Name: design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Bu çalışmanın bir kısmı Deniz Biyolojik Laboratuvarı, DOE (DE-SC0016127), NSF (MCB1822263), HHMI (hibe numarası 5600373) ve Simons Vakfı'nın hediyesi ile Deniz Biyolojik Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi.

Bu çalışma Ortaklar Kurumsal İnceleme Kurulu'ndan onay almıştır (Protokol # 2018P002934). İnklüzyon kriteri, çalışma için yazılı bilgilendirilmiş onay sağlayan kistik fibrozisli yetişkin hastaları içeriyordu. Dışlama kriteri yoktu. Protokol yönergelerine göre, tüm balgam örnekleri klinik sağlayıcıları ile planlanan bir ayaktan ziyaret sırasında kistik fibrozisli hastalardan toplanmıştır.
1. Yapay Balgam Orta Hazırlık
NOT: Burada li...

<ol>
	<li>Carmody, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+in+airway+bacterial+communities+associated+with+clinical+states+and+disease+stages+in+cystic+fibrosis.">Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis.</a> PLoS One. 13 (3), 0194060 (2018).</li><li>Acosta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+microbiota+is+predictive+of+long-term+clinical+outcomes+in+young+adults+with+cystic+fibrosis.">Sputum microbiota is predictive of long-term clinical outcomes in young adults with cystic fibrosis.</a> Thorax. 73 (11), 1016-1025 (2018).</li><li>Muhlebach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+acquisition+and+succession+of+the+cystic+fibrosis+lung+microbiome+is+associated+with+disease+progression+in+infants+and+preschool+children.">Initial acquisition and succession of the cystic fibrosis lung microbiome is associated with disease progression in infants and preschool children.</a> PLoS Pathogens. 14 (1), 1006798 (2018).</li><li>Zolin, A., Bossi, A., Cirilli, N., Kashirskaya, N., Padoan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+mortality+in+childhood.+Data+from+European+cystic+fibrosis+society+patient+registry.">Cystic fibrosis mortality in childhood. Data from European cystic fibrosis society patient registry.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (9), (2018).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+survival+in+adult+patients+with+cystic+fibrosis+with+FEV1+30%+of+predicted+in+the+United+States.">Heterogeneity in survival in adult patients with cystic fibrosis with FEV1 30% of predicted in the United States.</a> Chest. 30 (6), 1320-1328 (2017).</li><li>Ramos, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+non-referral+of+patients+with+cystic+fibrosis+for+lung+transplant+evaluation+in+the+United+States.">Predictors of non-referral of patients with cystic fibrosis for lung transplant evaluation in the United States.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (2), 196-203 (2016).</li><li>Girardis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conservative+vs+conventional+oxygen+therapy+on+mortality+among+patients+in+an+intensive+care+unit:+The+Oxygen-ICU+randomized+clinical+trial.">Effect of conservative vs conventional oxygen therapy on mortality among patients in an intensive care unit: The Oxygen-ICU randomized clinical trial.</a> JAMA. 316 (15), 1583-1589 (2016).</li><li>Comstock, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WinCF+model+-+An+inexpensive+and+tractable+microcosm+of+a+mucus+plugged+bronchiole+to+study+the+microbiology+of+lung+infections.">The WinCF model - An inexpensive and tractable microcosm of a mucus plugged bronchiole to study the microbiology of lung infections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55532 (2017).</li><li>Diraviam Dinesh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+sputum+medium.">Artificial sputum medium.</a> Protocol Exchange. , (2010).</li><li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+artificial+sputum+medium+to+test+antibiotic+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+conditions+more+relevant+to+the+cystic+fibrosis+lung.">Use of artificial sputum medium to test antibiotic efficacy against Pseudomonas aeruginosa in conditions more relevant to the cystic fibrosis lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857 (2012).</li><li>Grandjean Lapierre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+respiratory+tract+salt+concentration:+An+Exploratory+Cohort+Study.">Cystic fibrosis respiratory tract salt concentration: An Exploratory Cohort Study.</a> Medicine. 96 (47), 8423 (2017).</li><li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum.">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li><li>Van Sambeek, L., Cowley, E. S., Newman, D. K., Kato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sputum+glucose+and+glycemic+control+in+cystic+fibrosis-related+diabetes:+a+cross-sectional+study.">Sputum glucose and glycemic control in cystic fibrosis-related diabetes: a cross-sectional study.</a> PLoS One. 10 (3), 0119938 (2015).</li><li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease.">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846 (2016).</li><li>Gallagher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+mass+spectrometry+detection+of+antibiotic+agents+in+sputum+from+persons+with+cystic+fibrosis.">Liquid chromatography mass spectrometry detection of antibiotic agents in sputum from persons with cystic fibrosis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 65 (2), (2021).</li><li>Voynow, J. A., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins,+mucus,+and+sputum.">Mucins, mucus, and sputum.</a> Chest. 135 (2), 505-512 (2009).</li><li>Sui, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+DNA+extraction+method+on+variation+in+human+and+built+environment+microbial+community+and+functional+profiles+assessed+by+shotgun+metagenomics+sequencing.">Impact of DNA extraction method on variation in human and built environment microbial community and functional profiles assessed by shotgun metagenomics sequencing.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 953 (2020).</li><li>McIver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bioBakery:+a+meta'omic+analysis+environment.">bioBakery: a meta'omic analysis environment.</a> Bioinformatics. 34 (7), 1235-1237 (2018).</li><li>Truong, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaPhlAn2+for+enhanced+metagenomic+taxonomic+profiling.">MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.</a> Nature Methods. 12 (10), 902-903 (2015).</li><li>Stammler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+microbiome+profiles+for+differences+in+microbial+load+by+spike-in+bacteria.">Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria.</a> Microbiome. 4 (1), 28 (2016).</li><li>Henke, M. O., Renner, A., Huber, R. M., Seeds, M. C., Rubin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5AC+and+MUC5B+mucins+are+decreased+in+cystic+fibrosis+airway+secretions.">MUC5AC and MUC5B mucins are decreased in cystic fibrosis airway secretions.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 86-91 (2004).</li><li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyper+concentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyper concentration and increased osmotic pressure.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Matthews, L. W., Spector, S., Lemm, J., Potter, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+pulmonary+secretions.+I.+The+over-all+chemical+composition+of+pulmonary+secretions+from+patients+with+cystic+fibrosis,+bronchiectasis,+and+laryngectomy.">Studies on pulmonary secretions. I. The over-all chemical composition of pulmonary secretions from patients with cystic fibrosis, bronchiectasis, and laryngectomy.</a> American Review of Respiratory Disease. 88, 199-204 (1963).</li><li>Ibanez de Aldecoa, A. L., Zafra, O., Gonzalez-Pastor, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+extracellular+DNA+release+and+its+biological+roles+in+microbial+communities.">Mechanisms and regulation of extracellular DNA release and its biological roles in microbial communities.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1390 (2017).</li><li>Tunney, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+anaerobic+bacteria+in+high+numbers+in+sputum+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Detection of anaerobic bacteria in high numbers in sputum from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (9), 995-1001 (2008).</li><li>Worlitzsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients.">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (3), 317-325 (2002).</li></ol>

Bu çalışmada hiperoksinin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisini incelemek için bir in vitro model geliştirilmiştir. Serum şişelerinin yapay balgam ortamına ve günlük spargingine dayanan bu model, yüksek oksijen konsantrasyonlarını korur ve pwCF'den balgamda tanımlanan mikropların büyümesini destekler.
Bu yaklaşımın birkaç kritik adımı vardır. Birincisi, yapay balgam ortamının ısı sterilizasyonu yerine filtre sterilizasyonu kullanma seçimi...

Kistik fibrozis (CF), akciğerlerden kalın mukusu temizleyememe ile karakterize genetik bir hastalıktır ve sıklıkla akciğer nakli veya ölüm ihtiyacı ile sonuçlanan tekrarlayan enfeksiyonlara ve ilerleyici akciğer fonksiyon düşüşüne yol açar. Kistik fibrozis (pwCF) olan kişilerin hava yolu mikrobiyomu hastalık aktivitesini izler1, olumsuz uzun vadeli sonuçlarla ilişkili mikrobiyal çeşitlilikte bir azalmaile 2,3. PwCF'nin klinik çalışmalarında, ek oksijen tedavisi daha ileri hastalık4,5ile ilişkilendirilmiştir , geleneksel olarak, oksijen tedavisinin kullanımı sadece hastalık şiddeti için bir belirteç olarak açılmıştır6. Solunum yetmezliği olan hastaların klinik çalışmalarından elde edilen son çalışmalar, daha yüksek hasta oksijen seviyelerinin paradoksal olarak ciddi bakteriyel enfeksiyonlardaki artış ve daha yüksek mortalite7ile ilişkili olduğunu göstermiştir Ek oksijenin hastalık patogenezine katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Ek oksijenin kistik fibrozis akciğer mikrobiyomu ve ilişkili akciğer ve hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi iyi incelenmemiştir.
Mekanistik çalışmalar genellikle lojistik zorluklar ve bilinmeyen tıbbi fayda veya zarar müdahaleleriyle ilişkili potansiyel etik sorunlar nedeniyle doğrudan insan denekler üzerinde yapılamamaktadır. İnsan biyospepsimenlerini model sistemlerine entegre eden çeviri yaklaşımları bu durumlarda önemli biyolojik içgörüler sunabilir. Oksijen kullanma veya tolere etme yeteneği geleneksel olarak mikrobiyal sınıflandırmanın önemli bir bileşeni olsa da, ek oksijenin çevreye terapötik olarak tanıtılmasının hava yolu mikrobiyal topluluklarını nasıl bozabileceği hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek oksijenin pwCF'nin hava yolu mikrobiyomları üzerindeki bilinmeyen etkilerine ışık tutmak için iki büyük zorluğu ele almamız gerekiyordu; birincisi, fizyolojik olarak CF balgamının bileşimine yakın bir kültür ortamının oluşturulması; ikinci olarak, kültürdeki yüksek oksijen konsantrasyonlarının uzun süreler boyunca korunmasına izin veren bir model sisteminin oluşturulması.
Yapay balgam ortamı (ASM), akciğer balgam ex vivo8 , 9,10' u taklit etmek için yaygın olarak kullanılır, ancak belirli bir tarif üzerinde net bir fikir birliği yoktur. Bu protokol, pwCF'den fizyolojik olarak balgam hakkında dikkatlice tasarlanmış yapay bir balgam ortamı tarifi ve hazırlama stratejisini açıklar. Tablo 1, yayınlanan literatüre göre seçilen tarif değerlerini özetlemektedir. Temel kimyasal bileşenler ve pH, insan CF balgam11 , 12,13çalışmaları ile tanımlanan değerlerle eşleştirildi. Düşük konsantrasyonda fizyolojik besinler, son hacim10'un%0.25'i olarak dahil edilen yumurta sarısı kullanılarak eklenmiştir vitamin ve eser metal karışımları14,15. Balgam16'nınanahtar bileşeni olan Mucin, %1 w/v14'te dahil edildi. Daha emek yoğun olmasına rağmen, temel ortam bileşenlerinin ısı kaynaklı denatürasyonundan kaynaklanan potansiyel sorunları azaltmak için daha geleneksel ısı sterilizasyonu uygulaması yerine filtre sterilizasyonu seçilmiştir10. Filtre sterilizasyonunun ek bir yararı, şeffaf ortamlar üretmesidir (ısı sterilizasyonu, tuzların ve proteinlerin yağması ve pıhtılaşması nedeniyle bulanık ortam oluşturabilir), bu yapay balgam ortamlarının bulanıklıktaki artışlara dayalı mikrobiyal büyümeyi takip etmek için kullanılmasına izin verir.
Hiperoksik kültür için bu model sistemi, pwCF için ek oksijen kullanımının etkisi için bir model oluşturarak oksijenin çıkarılması yerine eklendiği anaerobik kültleme tekniklerine dayanmaktadır. Şekil 1 ve ilgili oksijen sparging protokolü, genel laboratuvar ve hastane tedarikçilerinden düşük maliyetle elde edilebilen bir oksijen sıçrama sisteminin bileşenlerini özetlemektedir. Bu sistem basınçlı oksijen ve havanın %21-%100 oksijen arasında değişen sabit konsantrasyonlara karıştırılmasını sağlar. Bir oksijen sensörünün entegrasyonu, çıkış gazı karışımının konsantrasyonunun doğrulanmasının yanı sıra, oksijen koşullarının istenen aralıkta korunduğunu doğrulamak için daha önce sıçramış serum şişelerinin çıkış gazı bileşimini kontrol etmeyi sağlar.
Bu protokol, yapay bir balgam ortamı oluşturma prosedürlerini, bir oksijen sıçrama sisteminin inşasını ve kullanımını ve her ikisinin de diferansiyel oksijen koşulları altında kültür CF balgamının uygulanmasını özetlemektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME Vitamins (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>Concentrated solution of supplemental vitamins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crimper, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224307</td>
			<td>Crimper for attaching aluminum seals to serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Solid glucose powder (dextrorotatory isomer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaphragm Pump ME 2 NT</td>
			<td>VACUUBRAND</td>
			<td>20730003</td>
			<td>Vacuum pump for vacuum filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg Yolk Emulsion</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>FD045</td>
			<td>Sterile emulsion of 30% egg yolk in saline.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferritin, Cationized from Horse Spleen</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>F7879</td>
			<td>Ferritin (iron-storage protein) solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIREBOY plus Safety Bunsen Burner</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>144000</td>
			<td>Bunsen burner with user interface and safety features.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (1.0&#8211;14.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>94</td>
			<td>pH testing paper for the range of 1.0&#8211;14.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (4.0&#8211;9.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>55</td>
			<td>pH testing paper for the range of 4.0&#8211;9.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrion pH Paper (6.0&#8211;8.0)</td>
			<td>Micro Essential Laboratory</td>
			<td>345</td>
			<td>pH testing paper for the range of 6.0&#8211;8.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>401815</td>
			<td>18 G needles with safety caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Pressure Gauge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20469</td>
			<td>Gas pressure gauge for monitoring bottle pressure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova 42 Incubated Shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000756</td>
			<td>Combination incubator/orbital shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lok Syringe with Attached Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309580</td>
			<td>Combination 3 mL syringe and 18 G needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Valve Assortment</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14011</td>
			<td>Valves for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Orbital Shaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>6780-NP</td>
			<td>Orbital shaker to agitate media during filtration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>Solid epsom salt (magnesium sulfate heptahydrate).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-346-15FM</td>
			<td>Air flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Amino Acids (50x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M5550</td>
			<td>Concentrated solution of essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td>Concentrated solution of non-essential amino acids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP Filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SLMP25SS</td>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone membrane sterile syringe filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Academic</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>ZMQS60E01</td>
			<td>Milli-Q sterile water filtration system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniOX 3000 Oxygen Monitor</td>
			<td>MSA</td>
			<td>814365</td>
			<td>Gas flow oxygen percentage monitor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBM-90</td>
			<td>MOPS buffer for adjusting media pH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin from Porcine Stomach</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>M2378</td>
			<td>Mucin (glycosylated gel-forming protein) powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1413</td>
			<td>Connectors for gas flow tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td>Library preparation for identification during sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>770-2016-025-N</td>
			<td>Shotgun sequencing platform for generating sample reads.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter</td>
			<td>Western Enterprises</td>
			<td>M1-540-15FM</td>
			<td>Oxygen flow rate regulator with 15 L/min meter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors</td>
			<td>SunMed</td>
			<td>2001-01</td>
			<td>Tubing for connecting gas system components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>Molecular Biologicals International</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>Concentrated phosphate-buffered saline solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC 420 Hot Plate/Stirrer</td>
			<td>Marshall Scientific</td>
			<td>CO-PC420</td>
			<td>Combination hot plate/stirrer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>Solid potassium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Disposable Stir Bars</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td>Disposable magnetic stir bars.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Thread Seal Teflon Tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470042-938</td>
			<td>Teflon tape for reinforcing gas system connections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Gard 2 Purification Cartridge</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>QGARD00D2</td>
			<td>Purification cartridge for Milli-Q system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Media Storage Bottles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-423A</td>
			<td>Bottles for mixing and storing culture media.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224100-331</td>
			<td>Rubber stoppers for serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>223952</td>
			<td>Glass serum bottles for sealed culturing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Bore Extension Set</td>
			<td>Braun Medical</td>
			<td>471960</td>
			<td>Tubing extension with luer lock connectors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Solid sodium chloride salt.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spike-in Control I (High Microbial Load)</td>
			<td>ZymoBIOMICS</td>
			<td>D6320</td>
			<td>Spike-in microbes (I. halotolerans and A. halotolerans) for absolute microbial load calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td>250 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes</td>
			<td>Professional Disposables International</td>
			<td>H04082</td>
			<td>Disposable germicidal wipes for sterilization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metals Mixture, 1000x</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NC0112668</td>
			<td>Concentrated solution of physiological trace metals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unlined Aluminum Seal, 30 mm</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>224187-01</td>
			<td>Aluminum seals crimped over top of rubber stoppers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Air Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AI USP200</td>
			<td>Compressed air tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USP Medical Grade Oxygen Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>OX USP200</td>
			<td>Compressed oxygen tank for input to sparging system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and development of a model to study the effect of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome

Hava yolu mikrobiyal topluluklarının kistik fibrozis (CF) ve diğer kronik pulmoner hastalıkların ilerlemesinde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Mikroplar geleneksel olarak oksijen kullanma veya tolere etme yeteneklerine göre sınıflandırılmıştır. Ek oksijen kistik fibrozis (pwCF) olan kişilere uygulanan yaygın bir tıbbi tedavidir; bununla birlikte, oksijen ve hava yolu mikrobiyomu üzerinde yapılan mevcut çalışmalar, hiperoksi (yüksek oksijen) yerine hipoksinin (düşük oksijen) ağırlıklı olarak aerobik ve öğretim üyesi anaerobik akciğer mikrobiyal topluluklarını nasıl etkilediğine odaklanmıştır. Bu kritik bilgi açığını gidermek için, bu protokol pwCF'den balgam bileşimini taklit eden yapay bir balgam ortamı kullanılarak geliştirilmiştir. Şeffaf bir ortam sağlayan filtre sterilizasyonunun kullanımı, optik yöntemlerin süspansiyon kültürlerinde tek hücreli mikropların büyümesini takip etmesini sağlar. Hiperoksik koşullar yaratmak için, bu model sistemi hiperoksik koşulları incelemek için yerleşik anaerobik kültleme tekniklerinden yararlanır; oksijeni çıkarmak yerine, serum şişelerinin sıkıştırılmış oksijen ve hava karışımı ile günlük olarak parçalanarak kültürlere oksijen eklenir. 50 pwCF'den balgam, bu modelin diferansiyel oksijen koşullarını koruma yeteneğini doğrulamak için 72-h süre boyunca günlük sparging geçirdi. Kistik fibrozis balgamında yaygın olarak bulunan kommensal ve patojenik mikropların büyümesini desteklemek için bu ortamın yeteneğini doğrulamak için 11 pwCF'den kültürlü ve kültürsüz balgam örneklerine av tüfeği metagenomik dizilemesi yapıldı. Bu yapay balgam ortamının yaygın kistik fibrozis patojenlerinin büyümesini destekleme yeteneğini doğrulamak için pwCF'den elde edilen 112 izolattan büyüme eğrileri elde edildi. Bu modelin CF balgamında çok çeşitli patojenleri ve kommensalları kültüre edebildiğini, normoksik koşullar altında kültürsüz balgama çok benzeyen bir topluluğu kurtardığını ve değişen oksijen koşullarında farklı kültür fenotipleri oluşturduğunu görüyoruz. Bu yeni yaklaşım, pwCF'de oksijen kullanımının hava yolu mikrobiyal toplulukları ve yaygın solunum yolu patojenleri üzerinde neden olduğu beklenmedik etkilerin daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

Bu protokoller, Boston, Massachusetts'teki Massachusetts General Hospital'daki bir ayakta kistik fibrozis kliniğine rutin bakım için başvuran pwCF'den 50 balgam söktürücü numuneye uygulandı. Her hastanın balgamı yapay balgam ortamı kullanılarak %21, %50 ve %100 oksijen koşullarının altında kültürlendi ve her kültürden 24 saat, 48 saat ve 72 saat kültür süresi ile 0,5 mL aliquot alındı. Görsel değişiklikleri izlemek için ekstraksiyonlar yapıldığında kültürler fotoğraflandı. Ek olarak,...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome at JoVE.com

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Bu protokolün amacı hiperoksinin kistik fibrozis hava yolu mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkisi için bir model sistemi geliştirmektir. Yapay balgam ortamı balgam bileşimine öykünür ve hiperoksik kültür koşulları ek oksijenin akciğer mikrobiyal toplulukları üzerindeki etkilerini modeller.

Ek Oksijenin Kistik Fibrozis Hava Yolu Mikrobiyomu Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Modelin Tasarımı ve Geliştirilmesi

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Bu protokoller, kistik fibrozis hastalarının akciğer mikrobiyomu üzerinde ek oksijen kullanımının in vitro etkilerini modellemek için tasarlanmıştır. Bu medya tarifi, kistik fibrozis ile yaşayan insanlar için balganın fizyolojik bileşimini yansıtmak için özel olarak tasarlanmıştır. Sparging işlemi, farklı oksijen koşulları altında kültür yeteneğini tanıtır.Yapay balgam ortamında yapılan değişiklikler, diğer kronik akciğer hastalıklarını taklit etmesine ve eşzamanlı kistik fibrozis ve diyabet hastalarında farklı glikoz konsantrasyonları gibi diğer koşullar altında mikrobiyal toplulukları modellemesine izin verir. Yapay balgamlı orta hazırlık adımlarına genel bakış, hazırlanan ASCM, ASMM ve ASBM'nin karıştırılmalarını göstermektedir. Paspas tamponu pH'ı 6.3'e titratlamak için kullanılır ve ortamın filtre sterilizasyonu yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde soğuk bir odada gerçekleştirilir.Başlangıç olarak, ASMM içeren bir litrelik şişeye 250 mililitre ASCM ekleyerek yapay bir balgam ortamı hazırlayın. Daha sonra orta şişeye 250 mililitre ASBM ekleyin. Bir pH kağıdında 6,3 pH'a ulaşmak için ortamı temel bir azı dişi paspas tamponu ile titrat.Suni balgam ortamını filtrasyona kadar dört santigrat derecede soğutun. Daha sonra filtrasyon işlemine başlamak için, 200 mililitre filtresiz suni balgam ortamını 0,22 mikrometre gözenek boyutu filtresine sahip bir vakum filtrasyon sistemine aktarın. Filtrasyon sistemini vakum pompasına bağladıktan sonra, vakum pompasını açın, ardından odayı dört santigrat derecede soğuk bir odada dakikada 90 dönüşte sallayarak yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.Tıkanma sorununun üstesinden gelmek için 350 mililitre orta filtrelendikten sonra filtreyi değiştirin. Önemli miktarda filtrelendikten sonra, filtrasyon için ekstra 150 mililitrelik bir ortamda. Tüm ortam filtrelenene kadar filtrasyonunu ek bölmelerle tekrarlayın.Otoklavlı serum şişesinde yapay balgam ortamına hasta balgamı eklendiğini gösteren oksijen sıçramasına genel bakış. Sonra mühürlü serum şişesini bir gaz karışımı ile serpin. Son olarak, serum şişesi, sonraki meta genomik dizileme için 24 saat aralıklarla Alec Watts kültürünü elde etmek için inkübe edilir.Serum şişesi kültürünün sıçramasına başlamak için, 500 mililitre otoklavlı serum şişelerini örnek tanımlayıcılar, aşılama tarihi ve saati ve hedef oksijen yüzdesi ile etiketle. Biyolojik bir kaputta, kurulan her serum şişesine 24 mililitre yapay balgam ortamı ekleyin. Her kültür durumu için yeterli bir örnek hacmi elde etmek için, gerekirse, numuneyi steril fosfat tamponlu salin ile seyreltin, ardından 18 kalibrelik bir iğne ile homojenize balgam ve her serum şişesine bir mililitre hasta balgalı ekleyin.Daha sonra, steril cımbız kullanarak, otoklavlı kauçuk durdurucuları her serum şişesinin üstüne yerleştirin, durdurucunun altına dokunmadan lastik durdurucuları bastırın. Şişeleri kaputtan çıkardıktan sonra alüminyum contaları uygulayın ve kıvrıklayın. Contaların orta parçasını çıkarın ve şişelerin üst kısmını alkolle silin ve şişe mührünü bir Bunsen brülör alevinden geçirin.Şimdi steril, 18 kalibrelik bir iğneyi filtreli bir piston listesi şırıngasına sabitleyin, önce yapıştırılmış gaz salınım şırıngasını şişeye yerleştirin. Şimdi steril, 18 kalibrelik bir iğneyi sistemden gaz çıkışına sabitlayın ve gaz çıkış iğnesini de şişeye yerleştirin. Tanklardaki T bağlantılarını oksijen monitöründen geçirin.Sistemden akan hedef oksijen konsantrasyonu doğrulanınca, dakikada yaklaşık beş litre gaz akışını hedefle. T bağlantılarını tanklardan gaz çıkışına yönlendirin. Gaz serum şişeden akmaya başladığında, basınç göstergesine çok dikkat edin ve basınç beklenmedik şekilde artarsa, sistemi hemen kapatın.Çalıştırildikten sonra, oksijen serum şişesinde dakikada beş litre bir dakika boyunca zıplar, ayarlar 10 hava değişimine izin verir ve iç atmosferin istenen% 100 oksijen konsantrasyonuna ulaşmasını sağlar. Gaz salınımını çıkarın, 18 kalibrelik iğne. Serum şişeslerindeki basıncın tek bir atmosfere inşa etmesine izin verdikten sonra, gaz çıkış iğnesini hemen çıkarın.Serum şişelerini 37 santigrat derece inkübatör çalkalayıcıda dakikada 150 dönüşte 3, 24 saat aralıklarla kuluçkaya yatırın. Alec Watts aşağı akış analizi için her 24 saat aralığında alınır ve numuneler her seferinde yeniden ayrıştırır. Buradaki örnek, bir kültürün inkübasyondan önce ve sonra nasıl görünebileceğini gösterir.37 santigrat derecede tutulan balgam örnekleri için kültür süreci boyunca çıkış oksijeni ve pH seviyeleri ölçüldü. Her iki 12 saat ve 24 saatlik serpinti aralıklarıyla, her üç durum için de gözlenen oksijen konsantrasyonunda ılımlı bir düşüşle oksijen konsantrasyonları zaman içinde yaklaşık olarak korundu. Ölçülen pH düzeyleri fizyolojik aralıktaydı ve zaman içinde önemli bir değişiklik olmadı.Kültürsüz ve kültürlü balgam arasındaki mikrobiyal yük, çeşitlilik ve topluluk kompozisyonunun karşılaştırılması, kültürlü balgamda mikrobiyal yükte 20 kat artış olduğunu ortaya koydu. Çeşitlilik ölçümleri, kültür süreci tarafından ortaya konan minimum küresel farklılıklarla topluluk kompozisyonunun korunmasını gösterdi. Kültürlü ve kültürsüz balgamdaki 120 mikrobiyal türün karşılaştırmalı analizi meta genomik dizileme ile yapıldı.Bu türlerin 46'sında hem kültürsüz hem de kültürlü örneklerde tanımlanmıştır. 35'i sadece kültürsüz örneklerde, 39'u ise sadece kültürlü örneklerde tanımlanmıştır. Normal %21 oksijen konsantrasyonu altındaki hasta örnek izolelerinden yapay balgam ortamlarında kültürlenen yaygın CF akciğer patojenleri için emici bazlı büyüme eğrileri oluşturulmuştır.ASM'deki 600 nanometredeki optik yoğunlukta zaman içinde değişiklik olmaması, kontaminasyonsuz kültürün sadece negatif kontrolünü gösteriyordu. Asm ortamının optik yöntemler kullanılarak büyüme eğrilerinin üretimi için kullanılabileceğini gösteren tipik büyüme eğrisi desenleri gözlenmiştir. Metaagenomik dizileme burada mikrobiyal topluluk kompozisyonunu tanımlamak için kullanılır.Metatranscriptomik dizileme gibi diğer teknikler metabolit üretimini değerlendirmek için gen ekspresyon veya metabolomik değerlendirmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Ortotopik Aort Nakli: Rat Modeli Kronik Vaskülopati Geliştirme Çalışması

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Rat Dimethylnitrosamine Başlatılan Karaciğer Fibrozis Modeli

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Topical Airway Anesthesia for Awake-endoscopic Intubation Using the Spray-as-you-go Technique with High Oxygen Flow

Topikal Havayolu Anestezi Kullanımı Awake-endoskopik entübasyon için yüksek oksijen Flow ile Tekniği Sprey-as-you-go

A patient&#39;s willingness to cooperate is an absolute precondition for successful awake intubation of the trachea. Whilst drug-sedation of patients can ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Plasenta Autophagy düzenlenmesi üzerinde anne obezite ile ilişkili iltihap etkisini incelemek için bir birincil insan Trofoblast modeli

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study

İnsan nazal epitel hücre pulcuklarının nesil bireyselleştirilmiş Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatör çalışma için

While the introduction of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator drugs has revolutionized care in Cystic Fibrosis (CF), the ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...