Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Finansiel støtte fra MINECO/FEDER (tilskud SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 og COV20/01100) anerkendes. CGF anerkendte hendes IQS Ph.d.-stipendium.

1. Syntese af pBAE polymer med end oligopeptider (OM-pBAE)
<ol><li>Polymerisering af C6-pBAE<ol>
<li>Tilsæt 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) i en rundbundet glaskolbe (100 mL). Derefter tilsættes 1,4-butanediol diakrylat (82 mmol; MW = 198,22 Da).</li>
		<li>Forvarm silikoneoliebadet ved 90 °C, læg den runde bundkolbe i oliebadet og rør blandingen ved hjælp af en magnetisk omrørbar natten over (~18 h). Tag derefter produktet fra den runde bundkolbe og læg det i ...

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year.">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li><li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2:+a+preliminary+report+of+a+phase+1/2,+single-blind,+randomised+controlled+trial.">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li><li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA:+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines.">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li><li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+mRNA+vaccines.">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li><li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy.">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li><li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines:+impact+on+translational+nanomedicine.">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li><li>Guerrero-C&#225;zares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li><li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells.">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li><li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopeptide-terminated+poly(&#946;-amino+ester)s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization.">Oligopeptide-terminated poly(&#946;-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li><li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing,+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+(beta-amino+ester)s+(PBAEs).">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li><li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo.">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).</li><li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., L&#225;zaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes.">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles.">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications:+size,+surface+charge+and+stability.">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li><li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

Efter udbruddet af Covid-19-pandemien sidste år har vaccinernes betydning i form af infektionssygdomsbekæmpelse manifesteret sig som en kritisk komponent8. Bestræbelser fra forskere verden over har gjort det muligt at frigive mange vacciner til markedet. For første gang i historien har mRNA-vacciner demonstreret deres tidligere hypotese succes takket være deres hurtige design på grund af deres evne til at tilpasse sig ethvert nyt antigen inden for nogle måneder5...

Smitsomme sygdomme har været en alvorlig trussel mod millioner af mennesker verden over og er stadig en af de hyppigste dødsårsager i nogle udviklingslande. Profylaktisk vaccination har været en af de mest effektive interventioner i det moderne samfund til at forebygge og kontrollere smitsomme sygdomme1,2. Disse kritiske milepæle for videnskabeni det 20. århundredes relevans er blevet bemærket af den nylige verdensomspændende Covid-19-pandemi forårsaget af SARS-CoV-2-virus3. I erkendelse af vigtigheden af at have effektive vacciner til at begrænse spredningen af sygdommen, har samarbejdsindsatsen fra alle biomedicinske samfund med succes resulteret i mange profylaktiske vacciner på markedet på mindre end et år4.
Traditionelt blev vacciner sammensat af dæmper (levende, reduceret virulens) eller inaktiverede (dødspartikler) vira. Men for nogle sygdomme uden margen for sikkerhedsfejl er viruspartikler ikke mulige, og proteinunderenheder anvendes i stedet. Ikke desto mindre muliggør underenheder normalt ikke kombinationen af mere end én epitop /antigen, og adjuvanser er nødvendige for at øge vaccinationsstyrken5,6. Derfor står behovet for nye vaccinetyper klart.
Som det fremgår af den nuværende pandemi, kan nye vaccinekandidater baseret på nukleinsyrer være fordelagtige med hensyn til at undgå lange udviklingsprocesser og give høj alsidighed, samtidig med at der produceres en vital patientimmunalisering. Dette er tilfældet med mRNA-vacciner, som oprindeligt blev designet som eksperimentelle kræftvacciner. Takket være deres naturlige evne til at producere antigenspecifikke T-celleresponser3,5,6,7. At være mRNA det molekyle, der koder det antigene protein, kun ændre det samme, vaccinen kan hurtigt skræddersys til at immunisere andre varianter af samme mikroorganisme, forskellige stammer, andre smitsomme mikroorganismer, eller endda blive en kræft immunterapeutisk behandling. Derudover er de fordelagtige med hensyn til store produktionsomkostninger. MRNA har imidlertid en betydelig forhindring, der hæmmer deres nøgne administration: dens stabilitet og integritet er kompromitteret i fysiologiske medier, fuld af nukleaser. Af denne grund kræves brugen af en nanometrisk bærer, der beskytter den og vektoriserer mRNA til de antigenpræsentationsceller,2,8.
I denne sammenhæng er poly (beta aminoesters) (pBAE) en klasse af biokompatibile og biologisk nedbrydelige polymerer, der viste en bemærkelsesværdig evne til at komplekse mRNA i nanometriske partikler takket være deres kationiske ladninger9,10,11. Disse polymerer består af esterbindinger, hvilket gør deres nedbrydning let ved esterases under fysiologiske forhold. Blandt pBAE bibliotek kandidater, dem funktionaliseret med end kationiske oligopeptider viste en højere kapacitet til at danne små nanopartikler til effektivt at trænge ind i celler gennem endokytose og transfect den indkapslede genmateriale. Desuden, takket være deres bufferkapacitet, forsuring af endosome rum tillader endosomal undslippe12,13. Nemlig en bestemt form for pBAE, herunder hydrofobiske moieties på deres rygrad (den såkaldte C6 pBAE) for at øge deres stabilitet og end-oligopeptid kombination (60% af polymer modificeret med en tri-lysin og 40% af polymeren med en tri-histidin), der selektivt transfects antigen-præsentere celler efter parenteral administration og producere mRNA kodet antigen præsentation efterfulgt af mus immunisering er for nylig blevet offentliggjort14 . Derudover er det også blevet påvist, at disse formuleringer kunne omgå et af nanomedicinformuleringernes vigtigste flaskehalstrin: muligheden for at frysetørre dem uden at miste deres funktionalitet, hvilket muliggør langsigtet stabilitet i bløde tørre miljøer15.
I den forbindelse er formålet med den nuværende protokol at stille proceduren for dannelse af mRNA-nanopartiklerne til rådighed for det videnskabelige samfund ved at give en beskrivelse af de kritiske trin i protokollen og muliggøre produktion af effektive vacciner til forebyggelse af smitsomme sygdomme og anvendelse af tumorbehandling.
Følgende protokol beskriver den komplette træning for at syntetisere oligopeptid end-modificeret poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymerer, der yderligere vil blive brugt til nanopartikler syntese. I protokollen er nanopartikler formulering også inkluderet. Derudover er der også kritiske skridt til succes for proceduren og repræsentative resultater for at sikre, at de resulterende formuleringer udfører de nødvendige kvalitetskontrolkarakteriseringsfunktioner for at definere et positivt eller negativt resultat. Denne protokol er opsummeret i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

Vaccination har været en af de største succeser i det moderne samfund og er uundværlig for at kontrollere og forebygge sygdomme. Traditionelle vacciner bestod af hele eller brøkdele af det smitsomme middel. Der er dog stadig udfordringer, og nye vaccineteknologier er obligatoriske. I den forbindelse har brugen af mRNA til immunisering vist en forbedret ydeevne, som det fremgår af den hurtige godkendelse af to mRNA-vacciner, der forhindrer SARS-CoV-2-infektion. Ud over succes med at forebygge virusinfektioner kan mRNA-vacciner også bruges til terapeutiske kræftapplikationer.
Ikke desto mindre gør ustabiliteten af mRNA og dens hurtige clearance fra kroppen på grund af tilstedeværelsen af nukleaser sin nøgne levering ikke mulig. I denne sammenhæng er nanomedicin, og specielt polymere nanopartikler, kritiske mRNA-leveringssystemer. Formålet med denne artikel er således at beskrive protokollen for formulering og test af en mRNA vaccine kandidat baseret på de proprietære polymere nanopartikler. Syntesen og kemisk karakterisering af poly (beta aminoesters) polymerer, deres complexation med mRNA til at danne nanopartikler, og deres lyophilization metode vil blive diskuteret her. Dette er et afgørende skridt for at reducere lager- og distributionsomkostningerne. Endelig vil de nødvendige test for at påvise deres evne til at in vitro transfect og modne model dendritiske celler blive angivet. Denne protokol vil gavne det videnskabelige samfund, der arbejder på vaccination på grund af sin høje alsidighed, der gør det muligt for disse vacciner at forebygge eller helbrede en bred vifte af sygdomme.

Polymersyntese og karakterisering OM-pBAE-synteseproceduren er angivet i figur 2. Som figur 2A viser, er det første skridt til at opnå OM-pBAE at syntetisere C6-pBAE ved at tilføje aminer (1-hexylamin og 5-amino-1-pentanol, forholdet 1:1) til diakrylat (1,4-butanediol diacrylat). Denne reaktion udføres ved 90 °C i 20 timer og under konstant omrøring. Derefter tilsættes en opløsning af oligopeptider til en opløsning af C6 polymer frem...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

Her præsenteres en simpel protokol til fremstilling af mRNA nanopartikler baseret på poly (beta aminoester) polymerer, let at skræddersy ved at ændre den indkapslede mRNA. Arbejdsgangen for syntetisering af polymerer, nanopartikler, og deres in vitro væsentlige karakterisering er også beskrevet. Der tilføjes også et proof-of-concept vedrørende immunisering.

Syntese og karakterisering af mRNA-Loaded Poly (Beta Aminoesters) Nanopartikler til vaccinationsformål

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Denne protokol er vigtig, fordi den viser, hvordan man forbereder polymere nanopartikler, indkapslede nukleinsyrer i et enkelt trin. De vigtigste fordele ved denne teknik er alsidighed, da den kan anvendes på forskellige nukleinsyrer og celletyper. Brugen af enkle procedurer for partikelforberedelse, såsom pipetter op og ned, og muligheden for at udvide stabiliteten af nanopartikler og trommeforhold ved lyophilization.Demonstrere proceduren vil være Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto og Maria Navalon-Lopez, ph.d.-studerende i vores laboratorium og Marta Diaz-Caballero, en post doc for vores laboratorium. For polyplexes dannelse, optø de tidligere forberedte polymerer, C6 peptid, poly beta amino estere, og vortex løsningen. Efter pipettering polymeren blandes op og ned, forberede en 12,5 millimolar opløsning i natriumacetat.Vortex opløsningen og vent i 10 minutter. Derefter forberede mRNA på 0,5 milligram per milliliter og blandet ved pipettering. Vortex polymeropløsningen igen, bland derefter den genetiske materialeopløsning i polymeropløsningen i et en-til-en-forhold i et mikrocentrifugerør og inkuberer røret ved 25 grader Celsius i 30 minutter i en Termoblok.Efter inkubation bundfald blandingen med en til to RNase frit vand ved at tilføje prøven til en mikro centrifuge rør, der indeholder vandet, derefter at medtage hjælpestoffer, tilsæt en 20 millimolar dynger og 4% saccharose opløsning i samme volumen som blandingen af mRNA og poly beta amino estere, og blandet af pipetter. For Lyophilization efter frysning af polyplexopløsningen ved minus 80 grader Celsius i en time skal du udføre den primære tørring og derefter straks opbevare polyplexerne ved minus 20 grader Celsius for at undgå rehydrering. For polyplex resuspension, fjerne de lyophilized nano-partikler fra minus 20 grader Celsius fryser og hurtigt tilføje den tilsvarende mængde dybt hydrogeneret vand til at re-sprede fasten og opnåede den ønskede koncentration.Pipette forsigtigt indtil total resuspension og når opløst, pipette op og ned kraftigt undgå bobler. Efter 24 timers transfektion til kvalitativ vurdering ved fluorescensmikroskopi skal du placere den 96 brøndplade, der indeholder de transfected Hela-celler, på mikroskopet og begynde at visualisere ved hjælp af 10 gange målet. Først skal du anvende en hvidbalance for at oprette en baggrundsreference til softwaren og derefter erhverve et billede for at overlejre det med fluorescensbilledet under analysen.Skift mikroskoptilstand til refleksionstilstand, og flyt filterhjulet til den blå laser for at visualisere EGFP. Derefter erhverve billeder til alle de betingelser eller brønde beskæftiger den samme eksponeringstid. Til kvantitativ vurdering af flowcytometri vaskes Hela-cellerne transfected i en 96 brøndplade ved hjælp af 100 mikroliter PBS pr. Brønd.Efter at have aspireeret PBS ved 25 mikroliter af trypsin pr. Brønd og inkuberer ved 37 grader Celsius i fem minutter. Når cellerne er løsrevet, tilsæt de tidligere genvundne medier for at inaktivere trypsinen og fastgør derefter cellerne ved at tilføje 31,25 mikroliter på 10% formalin pr. Brønd og inkubation i 20 minutter. Drej derefter flowcytometeret og softwaren til, og konfigurer derefter de rette betingelser for eksperimentet, herunder typen af pladeprøvevolumen og andre parametre såsom rystelse og skylning mellem prøverne.Konfigurer de relevante parametre for at kvantificere procentdelen af positivt transfected celler ved først at se flowdata på fremad spredt lys versus side spredt lys for at skelne cellerne fra snavs. Og så plotte en anden scatterplot, sammenligne amplitud versus højde til gate og diskriminere individuelle celler. En dag før transfektion, plade 10,000 JAWS II celler pr brønd i en 96 brønd plade til natten inkubation.Den følgende dag transfect cellerne med 0,6 mikrogram mRNA per brønd og inkubere pladen i 24 timer i en tør luft inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Den næste dag skal du vaske de celler, der er tilbage i brønden med 25 mikroliter PBS. Efter at have aspireret PBS ved 25 mikroliter af trypsin og inkubere pladen i fem minutter ved 37 grader Celsius for at løsne cellerne.Stop trypsinreaktionen ved at tilføje de tidligere gendannede medier på korrespondenten godt. Derefter centrifugere pladen, aspirere medierne, og fastsætte cellerne ved at tilføje 50 mikroliter af PBS og 2,5% formalin per brønd efterfulgt af inkubation af pladen ved fire grader Celsius i 20 minutter, centrifuge pladen. Derefter tilsættes 50 mikroliter PBS og 3% BSA pr. brønd og inkubator i 30 minutter ved fire grader Celsius.Efter inkubation centrifuge pladen igen, derefter tilføje 50 mikroliter af musen ovalbumin antistof i PBS og 3% BSA og inkubator i 30 minutter ved fire grader Celsius. Gentag centrifugeringstrinnet, og vask derefter cellerne med 50 mikroliter PBS. Efter at have aspireeret PBS, tilsæt de sekundære antistoffer og inkuberes i en time ved fire grader Celsius.Efter inkubation gentages centrifugerings- og vasketrinnene. Derefter genbruge cellerne og 100 mikroliter af PBS og 2,5% formalin for flow cytometri analyse. Fysiokemisk karakterisering af frisk og lyophilized GFP mRNA indkapsling nanopartikler viser ingen signifikante forskelle i størrelse og poly dispersitet indeks.Transmission elektronmikroskopi af polyplexes bekræfter dannelsen af sfæriske og mono spredte nanopartikler på ca. 50 nanometer i diameter. Indkapsling effektivitetsdata for en Lego peptid og modificeret poly beta amino ester polyplexes indkapsle GFP, eller ovalbumin viser ingen væsentlige forskelle afhængigt af typen af mRNA. Her vises en kvalitativ analyse af EGFP-udtrykket 24 timer efter transaktionen i JAWS II-cellelinjen.Kvantitativt i forhold til den negative kontrol. Den procent GFP positive celler er betydeligt højere og kan sammenlignes med en positiv kontrol udført med en klassisk transfection reagens. Ovalbumin mRNA indlæst oligopeptid og modificerede poly beta amino ester nanopartikler kan aktivere dendritiske celler som det ses ved det betydeligt højere udtryk af CD11b og CD86 membran markører i transfected celler i forhold til ikke-transfected celler.Vores vaccinationsplatform baseret på brugen af mRNA som aktivt princip samt vores proprietære polymerer kan tilpasses til brug i profylakse såvel som til kræftbehandling. Vi kan bruge vores teknologi til at fremhæve dette bidrag i kræft immunterapeutik. da vi kan indkapsle tumor-associerede antigener i vores nanopartikler og foretage et skift i kræftbehandlinger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

High-throughput Syntese af kulhydrater og Funktionalisering af polyanhydridet Nanopartikler

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics til kemisk syntese og tidsopløste mekanistiske undersøgelser

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonisk Nanopartikler for regenerativ Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Celle Mærkning og målretning med Superparamagnetisk jernoxid Nanopartikler

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Mikroovn-drevet Syntese af jernoxid nanopartikler til Fast Påvisning af atherosklerose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Fremstilling af metal nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et værktøj til at studere de antibakterielle egenskaber ved nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...