Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Financiële steun van MINECO/FEDER (subsidies SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 en COV20/01100) wordt erkend. CGF erkende haar IQS PhD Fellowship.

1. Synthese van pBAE-polymeer met eind oligopeptiden (OM-pBAE)
<ol><li>Polymerisatie van C6-pBAE<ol>
<li>Voeg 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-hexylamine (38 mmol; MW = 101,19 Da) in een glazen kolf met ronde bodem (100 ml). Voeg vervolgens 1,4-butaandilmagalacrylaat (82 mmol; MW = 198,22 Da).</li>
		<li>Verwarm het siliconenoliebad voor op 90 °C, plaats de kolf met ronde bodem in het oliebad en roer het mengsel met behulp van een magnetische roerstaaf een nacht (~ 18 uur). Neem vervolgens het product ui...

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year.">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li><li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2:+a+preliminary+report+of+a+phase+1/2,+single-blind,+randomised+controlled+trial.">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li><li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA:+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines.">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li><li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+mRNA+vaccines.">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li><li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy.">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li><li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines:+impact+on+translational+nanomedicine.">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li><li>Guerrero-C&#225;zares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li><li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells.">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li><li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopeptide-terminated+poly(&#946;-amino+ester)s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization.">Oligopeptide-terminated poly(&#946;-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li><li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing,+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+(beta-amino+ester)s+(PBAEs).">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li><li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo.">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).</li><li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., L&#225;zaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes.">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles.">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications:+size,+surface+charge+and+stability.">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li><li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

Na de uitbraak van de Covid-19-pandemie vorig jaar heeft het belang van vaccins in termen van infectieziektebestrijding zich gemanifesteerd als een cruciaal onderdeel8. Inspanningen van wetenschappers over de hele wereld hebben de introductie op de markt van veel vaccins mogelijk gemaakt. Voor het eerst in de geschiedenis hebben mRNA-vaccins hun eerder veronderstelde succes aangetoond, dankzij hun snelle ontwerp vanwege hun vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan elk nieuw antigee...

Infectieziekten vormen een ernstige bedreiging voor miljoenen mensen over de hele wereld en zijn nog steeds een van de belangrijkste doodsoorzaken in sommige ontwikkelingslanden. Profylactische vaccinatie is een van de meest effectieve interventies van de moderne samenleving om infectieziekten te voorkomen en te beheersen1,2. Deze kritieke mijlpalen van de wetenschap in de relevantie van de20eeeuw zijn opgemerkt door de recente wereldwijde Covid-19-pandemie veroorzaakt door het SARS-CoV-2-virus3. Erkennend het belang van het hebben van efficiënte vaccins om de verspreiding van de ziekte te beperken, hebben coöperatieve inspanningen van alle biomedische gemeenschappen met succes geresulteerd in veel profylactische vaccins op de markt in minder dan een jaar4.
Traditioneel werden vaccins samengesteld uit verzwakte (levende, verminderde virulentie) of geïnactiveerde (doodsdeeltjes) virussen. Voor sommige ziekten zonder marge voor veiligheidsfouten zijn virale deeltjes echter niet mogelijk en worden in plaats daarvan eiwitsubeenheden gebruikt. Niettemin maken subeenheden meestal de combinatie van meer dan één epitoop / antigeen niet mogelijk en zijn adjuvantia nodig om de vaccinatiepotentie te verbeteren5,6. Daarom is de behoefte aan nieuwe vaccintypen duidelijk.
Zoals aangetoond tijdens de huidige pandemie, kunnen nieuwe vaccinkandidaten op basis van nucleïnezuren voordelig zijn in termen van het vermijden van lange ontwikkelingsprocessen en het bieden van een hoge veelzijdigheid terwijl tegelijkertijd een vitale patiëntimmunisatie wordt geproduceerd. Dit is het geval met mRNA-vaccins, die aanvankelijk werden ontworpen als experimentele kankervaccins. Dankzij hun natuurlijke vermogen om antigeenspecifieke T-celresponsen3,5,6,7te produceren. Omdat mRNA het molecuul is dat codeert voor het antigene eiwit en alleen hetzelfde verandert, kan het vaccin snel worden aangepast om andere varianten van hetzelfde micro-organisme, verschillende stammen, andere infectieuze micro-organismen te immuniseren of zelfs een immunotherapeutische behandeling voor kanker te worden. Bovendien zijn ze voordelig in termen van grootschalige productiekosten. MRNA heeft echter een belangrijke hindernis die hun naakte toediening belemmert: de stabiliteit en integriteit ervan worden aangetast in fysiologische media, vol met nucleasen. Om deze reden is het gebruik van een nanometrische drager die het beschermt en mRNA vectoriseert naar de antigeen-presenterende cellen vereist2,8.
In deze context zijn poly (bèta-aminoesters) (pBAE) een klasse van biocompatibele en biologisch afbreekbare polymeren die een opmerkelijk vermogen hebben aangetoond om mRNA in nanometrische deeltjes te complexeren, dankzij hun kationische ladingen9,10,11. Deze polymeren zijn samengesteld uit esterbindingen, waardoor hun afbraak door esterasen in fysiologische omstandigheden gemakkelijk wordt. Onder de pBAE-bibliotheekkandidaten vertoonden degenen die gefunctionaliseerd waren met end kationische oligopeptiden een hoger vermogen om kleine nanodeeltjes te vormen om cellen efficiënt binnen te dringen via endocytose en het ingekapselde genmateriaal te transfecteren. Bovendien maakt de verzuring van het endosoomcompartiment dankzij hun buffercapaciteit endosomale ontsnapping12,13mogelijk. Namelijk, een specifiek soort pBAE, inclusief hydrofobe moieties op hun ruggengraat (de zogenaamde C6 pBAE) om hun stabiliteit en eind-oligopeptide combinatie te verbeteren (60% van het polymeer gemodificeerd met een tri-lysine en 40% van het polymeer met een tri-histidine) die selectief antigeen-presenterende cellen transfecteert na parenterale toediening en de mRNA-gecodeerde antigeenpresentatie produceert gevolgd door muizenimmunisatie is onlangs gepubliceerd14 . Bovendien is ook aangetoond dat deze formuleringen een van de belangrijkste knelpuntstappen van nanogeneeskundeformuleringen kunnen omzeilen: de mogelijkheid om ze te vriesdrogen zonder hun functionaliteit te verliezen, wat langdurige stabiliteit in zachte droge omgevingen mogelijk maakt15.
In deze context is het doel van het huidige protocol om de procedure voor de vorming van de mRNA-nanodeeltjes beschikbaar te maken voor de wetenschappelijke gemeenschap door een beschrijving te geven van de kritieke stappen in het protocol en de productie van efficiënte vaccins voor infectieziektenpreventie en tumorbehandelingstoepassingen mogelijk te maken.
Het volgende protocol beschrijft de volledige training om oligopeptide end-modified poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymeren te synthetiseren die verder zullen worden gebruikt voor nanodeeltjessynthese. In het protocol is ook de formulering van nanodeeltjes opgenomen. Bovendien worden ook kritieke stappen voor het succes van de procedure en representatieve resultaten gegeven om ervoor te zorgen dat de resulterende formuleringen voldoen aan de vereiste karakteriseringskenmerken voor kwaliteitscontrole om een positief of negatief resultaat te definiëren. Dit protocol is samengevat in figuur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

Vaccinatie is een van de grootste successen van de moderne samenleving en is onmisbaar bij het beheersen en voorkomen van ziekten. Traditionele vaccins waren samengesteld uit hele of fracties van het infectieuze agens. Er blijven echter uitdagingen en nieuwe vaccintechnologieën zijn verplicht. In deze context heeft het gebruik van mRNA voor immuniserende doeleinden een verbeterde prestatie laten zien, zoals blijkt uit de snelle goedkeuring van twee mRNA-vaccins die SARS-CoV-2-infectie voorkomen. Naast succes bij het voorkomen van virale infecties, kunnen mRNA-vaccins ook worden gebruikt voor therapeutische kankertoepassingen.
Niettemin maakt de instabiliteit van mRNA en de snelle klaring uit het lichaam als gevolg van de aanwezigheid van nucleasen de naakte afgifte ervan niet mogelijk. In deze context zijn nanogeneesmiddelen, en specifiek polymere nanodeeltjes, kritieke mRNA-afgiftesystemen. Het doel van dit artikel is dus om het protocol te beschrijven voor de formulering en test van een kandidaat-mRNA-vaccin op basis van de gepatenteerde polymere nanodeeltjes. De synthese en chemische karakterisering van de gebruikte poly(bèta-aminoesters)polymeren, hun complexatie met mRNA om nanodeeltjes te vormen en hun lyofilisatiemethodologie zullen hier worden besproken. Dit is een cruciale stap voor het verlagen van opslag- en distributiekosten. Ten slotte zullen de vereiste tests worden aangegeven om hun vermogen aan te tonen om in vitro transfecterende en volwassen modelleer dendritische cellen te modelleren. Dit protocol zal de wetenschappelijke gemeenschap die aan vaccinatie werkt ten goede komen vanwege de hoge veelzijdigheid die deze vaccins in staat stelt een breed scala aan ziekten te voorkomen of te genezen.

Polymeersynthese en karakterisering De OM-pBAE syntheseprocedure is weergegeven in figuur 2. Zoals figuur 2A laat zien, is de eerste stap om de OM-pBAE te verkrijgen het synthetiseren van de C6-pBAE door de amines (1-hexylamine en 5-amino-1-pentanol, verhouding 1:1) toe te voegen aan het diacrylaat (1,4-butaandioldilacrylaat). Deze reactie wordt uitgevoerd bij 90 °C gedurende 20 uur en met constant roeren. Daarna wordt een oplossing van olig...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.

Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Dit protocol is belangrijk omdat het aantoont hoe polymere nanodeeltjes, ingekapselde nucleïnezuren in één eenvoudige stap kunnen worden ingekapseld. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn veelzijdigheid, omdat deze kan worden toegepast op verschillende nucleïnezuren en celtypen. Het gebruik van eenvoudige procedures voor deeltjesvoorbereiding, zoals pipetteren op en neer, en de mogelijkheid om de stabiliteit van de nanodeeltjes en trommelcondities te verlengen door lyofilisatie.De procedure wordt gedemonstreerd door Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto en Maria Navalon-Lopez, promovenda van ons laboratorium en Marta Diaz-Caballero, een postdoc voor ons laboratorium. Voor de vorming van polyplexen ontdooit u de eerder bereide polymeren, C6-peptide, poly bèta-aminoesters en vortex de oplossing. Na het pipetteren van het polymeermengsel op en neer, bereidt u een 12,5 millimolar oplossing in natriumacetaat.Vortex de oplossing en wacht 10 minuten. Bereid vervolgens mRNA voor op 0,5 milligram per milliliter en meng door pipetteren. Vortex de polymeeroplossing opnieuw, meng vervolgens de genetische materiaaloplossing in de polymeeroplossing in een één-op-één-verhouding in een microcentrifugebuis en incubeer de buis bij 25 graden Celsius gedurende 30 minuten in een Thermoblock.Na incubatie slaat u het mengsel neer met één tot twee RNase-vrij water door het monster toe te voegen aan een microcentrifugebuis die het water bevat, en vervolgens om de hulpstoffen op te nemen, een 20 millimolaire hopen en 4% sucrose-oplossing toe in hetzelfde volume als het mengsel van mRNA en poly bèta-aminoesters, en gemengd door pipetteren. Voor lyofilisatie na het invriezen van de polyplexoplossing bij min 80 graden Celsius gedurende één uur, voert u de primaire droging uit en slaat u de polyplexen onmiddellijk op bij min 20 graden Celsius om rehydratatie te voorkomen. Verwijder voor polyplex resuspensie de gelyofiliseerde nanodeeltjes uit de vriezer van min 20 graden Celsius en voeg snel de overeenkomstige hoeveelheid diep gehydrogeneerd water toe om de vaste stof opnieuw te verspreiden en de gewenste concentratie te bereiken.Pipetteer voorzichtig tot de totale resuspensie en pipetteer, eenmaal opgelost, krachtig op en neer om bubbels te vermijden. Na 24 uur transfectie voor kwalitatieve beoordeling door fluorescentiemicroscopie, plaatst u de 96-putplaat met de getransfecteerde Hela-cellen op de microscoop en begint u te visualiseren met behulp van het 10-voudige objectief. Pas eerst een witbalans toe om een achtergrondverwijzing voor de software te maken en verkrijg vervolgens een afbeelding om deze tijdens de analyse met het fluorescentiebeeld te bedekken.Wijzig de microscoopmodus in de reflectiemodus en verplaats het filterwiel naar de blauwe laser om EGFP te visualiseren. Verkrijg vervolgens afbeeldingen voor alle omstandigheden of putten met dezelfde belichtingstijd. Voor kwantitatieve beoordeling door flowcytometrie, was de Hela-cellen getransfecteerd in een 96-putplaat met 100 microliter PBS per put.Na het aspirateren van de PBS op 25 microliter trypsine per put en incuberen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voegt u de eerder teruggewonnen media toe om het trypsine te inactiveren en fixeert u de cellen door 31,25 microliter 10% formaline per put toe te voegen en gedurende 20 minuten te broeden. Schakel vervolgens de flowcytometer en de software in en stel vervolgens de juiste omstandigheden in voor het experiment, inclusief het type plaatmonstervolume en andere parameters zoals schudden en spoelen tussen monsters.Stel de juiste parameters in om het percentage positief getransfecteerde cellen te kwantificeren door eerst de stroomgegevens te bekijken op voorwaarts verstrooid licht versus zijdelings verstrooid licht om de cellen van het puin te onderscheiden. En dan nog een scatterplot uitzetten, waarbij de amplitude versus hoogte wordt vergeleken met gate en individuele cellen worden onderscheiden. Een dag voor transfectie, plaat 10.000 JAWS II cellen per put in een 96 put plaat voor overnight incubatie.De volgende dag transfecteren de cellen met 0,6 microgram mRNA per put en incuberen de plaat gedurende 24 uur in een droge luchtincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Was de volgende dag de cellen die in de put achterblijven met 25 microliter PBS. Na het aspirateren van de PBS op 25 microliter trypsine en het incuberen van de plaat gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken.Stop de trypsinereactie door de eerder herstelde media toe te voegen aan de correspondentput. Centrifugeer vervolgens de plaat, zuig de media aan en fixeer de cellen door 50 microliter PBS en 2,5% formaline per put toe te voegen, gevolgd door de plaat gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius te incuberen, de plaat te centrifugeren. Voeg vervolgens 50 microliter PBS en 3% BSA per put en incubator toe gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Na incubatiecentrifugeer de plaat opnieuw, voeg dan 50 microliter van het ovalbumine-antilichaam van de muis toe in PBS en 3% BSA en incubator gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Herhaal de centrifugatiestap en was de cellen vervolgens met 50 microliter PBS. Voeg na het aspirateren van de PBS de secundaire antilichamen toe en incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius.Herhaal na de incubatie de centrifugeer- en wasstappen. Resuspend vervolgens de cellen en 100 microliter PBS en 2,5% formaline voor flowcytometrie-analyse. Fysiochemische karakterisering van verse en gelyofiliseerde GFP-mRNA dat nanodeeltjes inkapselt, vertoont geen significante verschillen in grootte en polydispergelijkheidsindex.Transmissie-elektronenmicroscopie van de polyplexen bevestigt de vorming van bolvormige en monogedispergeerde nanodeeltjes met een diameter van ongeveer 50 nanometer. Encapsulatie-efficiëntiegegevens van een Lego-peptide en gemodificeerde poly bèta-aminoesterpolyplexen die GFP of ovalbumine inkapselen, vertonen geen significante verschillen, afhankelijk van het type mRNA. Een kwalitatieve analyse van EGFP-expressie, 24 uur na de transactie in de JAWS II-cellijn, wordt hier getoond.Kwantitatief vergeleken met de negatieve controle. Het percentage GFP-positieve cellen is significant hoger en vergelijkbaar met een positieve controle uitgevoerd met een klassiek transfectiereagens. De ovalbumine mRNA geladen oligopeptide en gemodificeerde poly beta amino ester nanodeeltjes kunnen dendritische cellen activeren, zoals te zien is aan de significant hogere expressie van CD11b en CD86 membraanmarkers in getransfecteerde cellen in vergelijking met niet-getransfecteerde cellen.Ons vaccinatieplatform op basis van het gebruik van mRNA als actief bestanddeel, evenals onze gepatenteerde polymeren kunnen worden aangepast om te worden gebruikt in profylaxe en voor kankertherapieën. We kunnen onze technologie gebruiken om die bijdrage in de immunotherapeutica voor kanker te benadrukken. omdat we tumor-geassocieerde antigenen in onze nanodeeltjes kunnen inkapselen en een verschuiving kunnen maken in kankerbehandelingen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthese, Vergadering, en de karakterisatie van monolaag Protected gouden nanodeeltjes Films voor eiwit monolaag Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

High-throughput synthese van koolhydraten en functionalisering van polyanhydride Nanodeeltjes

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics voor chemische synthese en Tijdopgeloste mechanistische studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonische Nanodeeltjes voor Regeneratieve Onderzoek

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cel Labeling en Targeting met superparamagnetische ijzeroxide Nanodeeltjes

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

-Magnetron gedreven Synthese van ijzeroxide nanopartikels voor snelle detectie van atherosclerose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Productie van Metaal Nanoparticles door Pulsed Laser Ablation in Liquids: Een Tool voor het bestuderen van de Antibacteriële Eigenschappen van Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...