Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

חלק מעבודה זו בוצע במעבדה הביולוגית הימית בתמיכת המעבדה הביולוגית הימית, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (מספר מענק 5600373) ומתנה מקרן סימונס.

מחקר זה קיבל את אישור הוועדה לבדיקה מוסדית של השותפים (פרוטוקול מס' 2018P002934). קריטריון ההכללה כלל חולים מבוגרים עם סיסטיק פיברוזיס שסיפקו הסכמה מדעת בכתב למחקר. לא היה קריטריון אי-הכללה. על פי הנחיות הפרוטוקול, כל דגימות כיח נאספו מחולים עם סיסטיק פיברוזיס במהלך ביקור אשפוז מתוכנן עם הספק הק?...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

במחקר זה פותח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעה של היפרוקסיה על קהילות חיידקי ריאות. מודל זה, המבוסס על כיח מלאכותי בינוני ויומיומי של בקבוקי סרום, שומר על ריכוזי חמצן גבוהים ותומך בצמיחת חיידקים המזוהים בליחה מ- pwCF.
ישנם מספר שלבים קריטיים של גישה זו. הראשון הוא הבחירה לה?...

סיסטיק פיברוזיס (CF) היא מחלה גנטית המאופיינת בחוסר יכולת לנקות ריר סמיך מהריאות, מה שמוביל לזיהומים חוזרים ונשנים ולירידה בתפקוד הריאות המתקדמת, שלעתים קרובות גורמת לצורך בהשתלת ריאות או למוות. המיקרוביום דרכי הנשימה של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF) נראהלעקובאחר פעילות המחלה 1 , עם ירידה במגוון מיקרוביאלי הקשורים לתוצאות שליליות לטווח ארוך2,3. במחקרים קליניים של pwCF, טיפול בחמצן משלים קושר למחלה מתקדמת יותר4,5, אם כי באופן מסורתי, השימוש בטיפול בחמצן נתפס פשוט כסמן לחומרת המחלה6. מחקרים אחרונים מניסוי קליני של חולים עם כשל נשימתי הראו כי רמות חמצן גבוהות יותר של המטופל קשורות באופן פרדוקסלי לעלייה בזיהומים חיידקיים חמורים ותמותה גבוהה יותר7, דבר המצביע על כך שחמצן משלים עשוי לתרום לפתוגנזה של המחלה. ההשפעה של חמצן משלים על מיקרוביום הריאות סיסטיק פיברוזיס וקהילות מיקרוביות הקשורות לריאות ודמתי הנשימה לא נחקרה היטב.
לעתים קרובות לא ניתן לבצע מחקרים מכניים ישירות בנושאים אנושיים בשל קשיים לוגיסטיים וסוגיות אתיות פוטנציאליות הקשורות להתערבויות של תועלת רפואית לא ידועה או נזק. גישות תרגומיות המשלבות ביו-פיסצימנים אנושיים במערכות מודל יכולות להציע תובנות ביולוגיות חשובות במקרים אלה. בעוד היכולת להשתמש או לסבול חמצן היה באופן מסורתי מרכיב חשוב של סיווג מיקרוביאלי, מעט מאוד ידוע על איך הקדמה טיפולית של חמצן משלים לסביבה עלולה להרגיז קהילות מיקרוביות דרכי הנשימה. כדי לשפוך אור על ההשפעות הלא ידועות של חמצן משלים על המיקרוביום דרכי הנשימה של pwCF, היינו צריכים להתמודד עם שני אתגרים עיקריים; ראשית, יצירת מדיום תרבותי המהוער מבחינה פיזיולוגית את הרכב כיח CF; שנית, יצירת מערכת מודל המאפשרת שמירה על ריכוזי חמצן גבוהים בתרבות על פני פרקי זמן ממושכים.
מדיה כיח מלאכותי (ASM) נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות כיח ריאות ex vivo8,9,10, אבל אין קונצנזוס ברור על מתכון מסוים. פרוטוקול זה מתאר מתכון בינוני כיח מלאכותי ואסטרטגיית הכנה שתוכננה בקפידה כדי לתבח פיזיולוגית מ- pwCF. טבלה 1 מתארת את ערכי המתכון הנבחרים בהתבסס על ספרות שפורסמה. רכיבים כימיים בסיסיים ו- pH הותאמו לערכים שזוהו על ידי מחקרים של כיח CF אנושי11,12,13. חומרים מזינים פיזיולוגיים בריכוז נמוך נוספו באמצעות חלמון ביצה, אשר נכלל כמו 0.25% של נפח סופי10, כמו גם ויטמין ומתכת קורט מתערבב14,15. Mucin, המרכיב העיקרי של כיח16,נכלל ב 1% w / v14. למרות שעיקור מסנן אינטנסיבי יותר נבחר על פני הנוהג הקונבנציונלי יותר של עיקור חום כדי להפחית בעיות פוטנציאליות מפני denaturation הנגרמת על ידי חום של רכיבי מדיה חיוניים10. יתרון נוסף של עיקור מסנן הוא שהוא מייצר מדיה שקופה (עיקור חום יכול ליצור מדיה עכורה עקב משקעים ו קרישה של מלחים וחלבונים), ומאפשר מדיה כיח מלאכותי זה לשמש כדי לעקוב אחר צמיחה מיקרוביאלית המבוססת על עליות עכורה.
מערכת מודל זו לתרבות ההיפרוקסיקית מבוססת על טכניקות פולחן אנאירוביות שבהן מוסיפים חמצן ולא מוסרים, ויוצרים מודל להשפעת שימוש בחמצן משלים עבור pwCF. איור 1 ופרוטוקול התזת החמצן הנלווה מתארים את הרכיבים של מערכת שפיצוח חמצן, שניתן להשיג בעלות נמוכה מספקי מעבדה כלליים ומכלי בית חולים. מערכת זו מאפשרת ערבוב של חמצן דחוס ואוויר לריכוזים קבועים הנעים בין 21%-100% חמצן. השילוב של חיישן חמצן מאפשר אימות של ריכוז תערובת גז הפלט, כמו גם בדיקת הרכב גז הזרימה של בקבוקי סרום שהופצו בעבר כדי לוודא שתנאי החמצן נשמרו בטווח הרצוי.
פרוטוקול זה מתאר נהלים ליצירת מדיום כיח מלאכותי, בנייה ושימוש במערכת התזת חמצן, ויישום של שניהם על כיח CF תרבית בתנאי חמצן דיפרנציאליים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה נחשבות לשחק תפקיד חשוב בהתקדמות של סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלות ריאות כרוניות אחרות. חיידקים סווגו באופן מסורתי על סמך יכולתם להשתמש או לסבול חמצן. חמצן משלים הוא טיפול רפואי נפוץ שניתן לאנשים עם סיסטיק פיברוזיס (pwCF); עם זאת, מחקרים קיימים על חמצן ועל המיקרוביום דרכי הנשימה התמקדו באופן שבו היפוקסיה (חמצן נמוך) ולא היפרוקסיה (חמצן גבוה) משפיעה על קהילות מיקרוביות הריאות האירוביות והפקולטיביות בעיקר. כדי לטפל בפער ידע קריטי זה, פרוטוקול זה פותח באמצעות מדיום כיח מלאכותי המחקה את הרכב הליחה מ- pwCF. השימוש בעיקור מסננים, המניב מדיום שקוף, מאפשר לשיטות אופטיות לעקוב אחר הצמיחה של חיידקים חד-תאיים בתרביות השעיה. כדי ליצור תנאים היפרוקסיים, מערכת מודל זו מנצלת טכניקות פולחן אנאירובי מבוססות כדי ללמוד תנאים היפרוקסיים; במקום להסיר חמצן, חמצן מתווסף לתרבויות על ידי התכתות יומית של בקבוקי סרום עם תערובת של חמצן דחוס ואוויר. כיח מ 50 pwCF עבר סטרינג יומי לתקופה של 72 שעות כדי לאמת את היכולת של מודל זה לשמור על תנאי חמצן דיפרנציאליים. רצף מטגנומי רובה ציד בוצע על דגימות כיח מתורבתות ולא תרבותיות מ 11 pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום זה כדי לתמוך בצמיחה של חיידקים קומנסליים ופתוגניים הנפוצים בליח סיסטיק פיברוזיס. עקומות גדילה התקבלו מ 112 מבודדים שהתקבלו מ- pwCF כדי לאמת את היכולת של מדיום כיח מלאכותי זה לתמוך בצמיחה של פתוגנים סיסטיק פיברוזיס נפוצים. אנו מוצאים כי מודל זה יכול תרבות מגוון רחב של פתוגנים ו commensals כיח CF, משחזר קהילה דומה מאוד כיח לא תרבותי בתנאים נורמוקסיים, ויוצר פנוטיפים תרבות שונים בתנאי חמצן שונים. גישה חדשה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של השפעות בלתי צפויות הנגרמות על ידי שימוש בחמצן ב- pwCF על קהילות מיקרוביות בדרכי הנשימה ופתוגנים נשימתיים נפוצים.

פרוטוקולים אלה הוחלו על 50 דגימות כיח צפויות מ pwCF המציגות לטיפול שגרתי במרפאת סיסטיק פיברוזיס באשפוז בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס בבוסטון, מסצ'וסטס. הכיח של כל מטופל היה בתרבית מתחת ל-21%, 50% ו-100% בתנאי חמצן באמצעות מדיום הכיח המלאכותי, עם 0.5 מ"ל עליקוטים שנלקחו מכל תרבית ב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעו?...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

מטרת פרוטוקול זה היא לפתח מערכת מודל להשפעת היפרוקסיה על קהילות המיקרואורגניזמים של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה. מדיום כיח מלאכותי מחקה את הרכב הכיח, ותנאי התרבות ההיפרוקסית מדגימים את ההשפעות של חמצן משלים על קהילות מיקרוביות ריאות.

תכנון ופיתוח של מודל לחקר ההשפעה של חמצן משלים על המיקרוביום של סיסטיק פיברוזיס דרכי הנשימה

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

פרוטוקולים אלה נועדו לדגמן את ההשפעות במבחנה של שימוש בחמצן משלים על מיקרוביום הריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס. מתכון מדיה זה מותאם כדי לשקף את ההרכב הפיזיולוגי של כיח עבור אנשים החיים עם סיסטיק פיברוזיס. תהליך ההסתעפות מציג את היכולת לתרבות בתנאי חמצן שונים.שינויים במדיום כיח מלאכותי מאפשרים לו לחקות מחלות ריאה כרוניות אחרות ולדגמן קהילות מיקרוביות בתנאים אחרים, כגון ריכוזי גלוקוז שונים בחולי סיסטיק פיברוזיס וסוכרת בו זמנית. סקירה של השלבים להכנת בינוני כיח מלאכותי מראה את הערבוב של ASCM מוכן, ASMM ו ASBM. חיץ הסכינים משמש לתפירת ה- pH ל- 6.3 ועיקור המסנן של המדיום מתבצע בחדר קר על שייקר מסלולית.ראשית, להכין מדיום כיח מלאכותי על ידי הוספת 250 מיליליטר של ASCM לבקבוק ליטר אחד המכיל ASMM. לאחר מכן להוסיף 250 מיליליטר של ASBM לבקבוק בינוני. יש לתעד את המדיום עם מאגר טחון טוחן אחד בסיסי כדי להגיע ל-pH של 6.3 על נייר pH.יש לשמור בקירור את מדיום הליחה המלאכותי בארבע מעלות צלזיוס עד לסינון. לאחר מכן כדי להתחיל את תהליך הסינון, להעביר 200 מיליליטר של מדיום כיח מלאכותי לא מסונן למערכת סינון ואקום עם מסנן גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר. לאחר חיבור מערכת הסינון למשאבת הוואקום, הפעל את משאבת הוואקום, ולאחר מכן מניח את התא על שייקר מסלולית, רועד ב 90 סיבובים לדקה בחדר קר בארבע מעלות צלזיוס.שנה את המסנן לאחר 350 מיליליטר של בינוני מקבל מסונן כדי להתגבר על בעיית סתימה. לאחר כמות ניכרת מסוננת, ב 150 מיליליטר נוסף מדיום לסינון. חזור על סינון עם תאים נוספים עד שכל המדיה מסוננת.סקירה כללית של התזת חמצן המדגימה את התוספת של כיח המטופל למדיום כיח מלאכותי בבקבוק סרום אוטומטי. ואז לפחל את בקבוק הסרום האטום עם תערובת גז. לבסוף, בקבוק הסרום הוא דגירה כדי להשיג תרבות אלק ווטס במרווח של 24 שעות עבור רצף מטא גנומיקה הבאים.כדי להתחיל בתרבית בקבוק סרום, סמן בקבוקי סרום אוטומטית 500 מיליליטר עם מזהי מדגם, תאריך ושעה של חיסון ואחוז חמצן היעד. בשכונה ביולוגית, הוסיפו 24 מיליליטר של מדיום הכיח המלאכותי לכל בקבוק סרום שמוקם. כדי להשיג נפח מדגם מספיק עבור כל מצב תרבית, במידת הצורך, לדלל את המדגם עם תמיסת מלח חוצץ פוספט סטרילי, ואז כיח הומוגני עם מחט 18 מד ולהוסיף מיליליטר אחד של כיח המטופל לכל בקבוק סרום.לאחר מכן, באמצעות פינצטה סטרילית, מניחים את פקקי הגומי האוטומטיים על החלק העליון של כל בקבוק סרום, לוחצים על פקקי הגומי מבלי לגעת בחלק התחתון של המעצור. לאחר הסרת הבקבוקים מהמכסה המנוע, יש למרוח ולקמט את אטמי האלומיניום. מוציאים את גולת הכותרת של החותמות ומנגבים את החלק העליון של הבקבוקים עם ניגוב אלכוהול ומעבירים את אטם הבקבוק דרך להבת מבער בונזן.עכשיו לתקן מחט סטרילית, 18 מד למזרק רשימת בוכנה עם מסנן, להכניס את מזרק שחרור גז מודבק לתוך הבקבוק הראשון. עכשיו לתקן מחט סטרילית, 18 מד לפלט הגז מהמערכת ולהכניס את מחט פלט הגז לתוך הבקבוק גם כן. לנתב את צמתי T מהמיכלים דרך צג החמצן.לאחר אימות ריכוז החמצן היעד זורם דרך המערכת, היעד כחמישה ליטרים לדקה של זרימת גז. לנתב מחדש את צמתי T מהמיכלים עד לתפוקת הגז. כאשר הגז מתחיל לזרום דרך בקבוק הסרום, שימו לב למד הלחץ, ואם הלחץ עולה באופן בלתי צפוי, כבו את המערכת מיד.לאחר ריצה, חמצן לדלג דרך בקבוק הסרום במשך דקה אחת ב 5 ליטר לדקה, ההגדרות מאפשרות 10 חילופי אוויר ולהבטיח את האטמוספירה הפנימית מגיעה לריכוז הרצוי של 100%חמצן. הסר את שחרור הגז, מחט 18 מד. לאחר מתן הלחץ בבקבוק הסרום לבנות לאטמוספירה אחת, מיד להסיר את מחט פלט הגז.לדגור את בקבוקי הסרום 37 מעלות צלזיוס אינקובטור שייקר ב 150 סיבובים לדקה במשך 3, 24 שעות מרווחים. אלק ווטס נלקחים בכל מרווח של 24 שעות לניתוח במורד הזרם ודגימות מתנקמות בכל פעם. הדוגמה כאן מראה כיצד תרבות עשויה להיראות לפני ואחרי הדגירה.רמות החמצן וה-pH של היציאה נמדדו במהלך תהליך התרבות של דגימות כיח שנשמרו ב-37 מעלות צלזיוס. עם שני מרווחי התכתשות של 12 שעות ו 24 שעות, ריכוזי חמצן נשמרו בערך לאורך זמן עם ירידה מתונה בריכוז חמצן שנצפתה בכל שלושת התנאים. רמות ה-pH הנמדדות היו בטווח הפיזיולוגי ללא שינויים משמעותיים לאורך זמן.ההשוואה בין עומס מיקרוביאלי, גיוון והרכב קהילתי בין כיח לא תרבותי ותרביתי חשפה עלייה של פי 20 בעומס המיקרוביאלי בליחה בתרבית. מדדי גיוון הצביעו על שימור הרכב הקהילה עם הבדלים גלובליים מינימליים שהוצגו על ידי תהליך התרבות. ניתוח השוואתי של 120 מינים מיקרוביאליים בליחה תרבותית ולא תרבותית בוצע על ידי רצף מטא גנומי.46 מינים אלה זוהו בדגימות לא תרבותיות ומתרביתות כאחד. בעוד 35 זוהו באופן בלעדי בדגימות לא תרבותיות ו -39 זוהו באופן בלעדי בדגימות תרבותיות. עקומות גדילה מבוססות סופג נוצרו עבור פתוגנים נפוצים של ריאות CF בתרבית במדיה כיח מלאכותית מדגם המטופל מבודד תחת ריכוז חמצן נורמלי 21%.אין שינוי לאורך זמן בצפיפות האופטית ב 600 ננומטר ב ASM רק שליטה שלילית הצביעה על תרבות ללא זיהום. דפוסי עקומת הצמיחה הטיפוסיים שנצפו מצביעים על כך שניתן להשתמש במדיום ASM ליצירת עקומות צמיחה בשיטות אופטיות. הרצף המטגנומי משמש כאן לתיאור הרכב הקהילה המיקרוביאלית.טכניקות אחרות כגון רצף metatranscriptomic ניתן להשתמש כדי להעריך ביטוי גנים או מטבולומיה כדי להעריך את ייצור מטבוליט.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotopic אבי העורקים להשתלות: מודל עכברוש לחקר התפתחות vasculopathy כרונית

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

מודל הפיברוזיס Dimethylnitrosamine מושרה בחולדה

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

הרדמת Airway האקטואלית עבור Awake-אנדוסקופית אינטובציה שימוש הריסוס-as-you-go טכניקה עם זרימת חמצן גבוהה

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

מודל ראשי Trophoblast האנושי כדי לחקור את ההשפעה של דלקת הקשורות בהשמנת יתר אימהית על ויסות Autophagy את השליה

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...