Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

En del av detta arbete utfördes på Marine Biological Lab med stöd från Marine Biological Lab, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (bidragsnummer 5600373) och en gåva från Simons Foundation.

Denna studie fick godkännande från Partners Institutional Review Board (protokoll # 2018P002934). Inklusionskriteriumet inkluderade vuxna patienter med cystisk fibros som gav skriftligt informerat samtycke till studien. Det fanns inget uteslutningskriterium. Enligt protokoll riktlinjer samlades alla sputum prover från patienter med cystisk fibros under ett planerat öppenvårdsbesök med sin kliniska leverantör.
1. Konstgjord Sputum Medium Förberedelse
OBS: De kv...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

I denna studie utvecklades en in vitro-modell för att studera effekten av hyperoxia på lungmikrobiella samhällen. Denna modell, baserad på artificiell sputum medium och daglig sparning av serumflaskor, upprätthåller förhöjda syrekoncentrationer och stöder tillväxten av mikrober som identifierats i sputum från pwCF.
Det finns flera kritiska steg i detta tillvägagångssätt. Först är valet att använda filtersterilisering snarare än värmesterilisering av det konstgjorda ...

Cystisk fibros (CF) är en genetisk sjukdom som kännetecknas av en oförmåga att rensa tjock slem från lungorna, vilket leder till upprepade infektioner och progressiv lungfunktionsnedgång som ofta resulterar i behovet av lungtransplantation eller död. Luftvägsmikrobiomet hos personer med cystisk fibros (pwCF) verkar spåra sjukdomsaktivitet1, med en minskning av mikrobiell mångfald i samband med negativa långsiktiga resultat2,3. I kliniska studier av pwCF har kompletterande syreterapi associerats med mer avancerad sjukdom4,5, men traditionellt har användningen av syreterapi setts som helt enkelt en markör för sjukdomens svårighetsgrad6. Nyligen genomförda studier från en klinisk studie av patienter med andningssvikt har visat att högre patientens syrenivåer paradoxalt nog är förknippade med en ökning av allvarliga bakterieinfektioner och högre dödlighet7, vilket tyder på att extra syre kan bidra till sjukdomspatogenes. Effekten av extra syre på cystisk fibros lung mikrobiom och tillhörande lung- och luftvägarna mikrobiella samhällen har inte studerats väl.
Mekanistiska studier kan ofta inte utföras direkt på mänskliga ämnen på grund av logistiska svårigheter och potentiella etiska frågor i samband med interventioner av okänd medicinsk nytta eller skada. Translationella metoder som integrerar mänskliga biospecimens i modellsystem kan erbjuda viktiga biologiska insikter i dessa fall. Medan förmågan att använda eller tolerera syre traditionellt har varit en viktig komponent i mikrobiell klassificering, är lite känt om hur den terapeutiska introduktionen av extra syre till miljön kan störa luftvägarna mikrobiella samhällen. För att belysa de okända effekterna av extra syre på pwCF:s luftvägsmikrobiomer behövde vi ta itu med två stora utmaningar. För det första skapandet av ett odlingsmedium som fysiologiskt approximerar sammansättningen av CF sputum; För det andra, skapandet av ett modellsystem som gör det möjligt att upprätthålla förhöjda syrekoncentrationer i kulturen under längre tidsperioder.
Konstgjorda sputum media (ASM) används ofta för att efterlikna lung sputum ex vivo8,9,10, men det finns ingen tydlig konsensus om ett specifikt recept. Detta protokoll beskriver en konstgjord sputum medium recept och beredning strategi noggrant utformad för fysiologiskt approximim sputum från pwCF. I tabell 1 beskrivs de valda receptvärdena baserat på publicerad litteratur. Grundläggande kemiska komponenter och pH matchades med värden som identifierats genom studier av human CF sputum11,12,13. Låg koncentration fysiologiska näringsämnen tillsattes med äggula, som inkluderades som 0,25% av den slutliga volymen10, liksom vitamin och spårmetallblandningar14,15. Mucin, nyckelkomponenten i sputum16, inkluderades vid 1% w/v14. Även om det var mer arbetsintensivt valdes filtersterilisering över den mer konventionella metoden med värmesterilisering för att minska potentiella problem från värmeinducerad denaturering av väsentliga mediekomponenter10. En ytterligare fördel med filtersterilisering är att det genererar media som är transparenta (värmesterilisering kan skapa grumliga medier på grund av utfällning och koagulering av salter och proteiner), vilket gör att detta konstgjorda sputummedium kan användas för att följa mikrobiell tillväxt baserat på ökningar av grumlighet.
Detta modellsystem för den hyperoxiska kulturen är baserat på anaeroba odlingstekniker där syre tillsätts snarare än avlägsnas, vilket skapar en modell för effekten av kompletterande syreanvändning för pwCF. Figur 1 och det tillhörande syresparningsprotokollet beskriver komponenterna i ett syresparsystem, som kan erhållas till låg kostnad från allmänna laboratorie- och sjukhusleverantörer. Detta system möjliggör blandning av komprimerat syre och luft till fasta koncentrationer som sträcker sig från 21%-100% syre. Integreringen av en syresensor möjliggör verifiering av koncentrationen av utgångsgasblandningen, samt kontroll av utflödesgassammansättningen hos tidigare spargade serumflaskor för att verifiera att syreförhållandena har hållits inom önskat intervall.
Detta protokoll beskriver förfaranden för att skapa ett artificiellt sputum medium, konstruktion och användning av ett syre sparging system, och tillämpningen av båda att odla CF sputum under differentiella syreförhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Luftvägarna mikrobiella samhällen tros spela en viktig roll i utvecklingen av cystisk fibros (CF) och andra kroniska lungsjukdomar. Mikrober har traditionellt klassificerats baserat på deras förmåga att använda eller tolerera syre. Extra syre är en vanlig medicinsk terapi som ges till personer med cystisk fibros (pwCF); Befintliga studier på syre och luftvägsmikrobiomet har dock fokuserat på hur hypoxi (lågt syre) snarare än hyperoxi (högt syre) påverkar de övervägande aeroba och fakultetsmässiga anaeroba lungmikrobiella samhällena. För att ta itu med denna kritiska kunskapslucka utvecklades detta protokoll med hjälp av ett artificiellt sputum medium som efterliknar sammansättningen av sputum från pwCF. Användningen av filtersterilisering, som ger ett transparent medium, gör det möjligt för optiska metoder att följa tillväxten av encelliga mikrober i suspensionskulturer. För att skapa hyperoxiska förhållanden utnyttjar detta modellsystem etablerade anaeroba odlingstekniker för att studera hyperoxiska förhållanden; Istället för att avlägsna syre tillsätts syre till kulturer genom daglig sparning av serumflaskor med en blandning av komprimerat syre och luft. Sputum från 50 pwCF genomgick daglig sparging under en 72-h period för att verifiera förmågan hos denna modell att upprätthålla differentiella syreförhållanden. Hagelgevär metagenomisk sekvensering utfördes på odlade och uncultured sputum prover från 11 pwCF att verifiera förmågan hos detta medium att stödja tillväxten av commensal och patogena mikrober som ofta finns i cystisk fibros sputum. Tillväxt kurvor erhölls från 112 isolat erhålls från pwCF att verifiera förmågan hos detta konstgjorda sputum medium att stödja tillväxten av gemensamma cystisk fibros patogener. Vi finner att denna modell kan odla en mängd olika patogener och commensals i CF sputum, återhämtar ett samhälle som mycket liknar uncultured sputum under normoxic villkor, och skapar olika kultur fenotyper under varierande syre villkor. Detta nya tillvägagångssätt kan leda till en bättre förståelse av oförutsedda effekter som orsakas av användning av syre i pwCF på luftvägarna mikrobiella samhällen och gemensamma luftvägarna patogener.

Dessa protokoll tillämpades på 50 expectorated sputum prover från pwCF presenterar för rutinmässig vård till en öppenvården cystisk fibros klinik vid Massachusetts General Hospital i Boston, Massachusetts. Varje patients sputum odlades under 21%, 50% och 100% syre villkor med hjälp av konstgjorda sputum medium, med 0,5 mL alikvoter tas från varje kultur vid 24 h, 48 h och 72 h kultur tid för testning. Kulturer fotograferades när extraktioner gjordes för att spåra visuella förändringar. Dessutom togs en 0,...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Målet med detta protokoll är att utveckla ett modellsystem för effekten av hyperoxia på cystisk fibros luftvägarna mikrobiella samhällen. Konstgjorda sputum medium efterliknar sammansättningen av sputum, och hyperoxic kultur villkor modellera effekterna av kompletterande syre på lung mikrobiella samhällen.

Design och utveckling av en modell för att studera effekten av extra syre på cystisk fibros luftvägsmikrobiomet

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Dessa protokoll är utformade för att modellera in vitro effekter av kompletterande syre användning på lung mikrobiomet av cystisk fibros patienter. Detta medierecept är skräddarsytt för att spegla sputumets fysiologiska sammansättning för personer som lever med cystisk fibros. Sparningsprocessen introducerar förmågan att odla under olika syreförhållanden.Förändringar i artificiellt sputummedium gör det möjligt att efterlikna andra kroniska lungsjukdomar och modellera mikrobiella samhällen under andra förhållanden, såsom olika glukoskoncentrationer hos samtidig cystisk fibros och diabetespatienter. En översikt över stegen för artificiell sputum medium förberedelse visar blandningen av den beredda ASCM, ASMM och ASBM. Mopsbufferten används för att titrera pH till 6,3 och filtersterilisering av mediet utförs i ett kallt rum på en orbital shaker.Till att börja med, förbered ett artificiellt sputummedium genom att lägga till 250 milliliter ASCM till en literflaska som innehåller ASMM. Tillsätt sedan 250 ml ASBM till mediumflaskan. Titrera mediet med en grundläggande en molar mopsbuffert för att nå ett pH på 6,3 på ett pH-papper.Kyl det konstgjorda sputummediet vid fyra grader Celsius tills du filtrerar. För att sedan starta filtreringsprocessen överför du 200 milliliter ofiltrerat artificiellt sputummedium till ett vakuumfiltreringssystem med ett 0,22 mikrometer porstorleksfilter. Efter att ha anslutit filtreringssystemet till vakuumpumpen, slå på vakuumpumpen och placera sedan kammaren på en orbital shaker och skaka vid 90 rotationer per minut i ett kallt rum vid fyra grader Celsius.Byt filter efter att 350 milliliter medium har filtrerats för att lösa igensättningsproblemet. Efter att en betydande mängd filtrerats, vid ett extra 150 milliliter medium för filtrering. Upprepa filtreringen med ytterligare kammare tills alla medier är filtrerade.Översikt över syre sparging visar tillägg av patienten sputum till konstgjorda sputum medium i en autoclaved serum flaska. Spara sedan den förseglade serumflaskan med en gasblandning. Slutligen inkuberas serumflaskan för att erhålla kultur Alec Watts vid 24 timmars intervall för efterföljande metagenomisk sekvensering.För att starta serumflaskans odlingssparande, märka 500 milliliter autoklaverade serumflaskor med providentifierare, datum och tid för inokulering och målsyreprocent. Tillsätt 24 milliliter av det konstgjorda sputummediet i en biologisk huva till varje serumflaska som ställs in. För att erhålla en tillräcklig provvolym för varje odlingstillstånd späd vid behov provet med steril fosfatbuffrad saltlösning, homogeniserad sputum med en 18 gauge nål och tillsätt en milliliter av patientens sputum till varje serumflaska.Använd sedan sterila pincett, placera de autoklaverade gummipropparna på toppen av varje serumflaska, tryck ner gummipropparna utan att röra vid undersidan av proppen. Efter att ha tagit bort flaskorna från huven, applicera och pressa aluminiumtätningarna. Ta bort tätningarnas mittpunkt och torka av toppen av flaskorna med en alkoholservett och passera flasktätningen genom en Bunsen-brännarlåga.Fäst nu en steril 18 gauge nål på en kolvlista spruta med ett filter, sätt in den ansatta gasfrisättningssprutan i flaskan först. Fäst nu en steril 18 gauge nål till gasutgången från systemet och sätt in gasutgångsnålen i flaskan också. Led T-korsningarna från tankarna genom syremätaren.Efter att ha verifierat målsyrekoncentrationen som strömmar genom systemet, rikta in dig på cirka fem liter per minut av gasflödet. Omdirigera T-korsningarna från tankarna till gasutgången. När gasen börjar flöda genom serumflaskan, var uppmärksam på tryckmätaren, och om trycket ökar oväntat, stäng av systemet omedelbart.Efter att ha kört, syre sparge genom serumflaskan i en minut på fem liter per minut, inställningarna möjliggör 10 luftutbyten och säkerställer att den inre atmosfären når önskad koncentration av 100% syre. Ta bort gasutsläppet, 18 gauge nål. Efter att ha låtit trycket i serumflaskan byggas upp i en atmosfär, ta omedelbart bort gasutmatningsnålen.Inkubera serumflaskorna i 37 grader Celsius inkubatorskakapparat vid 150 rotationer per minut i 3, 24 timmars intervall. Alec Watt tas med varje 24-timmarsintervall för nedströmsanalys och prover skosas varje gång. Exemplet här visar hur en kultur kan se ut före och efter inkubation.Utflödessyre- och pH-nivåerna mättes under odlingsprocessen för sputumprover som bibehölls vid 37 grader Celsius. Med båda sparging intervallen 12 timmar och 24 timmar, syre koncentrationer var ungefär upprätthålls över tiden med en måttlig minskning av syre koncentrationen observerades för alla tre villkor. De uppmätta pH-nivåerna låg inom det fysiologiska intervallet utan några signifikanta förändringar över tid.Jämförelsen av mikrobiell belastning, mångfald och samhällssammansättning mellan okrtyrt och odlat sputum visade en 20 gånger ökning av mikrobiell belastning i odlad sputum. Mångfaldsmått indikerade bevarande av samhällssammansättning med minimala globala skillnader som infördes av kulturprocessen. Jämförande analys av de 120 mikrobiella arterna i odlade och uncultured sputum utfördes av meta genomisk sekvensering.46 av dessa arter identifierades i både okulturerade och odlade prover. Medan 35 identifierades uteslutande i okulturerade prover och 39 identifierades uteslutande i odlade prover. Absorbent baserade tillväxt kurvor genererades för gemensamma CF lung patogener odlade i konstgjorda sputum media från patienten prov isolat under normala 21%syre koncentration.Ingen förändring över tid i den optiska densiteten vid 600 nanometer i ASM endast negativ kontroll indikerade föroreningsfri kultur. De typiska tillväxtkurvans mönster som observerats som indikerar att ASM-medium kan användas för generering av tillväxtkurvor med optiska metoder. Den metagenomiska sekvenseringen används här för att beskriva mikrobiell samhällskomposition.Andra tekniker såsom metatranscriptomisk sekvensering kan användas för att utvärdera genuttryck eller metabolomik för att utvärdera metabolitproduktionen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotopic Aorta Transplantation: En Rat modell för att studera utvecklingen av kronisk vaskulopati

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Biomarkörer i en djurmodell för att avslöja Neurala, Hematologiska och Behavioral korrelat till PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Den dimetylnitrosamin inducerad leverfibros modell i råtta

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topisk Airway Anesthesia för Awake-endoskopisk Intubation Använda Spray-as-you-go Teknik med hög syre Flow

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

En primär mänsklig trofoblaster modell för att studera effekten av Inflammation i samband med moderns fetma på reglering av autofagi i moderkakan

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

Generation av mänsklig Nasal epitelial Cell Spheroids för individualiserad cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator studie

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...