Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
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Finanzielle Unterstützung von MINECO/FEDER (Zuschüsse SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 und COV20/01100) wird anerkannt. CGF erkannte ihr IQS PhD Fellowship an.

1. Synthese von pBAE-Polymer mit Endoligopeptiden (OM-pBAE)
<ol><li>Polymerisation von C6-pBAE<ol>
<li>5-Amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-Hexylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) in einen Glaskolben mit rundem Boden (100 ml). Dann fügen Sie 1,4-Butandioldiacrylat (82 mmol; MW = 198,22 Da).</li>
		<li>Das Silikonölbad bei 90 °C vorheizen, den Rundkolben in das Ölbad stellen und die Mischung mit Hilfe eines Magnetrührbalkens über Nacht (~18 h) umrühren. Nehmen Sie dann das Produkt aus dem Rundkolben und leg...

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

Nach dem Ausbruch der Covid-19-Pandemie im vergangenen Jahr hat sich die Bedeutung von Impfstoffen für die Bekämpfung von Infektionskrankheiten als kritische Komponente manifestiert8. Bemühungen von Wissenschaftlern weltweit haben die Markteinführung vieler Impfstoffe ermöglicht. Zum ersten Mal in der Geschichte haben mRNA-Impfstoffe ihren bisher hypothetischen Erfolg gezeigt, dank ihres schnellen Designs aufgrund ihrer Fähigkeit, sich innerhalb einiger Monate an jedes neue Antigen anzupasse...

Infektionskrankheiten stellen eine ernsthafte Bedrohung für Millionen von Menschen auf der ganzen Welt dar und sind in einigen Entwicklungsländern immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die prophylaktische Impfung war eine der wirksamsten Interventionen der modernen Gesellschaft zur Vorbeugung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten1,2. Diese entscheidenden Meilensteine der Wissenschaft in der Relevanz des20.Jahrhunderts wurden durch die jüngste weltweite Covid-19-Pandemie, die durch das SARS-CoV-2-Virus verursacht wurde, hervorgehoben3. In Anerkennung der Bedeutung effizienter Impfstoffe, um die Verbreitung der Krankheit einzudämmen, haben die Kooperationsbemühungen aller biomedizinischen Gemeinschaften in weniger als einem Jahr erfolgreich zu vielen prophylaktischen Impfstoffen auf dem Markt geführt4.
Traditionell bestanden Impfstoffe aus abgeschwächten (lebend, reduzierte Virulenz) oder inaktivierten (Todespartikel) Viren. Für einige Krankheiten ohne Spielraum für Sicherheitsfehler sind virale Partikel jedoch nicht möglich, und stattdessen werden Proteinuntereinheiten verwendet. Dennoch ermöglichen Untereinheiten in der Regel nicht die Kombination von mehr als einem Epitop / Antigen, und Adjuvantien sind erforderlich, um die Impfkraft zu erhöhen5,6. Daher ist der Bedarf an neuartigen Impfstofftypen klar.
Wie während der aktuellen Pandemie gezeigt wurde, können neuartige Impfstoffkandidaten auf basis von Nukleinsäuren vorteilhaft sein, um lange Entwicklungsprozesse zu vermeiden und eine hohe Vielseitigkeit zu bieten und gleichzeitig eine lebenswichtige Immunisierung des Patienten zu erzeugen. Dies ist der Fall bei mRNA-Impfstoffen, die ursprünglich als experimentelle Krebsimpfstoffe konzipiert wurden. Dank ihrer natürlichen Fähigkeit, antigenspezifische T-Zell-Antworten zu produzieren3,5,6,7. Da mRNA das Molekül ist, das für das antigene Protein kodiert und sich nur gleich verändert, kann der Impfstoff schnell angepasst werden, um andere Varianten desselben Mikroorganismus, verschiedene Stämme, andere infektiöse Mikroorganismen zu immunisieren oder sogar eine Krebsimmuntherapie zu werden. Darüber hinaus sind sie vorteilhaft in Bezug auf die Produktionskosten im großen Maßstab. mRNA hat jedoch eine erhebliche Hürde, die ihre nackte Verabreichung behindert: Ihre Stabilität und Integrität sind in physiologischen Medien voller Nukleasen beeinträchtigt. Aus diesem Grund ist die Verwendung eines nanometrischen Trägers erforderlich, der sie schützt und mRNA zu den Antigen-präsentierenden Zellenvektorisiert 2,8.
In diesem Zusammenhang sind Poly(beta-Aminoester) (pBAE) eine Klasse von biokompatiblen und biologisch abbaubaren Polymeren, die dank ihrer kationischen Ladungen eine bemerkenswerte Fähigkeit gezeigt haben, mRNA in nanometrischen Partikeln zu komplexieren9,10,11. Diese Polymere bestehen aus Esterbindungen, was ihren Abbau durch Esterasen unter physiologischen Bedingungen erleichtert. Unter den pBAE-Bibliothekskandidaten zeigten diejenigen, die mit endkationischen Oligopeptiden funktionalisiert wurden, eine höhere Fähigkeit, kleine Nanopartikel zu bilden, um durch Endozytose effizient in Zellen einzudringen und das verkapselte Genmaterial zu transfizieren. Darüber hinaus ermöglicht die Versauerung des Endosomenkompartiments dank ihrer Pufferkapazität ein endosomales Entweichen12,13. Nämlich eine spezifische Art von pBAE, einschließlich hydrophober Einheiten auf ihrem Rückgrat (die sogenannte c6 pBAE), um ihre Stabilität zu verbessern, und eine End-Oligopeptid-Kombination (60% des polymeren modifizierten Polymers mit einem Tri-Lysin und 40% des Polymers mit einem Tri-Histidin), die selektiv Antigen-präsentierende Zellen nach parenteraler Verabreichung transfiziert und die mRNA-kodierte Antigenpräsentation gefolgt von einer Mäuse-Immunisierung erzeugt, wurde kürzlich veröffentlicht14 . Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass diese Formulierungen einen der Hauptengpässe von Nanomedizinformulierungen umgehen könnten: die Möglichkeit, sie zu gefriertrocknen, ohne ihre Funktionalität zu verlieren, was eine Langzeitstabilität in weichen, trockenen Umgebungen ermöglicht15.
In diesem Zusammenhang besteht das Ziel des aktuellen Protokolls darin, das Verfahren zur Bildung der mRNA-Nanopartikel der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen, indem eine Beschreibung der kritischen Schritte im Protokoll gegeben und die Herstellung effizienter Impfstoffe für die Prävention von Infektionskrankheiten und Tumorbehandlungsanwendungen ermöglicht wird.
Das folgende Protokoll beschreibt das komplette Training zur Synthese von Oligopeptid-endmodifizierten Poly(beta-Aminoestern) - OM-pBAE-Polymeren, die weiterhin für die Nanopartikelsynthese verwendet werden. Im Protokoll ist auch die Formulierung von Nanopartikeln enthalten. Darüber hinaus werden kritische Schritte für den Erfolg des Verfahrens und repräsentative Ergebnisse bereitgestellt, um sicherzustellen, dass die resultierenden Formulierungen die erforderlichen Qualitätskontrollcharakterisierungsmerkmale erfüllen, um ein positives oder negatives Ergebnis zu definieren. Dieses Protokoll ist in Abbildung 1zusammengefasst.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

Die Impfung ist einer der größten Erfolge der modernen Gesellschaft und unverzichtbar bei der Kontrolle und Vorbeugung von Krankheiten. Traditionelle Impfstoffe bestanden aus ganz oder aus Bruchteilen des Infektionserregers. Es bleiben jedoch Herausforderungen bestehen, und neue Impfstofftechnologien sind obligatorisch. In diesem Zusammenhang hat die Verwendung von mRNA zu Immunisierungszwecken eine verbesserte Leistung gezeigt, wie die schnelle Zulassung von zwei mRNA-Impfstoffen zeigt, die eine SARS-CoV-2-Infektion verhindern. Neben dem Erfolg bei der Prävention von Virusinfektionen können mRNA-Impfstoffe auch für therapeutische Krebsanwendungen eingesetzt werden.
Dennoch macht die Instabilität der mRNA und ihre schnelle Clearance aus dem Körper aufgrund der Anwesenheit von Nukleasen ihre nackte Abgabe nicht möglich. In diesem Zusammenhang sind Nanoarzneimittel und insbesondere polymere Nanopartikel kritische mRNA-Abgabesysteme. Ziel dieses Artikels ist es daher, das Protokoll für die Formulierung und den Test eines mRNA-Impfstoffkandidaten auf Basis der proprietären polymeren Nanopartikel zu beschreiben. Die Synthese und chemische Charakterisierung der verwendeten Poly(beta-aminoester)-Polymere, ihre Komplexierung mit mRNA zu Nanopartikeln und ihre Lyophilisierungsmethodik werden hier diskutiert. Dies ist ein entscheidender Schritt zur Senkung der Lager- und Verteilungskosten. Schließlich werden die erforderlichen Tests zum Nachweis ihrer Fähigkeit, dendritische Modellzellen in vitro zu transfizieren und zu reifen, angezeigt. Dieses Protokoll wird der wissenschaftlichen Gemeinschaft, die an der Impfung arbeitet, aufgrund seiner hohen Vielseitigkeit zugute kommen, die es diesen Impfstoffen ermöglicht, eine Vielzahl von Krankheiten zu verhindern oder zu heilen.

Polymersynthese und -charakterisierung Das OM-pBAE-Syntheseverfahren ist in Abbildung 2 dargestellt. Wie Abbildung 2A zeigt, besteht der erste Schritt zur Gewinnung des OM-pBAE darin, das C6-pBAE durch Zugabe der Amine (1-Hexylamin und 5-Amino-1-pentanol, Verhältnis 1:1) zum Diakrylat (1,4-Butandioldiacrylat) zu synthetisieren. Diese Reaktion wird bei 90 °C für 20 h und unter ständigem Rühren durchgeführt. Danach wird eine Lösung von O...

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Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

Hier wird ein einfaches Protokoll zur Herstellung von mRNA-Nanopartikeln auf Basis von Poly(beta-Aminoester)-Polymeren vorgestellt, das einfach durch Änderung der verkapselten mRNA angepasst werden kann. Der Workflow für die Synthese der Polymere, der Nanopartikel und deren in vitro essentielle Charakterisierung werden ebenfalls beschrieben. Ein Proof-of-Concept zur Immunisierung wird ebenfalls hinzugefügt.

Synthese und Charakterisierung von mRNA-beladenen Poly(beta-Aminoestern) Nanopartikeln für Impfzwecke

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es zeigt, wie polymere Nanopartikel, verkapselte Nukleinsäuren in einem einfachen Schritt hergestellt werden. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Vielseitigkeit, da sie auf verschiedene Nukleinsäuren und Zelltypen angewendet werden kann. Die Verwendung einfacher Verfahren zur Partikelvorbereitung, wie Pipettieren nach oben und unten, und die Möglichkeit, die Stabilität der Nanopartikel und Trommelbedingungen durch Lyophilisation zu verlängern.Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto und Maria Navalon-Lopez, Doktorandin unseres Labors und Marta Diaz-Caballero, Postdoktorandin für unser Labor, demonstrieren das Verfahren. Zur Bildung von Polyplexen die zuvor hergestellten Polymere, C6-Peptid, Poly-Beta-Aminoester aufgetaut und die Lösung gewirbelt. Nach dem Pipettieren der Polymermischung nach oben und unten eine 12,5 Millimolallösung in Natriumacetat herstellen.Wirbeln Sie die Lösung und warten Sie 10 Minuten. Als nächstes bereiten Sie mRNA bei 0,5 Milligramm pro Milliliter vor und mischen Sie sie durch Pipettieren. Die Polymerlösung erneut vorwirbeln, dann die genetische Materiallösung in der Polymerlösung im Verhältnis eins zu eins in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen und das Röhrchen bei 25 Grad Celsius für 30 Minuten in einem Thermoblock inkubieren.Nach der Inkubation wird die Mischung mit ein bis zwei RNase-freien Wassern ausgefällt, indem die Probe in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben wird, das das Wasser enthält, und dann, um die Hilfsstoffe einzuschließen, eine 20 Millimollar-Haufen und 4% Saccharoselösung im gleichen Volumen wie die Mischung aus mRNA- und Poly-Beta-Aminoestern hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt werden. Für die Lyophilisation nach dem Einfrieren der Polyplexlösung bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde führen Sie die Primärtrocknung durch und lagern Sie die Polyplexe dann sofort bei minus 20 Grad Celsius, um eine Rehydratation zu vermeiden. Für die Polyplex-Resuspension entfernen Sie die lyophilisierten Nanopartikel aus dem minus 20 Grad Celsius gefrierenden Gefrierschrank und fügen Sie schnell die entsprechende Menge an tief hydriertem Wasser hinzu, um den Feststoff wieder zu dispergieren und die gewünschte Konzentration zu erreichen.Sanft pipettieren, bis die vollständige Wiederverwendung erfolgt, und nach dem Auflösen kräftig auf und ab pipettieren, um Blasen zu vermeiden. Legen Sie nach 24 Stunden Transfektion zur qualitativen Beurteilung durch Fluoreszenzmikroskopie die 96-Well-Platte mit den transfizierten Hela-Zellen auf das Mikroskop und beginnen Sie mit der Visualisierung mit dem 10-fachen Objektiv. Wenden Sie zuerst einen Weißabgleich an, um eine Hintergrundreferenz für die Software zu erstellen, und erfassen Sie dann ein Bild, um es während der Analyse mit dem Fluoreszenzbild zu überlagern.Ändern Sie den Mikroskopmodus in den Reflexionsmodus und bewegen Sie das Filterrad zum blauen Laser, um EGFP zu visualisieren. Nehmen Sie dann Bilder für alle Bedingungen oder Vertiefungen mit der gleichen Belichtungszeit auf. Für die quantitative Beurteilung mittels Durchflusszytometrie waschen Sie die hela-zellen, die in einer 96-Well-Platte transfiziert sind, mit 100 Mikrolitern PBS pro Well.Nach dem Absaugen des PBS bei 25 Mikrolitern Trypsin pro Vertiefung und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie das zuvor wiederhergestellte Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und fixieren Sie dann die Zellen, indem Sie 31,25 Mikroliter 10% Formalin pro Vertiefung hinzufügen und 20 Minuten lang inkubieren. Schalten Sie als Nächstes das Durchflusszytometer und die Software ein und richten Sie dann die richtigen Bedingungen für das Experiment ein, einschließlich der Art des Plattenprobenvolumens und anderer Parameter wie Schütteln und Spülen zwischen den Proben.Richten Sie die geeigneten Parameter ein, um den Prozentsatz der positiv transfizierten Zellen zu quantifizieren, indem Sie zuerst die Strömungsdaten auf vorwärts gestreutes Licht im Vergleich zu seitlichem Streulicht betrachten, um die Zellen von den Trümmern zu unterscheiden. Und dann ein weiteres Streudiagramm aufzeichnen, das die Amplitude im Vergleich zur Höhe vergleicht, um einzelne Zellen zu gateen und zu unterscheiden. Einen Tag vor der Transfektion, Platte 10.000 JAWS II-Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte für die Inkubation über Nacht.Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit 0,6 Mikrogramm mRNA pro Vertiefung und inkubieren die Platte für 24 Stunden in einem Trockenluftinkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Waschen Sie am nächsten Tag die im Brunnen verbleibenden Zellen mit 25 Mikrolitern PBS. Nach dem Absaugen des PBS bei 25 Mikrolitern Trypsin und inkubieren Sie die Platte für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu lösen.Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion, indem Sie die zuvor wiederhergestellten Medien in den Korrespondentenbrunnen geben. Dann zentrifugieren Sie die Platte, saugen Sie das Medium ab und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter PBS und 2,5% Formalin pro Vertiefung hinzufügen, gefolgt von der Inkubation der Platte bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, zentrifugieren Sie die Platte. Dann fügen Sie 50 Mikroliter PBS und 3% BSA pro Vertiefung und Inkubator für 30 Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.Nach der Inkubation die Platte erneut zentrifugieren, dann 50 Mikroliter des Maus-Ovalbumin-Antikörpers in PBS und 3% BSA und Inkubator für 30 Minuten bei vier Grad Celsius geben. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und waschen Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern PBS. Nach dem Absaugen des PBS die sekundären Antikörper hinzufügen und eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren.Wiederholen Sie nach der Inkubation die Zentrifugations- und Waschschritte. Dann resuspendieren Sie die Zellen und 100 Mikroliter PBS und 2,5% Formalin für die Durchflusszytometrie-Analyse. Die physikalisch-chemische Charakterisierung von frischen und lyophilisierten GFP-mRNA-verkapselnden Nanopartikeln zeigt keine signifikanten Unterschiede in Größe und Polydispergierindex.Die Transmissionselektronenmikroskopie der Polyplexe bestätigt die Bildung von sphärischen und monodispersen Nanopartikeln mit einem Durchmesser von etwa 50 Nanometern. Verkapselungseffizienzdaten eines Lego-Peptids und modifizierter Poly-Beta-Aminoester-Polyplexe, die GFP oder Ovalbumin verkapseln, zeigen keine signifikanten Unterschiede je nach Art der mRNA. Eine qualitative Analyse der EGFP-Expression, 24 Stunden nach der Transaktion in der JAWS II-Zelllinie, ist hier dargestellt.Quantitativ im Vergleich zur Negativkontrolle. Der Prozentsatz der GFP-positiven Zellen ist signifikant höher und vergleichbar mit einer Positivkontrolle, die mit einem klassischen Transfektionsreagenz durchgeführt wird. Das ovalbumin mRNA-beladene Oligopeptid und modifizierte Poly-Beta-Aminoester-Nanopartikel können dendritische Zellen aktivieren, wie die signifikant höhere Expression von CD11b- und CD86-Membranmarkern in transfizierten Zellen im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen zeigt.Unsere Impfplattform, die auf der Verwendung von mRNA als Wirkstoff basiert, sowie unsere proprietären Polymere können sowohl für den Einsatz in der Prophylaxe als auch für Krebstherapeutika angepasst werden. Wir können unsere Technologie nutzen, um diesen Beitrag in Krebsimmuntherapeutika hervorzuheben. da wir tumorassoziierte Antigene in unseren Nanopartikeln verkapseln und eine Verschiebung in der Krebsbehandlung vornehmen können.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulierung von Diblock Polymernanopartikel durch Nanopräzipitation Technik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Forschung

Biotechnik

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Hochdurchsatz-Synthese von Kohlenhydraten und Funktionalisierung von Nanopartikeln Polyanhydrid

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics für Chemische Synthese und Zeitaufgelöste mechanistische Studien

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Mikrowelle gesteuerte Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für die schnelle Erkennung von Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...