, wodurch ein Modell für die Wirkung der zusätzlichen Sauerstoffnutzung für pwCF erstellt wird. Abbildung 1 und das zugehörige Sauerstoffsparging-Protokoll skizziert die Komponenten eines Sauerstoff-Sparging-Systems, das kostengünstig von allgemeinen Labor- und Krankenhauslieferanten bezogen werden kann. Dieses System ermöglicht das Mischen von komprimiertem Sauerstoff und Luft zu festen Konzentrationen im Bereich von 21% -100% Sauerstoff. Die Integration eines Sauerstoffsensors ermöglicht die Überprüfung der Konzentration des Ausgangsgasgemisches sowie die Überprüfung der Ausflussgaszusammensetzung von zuvor verschonten Serumflaschen, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffbedingungen im gewünschten Bereich eingehalten wurden.
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Erzeugung eines künstlichen Sputummediums, den Aufbau und die Verwendung eines Sauerstoffsparsystems und die Anwendung beider auf DIE Kultur von CF-Sputum unter differentiellen Sauerstoffbedingungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
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design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Es wird angenommen, dass mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Mukoviszidose (CF) und anderer chronischer Lungenerkrankungen spielen. Mikroben wurden traditionell aufgrund ihrer Fähigkeit, Sauerstoff zu verwenden oder zu tolerieren, klassifiziert. Zusätzlicher Sauerstoff ist eine gängige medizinische Therapie, die Menschen mit Mukoviszidose (pwCF) verabreicht wird. Bestehende Studien zu Sauerstoff und dem Mikrobiom der Atemwege haben sich jedoch darauf konzentriert, wie hypoxie (sauerstoffarm) und nicht Hyperoxie (hoher Sauerstoffgehalt) die überwiegend aeroben und fakultativen anaeroben mikrobiellen Lungengemeinschaften beeinflusst. Um diese kritische Wissenslücke zu schließen, wurde dieses Protokoll unter Verwendung eines künstlichen Sputummediums entwickelt, das die Zusammensetzung von Sputum aus pwCF nachahmt. Die Verwendung der Filtersterilisation, die ein transparentes Medium ergibt, ermöglicht optische Methoden, um das Wachstum von einzelligen Mikroben in Suspensionskulturen zu verfolgen. Um hyperoxische Bedingungen zu erzeugen, nutzt dieses Modellsystem etablierte anaerobe Kultivierungstechniken, um hyperoxische Bedingungen zu untersuchen; Anstatt Sauerstoff zu entfernen, wird den Kulturen Sauerstoff zugesetzt, indem täglich Serumflaschen mit einer Mischung aus komprimiertem Sauerstoff und Luft geschont werden. Sputum von 50 pwCF wurde über einen Zeitraum von 72 Stunden täglich gespart, um die Fähigkeit dieses Modells zur Aufrechterhaltung unterschiedlicher Sauerstoffbedingungen zu überprüfen. Die metagenomische Shotgun-Sequenzierung wurde an kultivierten und unkultivierten Sputumproben von 11 pwCF durchgeführt, um die Fähigkeit dieses Mediums zu überprüfen, das Wachstum von kommensalen und pathogenen Mikroben zu unterstützen, die häufig in Mukoviszidose-Sputum vorkommen. Wachstumskurven wurden aus 112 Isolaten von pwCF erhalten, um die Fähigkeit dieses künstlichen Sputummediums zur Unterstützung des Wachstums häufiger Mukoviszidose-Erreger zu überprüfen. Wir stellen fest, dass dieses Modell eine Vielzahl von Krankheitserregern und Kommensalen im CF-Sputum kultivieren kann, eine Gemeinschaft wiederherstellt, die dem unkultivierten Sputum unter normoxischen Bedingungen sehr ähnlich ist, und verschiedene Kulturphänotypen unter unterschiedlichen Sauerstoffbedingungen erzeugt. Dieser neue Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der unvorhergesehenen Wirkungen führen, die durch die Verwendung von Sauerstoff in pwCF auf mikrobielle Gemeinschaften der Atemwege und häufige Atemwegspathogene induziert werden.

Diese Protokolle wurden auf 50 expektorierte Sputumproben von pwCF angewendet, die einer ambulanten Mukoviszidose-Klinik am Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts, zur Routineversorgung vorgelegt wurden. Das Sputum jedes Patienten wurde unter 21%, 50% und 100% Sauerstoffbedingungen unter Verwendung des künstlichen Sputummediums kultiviert, wobei 0,5 ml Aliquots aus jeder Kultur nach 24 h, 48 h und 72 h Kulturzeit zum Testen entnommen wurden. Kulturen wurden fotografiert, als Extraktionen vorgenommen wur...

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Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Ziel dieses Protokolls ist es, ein Modellsystem für die Wirkung von Hyperoxie auf mikrobielle Gemeinschaften der Mukoviszidose der Atemwege zu entwickeln. Künstliches Sputummedium emuliert die Zusammensetzung von Sputum, und hyperoxische Kulturbedingungen modellieren die Auswirkungen von zusätzlichem Sauerstoff auf mikrobielle Lungengemeinschaften.

Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Diese Protokolle wurden entwickelt, um die In-vitro-Effekte des zusätzlichen Sauerstoffverbrauchs auf das Lungenmikrobiom von Mukoviszidose-Patienten zu modellieren. Dieses Medienrezept ist auf die physiologische Zusammensetzung von Sputum für Menschen mit Mukoviszidose zugeschnitten. Der Sparging-Prozess führt die Fähigkeit ein, unter verschiedenen Sauerstoffbedingungen zu kultivieren.Veränderungen des künstlichen Sputummediums ermöglichen es, andere chronische Lungenerkrankungen nachzuahmen und mikrobielle Gemeinschaften unter anderen Bedingungen zu modellieren, wie z.B. unterschiedliche Glukosekonzentrationen bei gleichzeitigen Mukoviszidose- und Diabetespatienten. Eine Übersicht über die Schritte zur künstlichen Sputummediumaufbereitung zeigt das Mischen der hergestellten ASCM, ASMM und ASBM. Der Mopppuffer wird verwendet, um den pH-Wert auf 6,3 zu titrieren und die Filtersterilisation des Mediums wird in einem kalten Raum auf einem Orbitalschüttler durchgeführt.Bereiten Sie zunächst ein künstliches Sputummedium vor, indem Sie 250 Milliliter ASCM in die Ein-Liter-Flasche geben, die ASMM enthält. Dann geben Sie 250 Milliliter ASBM in die mittlere Flasche. Titrieren Sie das Medium mit einem einfachen molaren Mopppuffer, um einen pH-Wert von 6,3 auf einem pH-Papier zu erreichen.Kühlen Sie das künstliche Sputummedium bei vier Grad Celsius bis zur Filtration. Um dann den Filtrationsprozess zu starten, geben Sie 200 Milliliter ungefiltertes künstliches Auswurfmedium in ein Vakuumfiltrationssystem mit einem 0,22 Mikrometer porengroßen Filter. Nachdem Sie das Filtersystem an die Vakuumpumpe angeschlossen haben, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie die Kammer dann auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie mit 90 Umdrehungen pro Minute in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius.Wechseln Sie den Filter, nachdem 350 Milliliter Medium gefiltert wurden, um das Verstopfungsproblem zu überwinden. Nachdem eine beträchtliche Menge filtriert wurde, an einem zusätzlichen 150 Milliliter Medium für die Filtration. Wiederholen Sie die Filtration mit zusätzlichen Kammern, bis alle Medien gefiltert sind.Überblick über die Sauerstoffschonung, die die Zugabe von Patientensputum zu künstlichem Sputummedium in einer autoklavierten Serumflasche demonstriert. Dann die versiegelte Serumflasche mit einem Gasgemisch schonen. Schließlich wird die Serumflasche inkubiert, um die Kultur Alec Watts im 24-Stunden-Intervall für die anschließende Metagenomik-Sequenzierung zu erhalten.Um mit dem Sparging der Serumflaschenkultur zu beginnen, beschriften Sie 500 Milliliter autoklavierte Serumflaschen mit Probenkennzeichnungen, Datum und Uhrzeit der Impfung und Zielsauerstoffanteil. In einer biologischen Haube 24 Milliliter des künstlichen Sputummediums zu jeder aufzustellenden Serumflasche geben. Um ein ausreichendes Probenvolumen für jede Kulturbedingung zu erhalten, verdünnen Sie gegebenenfalls die Probe mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung, homogenisieren Sie dann Sputum mit einer 18-Gauge-Nadel und geben Sie einen Milliliter des Patienten-Sputums in jede Serumflasche.Als nächstes legen Sie mit einer sterilen Pinzette die autoklavierten Gummistopfen auf die Oberseite jeder Serumflasche und drücken Sie die Gummistopfen nach unten, ohne die Unterseite des Stopfens zu berühren. Nachdem Sie die Flaschen von der Haube genommen haben, tragen Sie die Aluminiumdichtungen auf und crimpen Sie sie. Entfernen Sie das Mittelstück der Dichtungen und wischen Sie die Oberseite der Flaschen mit einem Alkoholwisch ab und führen Sie das Flaschensiegel durch eine Bunsenbrennerflamme.Befestigen Sie nun eine sterile 18-Gauge-Nadel an einer Kolbenlistenspritze mit einem Filter, führen Sie die angebrachte Gasfreisetzungsspritze zuerst in die Flasche ein. Befestigen Sie nun eine sterile Nadel mit 18 Messgeräten am Gasausgang des Systems und führen Sie die Gasausgangsnadel ebenfalls in die Flasche ein. Leiten Sie die T-Kreuzungen von den Tanks durch den Sauerstoffmonitor.Nach der Überprüfung der Zielsauerstoffkonzentration, die durch das System fließt, sollen etwa fünf Liter pro Minute Gasstrom anvisiert werden. Leiten Sie die T-Knotenpunkte von den Tanks bis zum Gasausgang um. Wenn das Gas durch die Serumflasche zu fließen beginnt, achten Sie genau auf das Manometer und wenn der Druck unerwartet ansteigt, schalten Sie das System sofort aus.Nach dem Laufen sauerstoffsparen Sie eine Minute lang mit fünf Litern pro Minute durch die Serumflasche, die Einstellungen ermöglichen 10 Luftwechsel und stellen sicher, dass die innere Atmosphäre die gewünschte Konzentration von 100% Sauerstoff erreicht. Entfernen Sie die Gasfreisetzung, 18 Gauge Nadel. Nachdem sich der Druck in der Serumflasche auf eine Atmosphäre aufgebaut hat, entfernen Sie sofort die Gasausgangsnadel.Inkubieren Sie die Serumflaschen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator-Shaker in 150 Umdrehungen pro Minute für 3, 24-Stunden-Intervalle. Alec Watts werden in jedem 24-Stunden-Intervall zur nachgeschalteten Analyse entnommen und die Proben werden jedes Mal neu gespatzt. Das Beispiel hier zeigt, wie eine Kultur vor und nach der Inkubation aussehen kann.Die Sauerstoff- und pH-Werte des Ausflusses wurden im Laufe des Kulturprozesses für Sputumproben gemessen, die bei 37 Grad Celsius gehalten wurden. Bei beiden Sparging-Intervallen von 12 Stunden und 24 Stunden wurden die Sauerstoffkonzentrationen im Laufe der Zeit ungefähr aufrechterhalten, wobei für alle drei Bedingungen ein moderater Abfall der Sauerstoffkonzentration beobachtet wurde. Die gemessenen pH-Werte lagen im physiologischen Bereich ohne signifikante Veränderungen im Laufe der Zeit.Der Vergleich von mikrobieller Belastung, Diversität und Gemeinschaftszusammensetzung zwischen unkultiviertem und kultiviertem Sputum ergab eine 20-fache Zunahme der mikrobiellen Belastung im kultivierten Sputum. Diversitätsmetriken zeigten die Erhaltung der Zusammensetzung der Gemeinschaft mit minimalen globalen Unterschieden, die durch den Kulturprozess eingeführt wurden. Die vergleichende Analyse der 120 mikrobiellen Arten im kultivierten und unkultivierten Sputum wurde durch metagenomische Sequenzierung durchgeführt.46 dieser Arten wurden sowohl in unkultivierten als auch in kultivierten Proben identifiziert. Während 35 ausschließlich in unkultivierten Proben und 39 ausschließlich in kultivierten Proben identifiziert wurden. Absorbierende Wachstumskurven wurden für häufige CF-Lungenpathogene erzeugt, die in künstlichen Sputummedien aus Patientenprobenisolaten unter normaler Sauerstoffkonzentration von 21% kultiviert wurden.Keine Änderung der optischen Dichte bei 600 Nanometern im Asom im Laufe der Zeit, nur die Negativkontrolle zeigte eine kontaminationsfreie Kultur an. Die beobachteten typischen Wachstumskurvenmuster deuten darauf hin, dass ASM-Medium zur Erzeugung von Wachstumskurven mit optischen Methoden verwendet werden kann. Die metagenomische Sequenzierung wird hier verwendet, um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zu beschreiben.Andere Techniken wie die metatranskriptomische Sequenzierung können verwendet werden, um die Genexpression zu bewerten, oder die Metabolomik, um die Metabolitenproduktion zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotopen Aorten-Transplantation: Ein Rattenmodell die Entwicklung von chronischen Vaskulopathie Study

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Forschung

Medizin

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Die Dimethylnitrosamin Induced Liver Fibrosis Modell in der Ratte

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topical Airway Anästhesie für Wach-endoskopische Intubation Mit der Spray-as-you-go-Technik mit hoher Sauerstoff-Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen