Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

En del av dette arbeidet ble utført ved Marine Biological Lab med støtte fra Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (tilskuddsnummer 5600373), og en gave fra Simons Foundation.

Denne studien fikk godkjenning fra Partners Institutional Review Board (Protokoll # 2018P002934). Inklusjonskriteriet omfattet voksne pasienter med cystisk fibrose som ga skriftlig informert samtykke til studien. Det var ikke noe eksklusjonskriterium. I henhold til protokollretningslinjer ble alle sputumprøver samlet inn fra pasienter med cystisk fibrose under et planlagt poliklinisk besøk hos deres kliniske leverandør.
1. Kunstig Sputum Medium Forberedelse
MERK: M...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

I denne studien ble en in vitro-modell utviklet for å studere effekten av hyperoksia på lungemikrobielle samfunn. Denne modellen, basert på kunstig sputummedium og daglig sparging av serumflasker, opprettholder forhøyede oksygenkonsentrasjoner og støtter veksten av mikrober identifisert i sputum fra pwCF.
Det er flere kritiske trinn i denne tilnærmingen. Først er valget å bruke filtersterilisering i stedet for varmesterilisering av det kunstige sputummediet. Filtersteriliserin...

Cystisk fibrose (CF) er en genetisk sykdom preget av manglende evne til å fjerne tykt slim fra lungene, noe som fører til gjentatte infeksjoner og progressiv lungefunksjonsnedgang som ofte resulterer i behovet for lungetransplantasjon eller død. Luftveismikrobiomet til personer med cystisk fibrose (pwCF) ser ut til å spore sykdomsaktivitet1, med en reduksjon i mikrobielt mangfold forbundet med ugunstige langsiktige resultater2,3. I kliniske studier av pwCF har supplerende oksygenbehandling vært forbundet med mer avansert sykdom4,5, men tradisjonelt har bruk av oksygenbehandling blitt sett på som bare en markør for sykdoms alvorlighetsgrad6. Nyere studier fra en klinisk studie av pasienter med luftveissvikt har vist at høyere oksygennivå hos pasienter paradoksalt nok er forbundet med en økning i alvorlige bakterielle infeksjoner og høyere dødelighet7, noe som tyder på at supplerende oksygen kan bidra til sykdomspatogenese. Effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose lungemikrobiom og tilhørende lunge- og luftveismikrobielle samfunn er ikke godt studert.
Mekanistiske studier kan ofte ikke utføres direkte på mennesker på grunn av logistiske vanskeligheter og potensielle etiske problemer knyttet til intervensjoner av ukjent medisinsk nytte eller skade. Translasjonelle tilnærminger som integrerer menneskelige biospecimens i modellsystemer, kan gi viktig biologisk innsikt i disse tilfellene. Mens evnen til å bruke eller tolerere oksygen tradisjonelt har vært en viktig komponent i mikrobiell klassifisering, er det lite kjent om hvordan den terapeutiske innføringen av supplerende oksygen til miljøet kan perturb luftveis mikrobielle samfunn. For å belyse de ukjente effektene av supplerende oksygen på luftveismikrobiomene til pwCF, måtte vi ta opp to store utfordringer; for det første, opprettelsen av et kulturmedium som fysiologisk tilnærmer sammensetningen av CF sputum; For det andre, opprettelsen av et modellsystem som tillater vedlikehold av forhøyede oksygenkonsentrasjoner i kulturen over lengre perioder.
Kunstige sputummedier (ASM) er mye brukt til å etterligne lunge sputum ex vivo8,9,10, men det er ingen klar konsensus om en bestemt oppskrift. Denne protokollen beskriver en kunstig sputum medium oppskrift og forberedelse strategi nøye designet for fysiologisk omtrentlig sputum fra pwCF. Tabell 1 skisserer de valgte oppskriftsverdiene basert på publisert litteratur. Grunnleggende kjemiske komponenter og pH ble matchet med verdier identifisert av studier av human CF sputum11,12,13. Lav konsentrasjon fysiologiske næringsstoffer ble tilsatt ved hjelp av eggeplomme, som ble inkludert som 0,25% av det endelige volumet10, samt vitamin- og spormetallblandinger14,15. Mucin, nøkkelkomponenten i sputum16, ble inkludert ved 1% m/ v14. Selv om det var mer arbeidskrevende, ble filtersterilisering valgt over den mer konvensjonelle praksisen med varmesterilisering for å redusere potensielle problemer fra varmeindusert denaturering av essensielle mediekomponenter10. En ekstra fordel med filtersterilisering er at den genererer medier som er gjennomsiktige (varmesterilisering kan skape uklare medier på grunn av nedbør og koagulasjon av salter og proteiner), slik at dette kunstige sputummediet kan brukes til å følge mikrobiell vekst basert på økning i turbiditet.
Dette modellsystemet for den hyperoksiske kulturen er basert på anaerobe kultiveringsteknikker der oksygen tilsetts i stedet for å fjernes, og skaper en modell for effekten av supplerende oksygenbruk for pwCF. Figur 1 og den tilhørende oksygensparingsprotokollen skisserer komponentene i et oksygensparingssystem, som kan oppnås til lave kostnader fra generelle laboratorie- og sykehusleverandører. Dette systemet gjør det mulig å blande trykkoksygen og luft til faste konsentrasjoner fra 21% -100% oksygen. Integreringen av en oksygensensor gjør det mulig å verifisere konsentrasjonen av utgangsgassblandingen, samt sjekke utstrømningsgasssammensetningen til tidligere sparte serumflasker for å bekrefte at oksygenforholdene er opprettholdt innenfor ønsket område.
Denne protokollen skisserer prosedyrer for å skape et kunstig sputummedium, bygging og bruk av et oksygensparingssystem, og anvendelsen av både til kultur CF sputum under differensial oksygenforhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Luftveis mikrobielle samfunn antas å spille en viktig rolle i utviklingen av cystisk fibrose (CF) og andre kroniske lungesykdommer. Mikrober har tradisjonelt blitt klassifisert basert på deres evne til å bruke eller tolerere oksygen. Supplerende oksygen er en vanlig medisinsk terapi administrert til personer med cystisk fibrose (pwCF); Imidlertid har eksisterende studier på oksygen og luftveismikrobiomet fokusert på hvordan hypoksi (lavt oksygen) i stedet for hyperoksi (høyt oksygen) påvirker de overveiende aerobe og fakultets anaerobe lungemikrobielle samfunnene. For å løse dette kritiske kunnskapsgapet ble denne protokollen utviklet ved hjelp av et kunstig sputummedium som etterligner sammensetningen av sputum fra pwCF. Bruken av filtersterilisering, som gir et gjennomsiktig medium, gjør det mulig for optiske metoder å følge veksten av encellede mikrober i suspensjonskulturer. For å skape hyperoksiske forhold utnytter dette modellsystemet etablerte anaerobe kultiveringsteknikker for å studere hyperoksiske forhold; I stedet for å fjerne oksygen, tilsetter oksygen til kulturer ved daglig sparring av serumflasker med en blanding av trykkoksygen og luft. Sputum fra 50 pwCF gjennomgikk daglig sparring i en 72-timers periode for å verifisere denne modellens evne til å opprettholde differensialoksygenforhold. Hagle metagenomisk sekvensering ble utført på kultiverte og ukulturerte sputumprøver fra 11 pwCF for å verifisere dette mediets evne til å støtte veksten av kommensale og patogene mikrober som vanligvis finnes i cystisk fibrose sputum. Vekstkurver ble oppnådd fra 112 isolasjoner hentet fra pwCF for å verifisere evnen til dette kunstige sputummediet for å støtte veksten av vanlige cystiske fibrosepatogener. Vi finner at denne modellen kan dyrke et bredt utvalg av patogener og commensals i CF sputum, gjenoppretter et samfunn som ligner sterkt på ukulturert sputum under normoksiske forhold, og skaper forskjellige kulturfenotyper under varierende oksygenforhold. Denne nye tilnærmingen kan føre til en bedre forståelse av uforutsiktede effekter forårsaket av bruk av oksygen i pwCF på luftveis mikrobielle samfunn og vanlige respiratoriske patogener.

Disse protokollene ble brukt på 50 ekspektorerte sputumprøver fra pwCF som presenterte for rutinemessig behandling til en poliklinisk cystisk fibroseklinikk ved Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Hver pasients sputum ble dyrket under 21%, 50% og 100% oksygenforhold ved hjelp av det kunstige sputummediet, med 0,5 ml aliquots tatt fra hver kultur ved 24 timer, 48 timer og 72 timers kulturtid for testing. Kulturer ble fotografert da det ble gjort ekstraksjoner for å spore visuelle endringer. I tilleg...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Målet med denne protokollen er å utvikle et modellsystem for effekten av hyperoksia på cystiske fibrose luftveismikrobielle samfunn. Kunstig sputummedium emulerer sammensetningen av sputum, og hyperoksiske kulturforhold modellerer effekten av supplerende oksygen på lungemikrobielle samfunn.

Design og utvikling av en modell for å studere effekten av supplerende oksygen på cystisk fibrose luftveismikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Disse protokollene er designet for å modellere in vitro-effektene av supplerende oksygenbruk på lungemikrobiomet til cystiske fibrosepasienter. Denne medieoppskriften er skreddersydd for å speile den fysiologiske sammensetningen av sputum for personer som lever med cystisk fibrose. Spargingsprosessen introduserer evnen til kultur under forskjellige oksygenforhold.Endringer i kunstig sputum medium tillater det å etterligne andre kroniske lungesykdommer og modellere mikrobielle samfunn under andre forhold, for eksempel forskjellige glukosekonsentrasjoner hos samtidig cystisk fibrose og diabetespasienter. En oversikt over trinnene for kunstig sputum medium forberedelse viser blandingen av den tilberedte ASCM, ASMM og ASBM. Mopsbufferen brukes til å titere pH til 6,3 og filtersterilisering av mediet utføres i et kaldt rom på en orbital shaker.Til å begynne med, lag et kunstig sputummedium ved å legge til 250 milliliter ASCM til den ene literflasken som inneholder ASMM. Tilsett deretter 250 milliliter ASBM til den mellomstore flasken. Titer mediet med en grunnleggende molarmopsbuffer for å nå en pH på 6,3 på et pH-papir.Kjøl det kunstige sputummediet ved fire grader Celsius til filtrering. Deretter overfører du 200 milliliter ufiltrert kunstig sputummedium til et vakuumfiltreringssystem med et 0,22 mikrometer porestørrelsesfilter for å starte filtreringsprosessen. Etter å ha koblet filtreringssystemet til vakuumpumpen, slå på vakuumpumpen, plasser deretter kammeret på en orbital shaker, rist på 90 rotasjoner per minutt i et kaldt rom ved fire grader Celsius.Bytt filter etter at 350 milliliter medium blir filtrert for å overvinne tilstoppingsproblemet. Etter at en betydelig mengde er filtrert, med et ekstra 150 milliliter medium for filtrering. Gjenta filtreringen med flere kamre til alle mediene er filtrert.Oversikt over oksygensparing som viser tilsetning av pasientsputum til kunstig sputummedium i en autoklavert serumflaske. Sparge deretter den forseglede serumflasken med en gassblanding. Til slutt inkuberes serumflasken for å oppnå kultur Alec Watts med 24-timers intervallet for påfølgende metagenomisk sekvensering.For å starte sparring av serumflaskekulturen, merk 500 milliliter autoklavede serumflasker med prøveidentifikatorer, dato og klokkeslett for inokulering og måloksygenprosent. I en biologisk hette legger du til 24 milliliter av det kunstige sputummediet til hver serumflaske som settes opp. For å oppnå tilstrekkelig prøvevolum for hver kulturtilstand, om nødvendig, fortynn prøven med steril fosfatbufret saltvann, deretter homogenisert sputum med en 18 gauge nål og tilsett en milliliter pasientsputum til hver serumflaske.Deretter, ved hjelp av sterile pinsett, plasser de autoklavede gummiproppene på toppen av hver serumflaske, trykk ned gummiproppene uten å berøre undersiden av stopperen. Etter å ha fjernet flaskene fra hetten, påfør og krymp aluminiumstetningene. Fjern midtpunktet i tetningene og tørk av toppen av flaskene med en alkoholserviett og før flasketetningen gjennom en Bunsen brennerflamme.Fest nå en steril, 18 gauge nål til en stempellistesprøyte med et filter, sett den festet gassutløsningssprøyten inn i flasken først. Fest nå en steril nål på 18 gauge til gassutgangen fra systemet og sett gassutgangsnålen inn i flasken også. Før T-kryssene fra tankene gjennom oksygenmonitoren.Etter å ha bekreftet måloksygenkonsentrasjonen som strømmer gjennom systemet, mål omtrent fem liter per minutt gassstrøm. Omruting av T-kryssene fra tankene til gassutgangen. Når gassen begynner å strømme gjennom serumflasken, vær oppmerksom på trykkmåleren, og hvis trykket øker uventet, slå av systemet umiddelbart.Etter å ha løpt, sparrer oksygen gjennom serumflasken i ett minutt på fem liter per minutt, innstillingene tillater 10 luftutvekslinger og sikrer at den indre atmosfæren når ønsket konsentrasjon på 100% oksygen. Fjern gassutløsningen, 18 gauge nål. Etter å ha tillatt trykket i serumflasken å bygge til en atmosfære, fjern straks gassutgangsnålen.Inkuber serumflaskene i 37 grader Celsius inkubator shaker ved 150 rotasjoner per minutt i 3, 24 timers intervaller. Alec Watts tas ved hvert 24-timers intervall for nedstrømsanalyse og prøver lagres på nytt hver gang. Eksemplet her viser hvordan en kultur kan se ut før og etter inkubasjon.Utstrømningsoksygen- og pH-nivåene ble målt i løpet av kulturprosessen for sputumprøver opprettholdt ved 37 grader Celsius. Med både sparsommelige intervaller på 12 timer og 24 timer ble oksygenkonsentrasjonene omtrent opprettholdt over tid med et moderat fall i oksygenkonsentrasjonen observert for alle tre forholdene. De målte pH-nivåene var innenfor det fysiologiske området uten signifikante endringer over tid.Sammenligningen av mikrobiell belastning, mangfold og samfunnssammensetning mellom ukulturert og kultivert sputum viste en 20 ganger økning i mikrobiell belastning i dyrket sputum. Mangfoldsmålinger indikerte bevaring av fellesskapssammensetning med minimale globale forskjeller introdusert av kulturprosessen. Komparativ analyse av de 120 mikrobielle artene i kultivert og ukulturert sputum ble utført ved metagenomisk sekvensering.46 av disse artene ble identifisert i både ukulturerte og kultiverte prøver. Mens 35 utelukkende ble identifisert i ukulturerte prøver og 39 utelukkende ble identifisert i kultiverte prøver. Absorberende baserte vekstkurver ble generert for vanlige CF-lungepatogener dyrket i kunstige sputummedier fra pasientprøveisolasjoner under normal 21% oksygenkonsentrasjon.Ingen endring over tid i den optiske tettheten ved 600 nanometer i ASM bare negativ kontroll indikerte forurensningsfri kultur. De typiske vekstkurvemønstrene som observeres indikerer at ASM-medium kan brukes til generering av vekstkurver ved hjelp av optiske metoder. Den metagenomiske sekvenseringen brukes her for å beskrive mikrobiell samfunnssammensetning.Andre teknikker som metatranscriptomisk sekvensering kan brukes til å evaluere genuttrykk eller metabolomics for å evaluere metabolittproduksjon.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkører i en dyremodell for Avslører Neural, Hematologic, og Behavioral korrelerer av PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Den Dimethylnitrosamine indusert leverfibrose Model i Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Aktuelt Airway Anestesi for Awake-endoskopisk Intubasjon Bruke Spray-as-you-go Teknikk med høy Oxygen Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

En primær menneskelige Trophoblast modell å studere effekten av betennelse forbundet med mors overvekt på regulering av Autophagy i morkaken

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generering av menneskelig nese tarmepitelet Spheroids for individualisert cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...