Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Parte deste trabalho foi realizado no Laboratório Biológico Marinho com apoio do Laboratório Biológico Marinho, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (número de subvenção 5600373) e um presente da Fundação Simons.

Este estudo recebeu aprovação do Conselho de Revisão Institucional de Parceiros (Protocolo nº 2018P002934). O critério de inclusão incluiu pacientes adultos com fibrose cística que forneceram consentimento por escrito informado para o estudo. Não houve critério de exclusão. De acordo com as diretrizes do protocolo, todas as amostras de escarro foram coletadas de pacientes com fibrose cística durante uma visita ambulatorial agendada com seu provedor clínico.
1. Preparação média art...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

Neste estudo, desenvolveu-se um modelo in vitro para estudar o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas pulmonares. Este modelo, baseado na escarro artificial média e diária de garrafas de soro, mantém concentrações elevadas de oxigênio e suporta o crescimento de micróbios identificados em escarro da pwCF.
Há várias etapas críticas dessa abordagem. Primeiro é a escolha de usar a esterilização do filtro em vez da esterilização térmica do meio de escarro artificia...

A fibrose cística (CF) é uma doença genética caracterizada pela incapacidade de limpar muco espesso dos pulmões, levando a infecções repetidas e declínio da função pulmonar progressiva que muitas vezes resulta na necessidade de transplante de pulmão ou morte. O microbioma das vias aéreas de pessoas com fibrose cística (pwCF) parece acompanhar a atividade da doença1, com redução da diversidade microbiana associada a desfechos adversos a longo prazo2,3. Em estudos clínicos da PWCF, a oxigenoterapia suplementar tem sido associada a uma doença mais avançada4,5, embora tradicionalmente, o uso de oxigenoterapia tenha sido visto como simplesmente um marcador para a gravidade da doença6. Estudos recentes de um estudo clínico de pacientes com insuficiência respiratória mostraram que níveis mais altos de oxigênio do paciente estão paradoxalmente associados a um aumento de infecções bacterianas graves e maior mortalidade7,sugerindo que o oxigênio suplementar pode contribuir para a patogênese da doença. O efeito do oxigênio suplementar no microbioma pulmonar da fibrose cística e nas comunidades microbianas pulmonares e aéreas associadas não tem sido bem estudado.
Estudos mecanicistas muitas vezes não podem ser realizados diretamente em seres humanos devido a dificuldades logísticas e potenciais questões éticas associadas a intervenções de benefício ou dano médico desconhecido. Abordagens translacionais que integram bioespégios humanos em sistemas de modelos podem oferecer importantes insights biológicos nesses casos. Embora a capacidade de usar ou tolerar oxigênio tenha sido tradicionalmente um componente importante da classificação microbiana, pouco se sabe sobre como a introdução terapêutica de oxigênio suplementar ao meio ambiente pode perturbar as comunidades microbianas das vias aéreas. Para lançar luz sobre os efeitos desconhecidos do oxigênio suplementar nos microbiomas das vias aéreas da PWCF, precisávamos enfrentar dois grandes desafios; primeiro, a criação de um meio de cultura que se aproxima fisiologicamente da composição do escarro CF; segundo, a criação de um sistema modelo que permita a manutenção de concentrações elevadas de oxigênio na cultura por longos períodos de tempo.
Asm (Artificial sputum media, mídia artificial) são amplamente utilizados para emular escarro pulmonar ex vivo8,9,10, mas não há um consenso claro sobre uma receita específica. Este protocolo descreve uma receita média de escarro artificial e estratégia de preparação cuidadosamente projetada para se aproximar fisiologicamente da pwCF. A Tabela 1 descreve os valores da receita escolhida com base na literatura publicada. Componentes químicos básicos e pH foram combinados com valores identificados por estudos de espiato de CF humano11,12,13. Foram adicionados nutrientes fisiológicos de baixa concentração utilizando-se gema de ovo, que foi incluída em 0,25% do volume final10,bem como misturas de vitamina e metal trace14,15. A mucina, o componente-chave da escarro16,foi incluída em 1% c/v14. Embora mais trabalhosa, a esterilização do filtro foi escolhida sobre a prática mais convencional de esterilização térmica para reduzir problemas potenciais da desnaturação induzida pelo calor dos componentes essenciais da mídia10. Um benefício adicional da esterilização do filtro é que ele gera mídia transparente (a esterilização de calor pode criar mídia turva devido à precipitação e coagulação de sais e proteínas), permitindo que essa mídia artificial de escarro seja usada para acompanhar o crescimento microbiano com base no aumento da turbidez.
Este sistema modelo para a cultura hiperóxica é baseado em técnicas de cultivo anaeróbica onde o oxigênio é adicionado em vez de removido, criando um modelo para o efeito do uso de oxigênio suplementar para pwCF. A Figura 1 e o protocolo de sparging de oxigênio associados descrevem os componentes de um sistema de sparging de oxigênio, que pode ser obtido a baixo custo de fornecedores gerais de laboratórios e hospitais. Este sistema permite a mistura de oxigênio comprimido e ar para concentrações fixas que variam de 21%a 100% de oxigênio. A integração de um sensor de oxigênio permite a verificação da concentração da mistura de gás de saída, bem como verificar a composição do gás de saída de garrafas de soro previamente espaçadas para verificar se as condições de oxigênio foram mantidas dentro da faixa desejada.
Este protocolo descreve procedimentos para criar um meio de escarro artificial, a construção e o uso de um sistema de sparging de oxigênio, e a aplicação de ambos para cultura de escarro CF em condições diferenciais de oxigênio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Acredita-se que as comunidades microbianas das vias aéreas desempenham um papel importante na progressão da fibrose cística (CF) e outras doenças pulmonares crônicas. Micróbios têm sido tradicionalmente classificados com base em sua capacidade de usar ou tolerar oxigênio. O oxigênio suplementar é uma terapia médica comum administrada a pessoas com fibrose cística (pwCF); no entanto, estudos existentes sobre oxigênio e microbioma das vias aéreas têm se concentrado em como a hipóxia (baixo oxigênio) em vez de hiperoxia (alto oxigênio) afeta as comunidades microbianas pulmonares aeróbicas e facultativas predominantemente aeróbicas e facultativas. Para resolver essa lacuna de conhecimento crítico, este protocolo foi desenvolvido utilizando um meio de escarro artificial que imita a composição da escarro da pwCF. O uso da esterilização do filtro, que produz um meio transparente, permite que métodos ópticos acompanhem o crescimento de micróbios unicelulares em culturas de suspensão. Para criar condições hiperóxiicas, esse sistema modelo aproveita técnicas de cultivo anaeróbicas estabelecidas para estudar condições hiperóxiis; em vez de remover oxigênio, o oxigênio é adicionado às culturas por meio de uma mistura diária de garrafas de soro com uma mistura de oxigênio comprimido e ar. A sputum de 50 pwCF passou por uma sparging diária por um período de 72h para verificar a capacidade deste modelo de manter condições diferenciais de oxigênio. O sequenciamento metagenômico da espingarda foi realizado em amostras de escarro cultivadas e não cultivadas de 11 pwCF para verificar a capacidade deste meio de suportar o crescimento de micróbios commensais e patogênicos comumente encontrados em escarro de fibrose cística. As curvas de crescimento foram obtidas a partir de 112 isolados obtidos da PwCF para verificar a capacidade deste meio de escarro artificial para apoiar o crescimento de patógenos comuns de fibrose cística. Descobrimos que este modelo pode cultivar uma grande variedade de patógenos e commensais na escória CF, recupera uma comunidade altamente semelhante à escória não cultivada sob condições normóxias, e cria diferentes fenótipos de cultura em condições variadas de oxigênio. Essa nova abordagem pode levar a uma melhor compreensão dos efeitos imprevistos induzidos pelo uso de oxigênio em pwCF em comunidades microbianas das vias aéreas e patógenos respiratórios comuns.

Esses protocolos foram aplicados a 50 amostras de escarro esperados da PWCF apresentando cuidados de rotina para uma clínica de fibrose cística ambulatorial no Massachusetts General Hospital em Boston, Massachusetts. A escarro de cada paciente foi cultivada abaixo de 21%, 50% e 100% de oxigênio usando o meio de escarro artificial, com alíquotas de 0,5 mL tiradas de cada cultura às 24h, 48h e 72h de tempo de cultura para testes. As culturas foram fotografadas quando foram feitas extrações para acompanhar as mudanç...

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Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

O objetivo deste protocolo é desenvolver um sistema modelo para o efeito da hiperoxia nas comunidades microbianas da fibrose cística. O meio de escarro artificial emula a composição da escarro, e as condições de cultura hiperóxica modelam os efeitos do oxigênio suplementar nas comunidades microbianas pulmonares.

Projeto e Desenvolvimento de um Modelo para Estudar o Efeito do Oxigênio Suplementar no Microbioma da Fibrose Cística

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Estes protocolos são projetados para modelar os efeitos in vitro do uso de oxigênio suplementar no microbioma pulmonar de pacientes com fibrose cística. Esta receita de mídia é feita sob medida para espelhar a composição fisiológica da escarro para pessoas que vivem com fibrose cística. O processo de sparging introduz a capacidade de cultura em diferentes condições de oxigênio.Alterações no meio de escarro artificial permitem imitar outras doenças pulmonares crônicas e modelar comunidades microbianas em outras condições, como diferentes concentrações de glicose em pacientes concomitantes de fibrose cística e diabetes. Uma visão geral das etapas para preparação média de escarro artificial mostra a mistura do ASCM, ASMM e ASBM preparados. O tampão de esfregões é usado para titular o pH a 6,3 e filtrar a esterilização do meio é realizada em uma sala fria em um agitador orbital.Para começar, prepare um meio de escarro artificial adicionando 250 mililitros de ASCM ao frasco de um litro contendo ASMM. Em seguida, adicione 250 mililitros de ASBM à garrafa média. Titula o meio com um tampão de esfregões molar básico para atingir um pH de 6,3 em um papel pH.Leve à geladeira o meio de escarro artificial a quatro graus Celsius até a filtragem. Em seguida, para iniciar o processo de filtragem, transfira 200 mililitros de meio de escarro artificial não filtrado para um sistema de filtragem de vácuo com um filtro de tamanho de poros de 0,22 micrômetros. Depois de conectar o sistema de filtragem à bomba de vácuo, ligue a bomba de vácuo e coloque a câmara em um agitador orbital, tremendo a 90 rotações por minuto em uma sala fria a quatro graus Celsius.Altere o filtro depois que 350 mililitros de meio são filtrados para superar o problema do entupimento. Depois que uma quantidade considerável é filtrada, em um meio extra de 150 mililitros para filtração. Repita a filtragem com câmaras adicionais até que toda a mídia seja filtrada.Visão geral da espaçamento de oxigênio demonstrando a adição de escarro do paciente ao meio de escarro artificial em uma garrafa de soro autoclaved. Em seguida, esparge a garrafa de soro selada com uma mistura de gás. Finalmente, a garrafa de soro é incubada para obter cultura Alec Watts no intervalo de 24 horas para sequenciamento meta genômico subsequente.Para iniciar a cultura da garrafa de soro, rotule garrafas de soro autoclaved de 500 mililitros com identificadores de amostras, data e hora da inoculação e porcentagem de oxigênio alvo. Em um capô biológico, adicione 24 mililitros do meio de escarro artificial a cada garrafa de soro que está sendo configurada. Para obter um volume amostral suficiente para cada condição de cultura, se necessário, diluir a amostra com soro fisco estéril tamponado, em seguida, escória homogeneizada com uma agulha de calibre 18 e adicionar um mililitro da escarro do paciente a cada garrafa de soro.Em seguida, usando pinças estéreis, coloque as rolhas de borracha autoclaved na parte superior de cada garrafa de soro, pressione as rolhas de borracha sem tocar na parte inferior da rolha. Depois de retirar as garrafas do capô, aplique e amasse as vedações de alumínio. Retire a peça central das focas e limpe a parte superior das garrafas com um lenço de álcool e passe o selo da garrafa através de uma chama de queimador Bunsen.Agora conserte uma agulha estéril de calibre 18 em uma seringa de lista de êmbolo com um filtro, insira a seringa de liberação de gás afixado na garrafa primeiro. Agora conserte uma agulha estéril de calibre 18 na saída de gás do sistema e insira a agulha de saída de gás no frasco também. Encaminhe as junções T dos tanques através do monitor de oxigênio.Após verificar a concentração de oxigênio alvo que flui através do sistema, o alvo é de aproximadamente cinco litros por minuto de fluxo de gás. Redirecione as junções T dos tanques até a saída de gás. À medida que o gás começa a fluir através do frasco de soro, preste muita atenção ao medidor de pressão, e se a pressão aumentar inesperadamente, desligue o sistema imediatamente.Após a execução, o oxigênio atravessa a garrafa de soro por um minuto a cinco litros por minuto, as configurações permitem 10 trocas de ar e garantem que a atmosfera interna atinja a concentração desejada de 100% de oxigênio. Remova a liberação de gás, agulha calibre 18. Depois de permitir que a pressão no frasco de soro se acumule em uma atmosfera, remova imediatamente a agulha de saída de gás.Incubar as garrafas de soro em 37 graus Celsius de agitação da incubadora a 150 rotações por minuto durante intervalos de 3, 24 horas. Alec Watts são tomados a cada intervalo de 24 horas para análise a jusante e as amostras são ressarcidos cada vez. O exemplo aqui mostra como uma cultura pode parecer antes e depois da incubação.Os níveis de oxigênio e pH de saída foram medidos ao longo do processo de cultura para amostras de escarro mantidas a 37 graus Celsius. Com intervalos de 12 horas e 24 horas, as concentrações de oxigênio foram aproximadamente mantidas ao longo do tempo com uma queda moderada na concentração de oxigênio observada para as três condições. Os níveis de pH medidos estavam dentro da faixa fisiológica, sem alterações significativas ao longo do tempo.A comparação da carga microbiana, diversidade e composição comunitária entre escarro não cultivado e cultivado revelou um aumento de 20 vezes na carga microbiana em escarro cultivado. Métricas de diversidade indicaram preservação da composição comunitária com diferenças globais mínimas introduzidas pelo processo cultural. A análise comparativa das 120 espécies microbianas em esputo cultivado e não cultivado foi realizada por sequenciamento meta genômico.46 dessas espécies foram identificadas em amostras não cultivadas e cultivadas. Enquanto 35 foram identificados exclusivamente em amostras não cultivadas e 39 foram identificados exclusivamente em amostras cultivadas. Curvas de crescimento baseadas em absorventes foram geradas para patógenos pulmonares cf comuns cultivados em mídia de escarro artificial a partir de isolados de amostra de pacientes sob concentração normal de oxigênio de 21%.Nenhuma alteração ao longo do tempo na densidade óptica em 600 nanômetros no ASM apenas o controle negativo indicou cultura livre de contaminação. Os padrões típicos de curva de crescimento observados indicando que o meio ASM pode ser usado para a geração de curvas de crescimento usando métodos ópticos. O sequenciamento metagenômico é usado aqui para descrever a composição da comunidade microbiana.Outras técnicas como sequenciamento metatranscriômico podem ser usadas para avaliar a expressão genética ou metabolômica para avaliar a produção metabólica.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Transplante ortotópico de aorta: um modelo de rato para estudar o desenvolvimento de vasculopatia crônica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Medicina

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

A fibrose do fígado Modelo dimetilnitrosamina induzida no Rato

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Tópica das vias aéreas Anestesia para intubação acordada-endoscópica Usando o Spray-as-you-go Técnica com fluxo de oxigênio elevado

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Geração de células epiteliais nasais humanas esferoides para individualizado fibrose cística condutância transmembrana regulador estudo

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...