Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

תמיכה כספית מ- MINECO /FEDER (מענקים SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 ו- COV20/01100) מוכרת. CGF הודתה מלגת IQS הדוקטורט שלה.

1. סינתזה של פולימר pBAE עם אוליגופפטידים סוף (OM-pBAE)
<ol><li>פילמור של C6-pBAE<ol>
<li>הוסף 5-אמינו-1-פנטנול (38 mmol; MW = 103.16 Da) 1-הקסילמין (38 mmol; MW = 101.19 Da) לתוך בקבוק זכוכית עגולה (100 מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 1,4-בוטנדיול דיאקרילט (82 mmol; MW = 198.22 Da).</li>
		<li>מחממים מראש את אמבט שמן הסיליקון ב-90 מעלות צלזיוס, מניחים את הבקבוקו...

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year.">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li><li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2:+a+preliminary+report+of+a+phase+1/2,+single-blind,+randomised+controlled+trial.">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li><li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA:+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines.">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li><li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+mRNA+vaccines.">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li><li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy.">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li><li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines:+impact+on+translational+nanomedicine.">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li><li>Guerrero-C&#225;zares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li><li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells.">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li><li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopeptide-terminated+poly(&#946;-amino+ester)s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization.">Oligopeptide-terminated poly(&#946;-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li><li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing,+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+(beta-amino+ester)s+(PBAEs).">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li><li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo.">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).</li><li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., L&#225;zaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes.">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles.">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications:+size,+surface+charge+and+stability.">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li><li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

לאחר פרוץ מגפת Covid-19 בשנה שעברה, החשיבות של חיסונים במונחים של בקרת מחלות זיהומיות באה לידי ביטוי כמרכיב קריטי8. מאמצי מדענים ברחבי העולם אפשרו את שחרורם לשוק של חיסונים רבים. בפעם הראשונה בהיסטוריה, חיסוני mRNA הוכיחו את הצלחתם המשוערת בעבר, הודות לעיצוב המהיר שלהם בגלל יכולתם ל...

מחלות זיהומיות מהוות איום חמור על מיליוני בני אדם ברחבי העולם, והן עדיין אחד הגורמים המובילים למוות בכמה מדינות מתפתחות. חיסון מניעתי היה אחת ההתערבויות היעילות ביותר של החברה המודרנית כדי למנוע ולשלוט במחלות זיהומיות1,2. אבני דרך קריטיות אלה של המדע ברלוונטיות של המאהה-20 נאמרו על ידי מגיפת Covid-19 העולמית האחרונה שנגרמה על ידי נגיף SARS-CoV-23. מתוך הכרה בחשיבות של חיסונים יעילים לצמצום הפצת המחלה, מאמצי שיתוף פעולה מכל הקהילות הביו-רפואיות הביאו בהצלחה לחיסונים מניעתיים רבים בשוק תוך פחות משנה4.
באופן מסורתי, חיסונים היו מורכבים מווירוסים מוחלשים (חיים, הפחתת ארס) או מומתים (חלקיקי מוות). עם זאת, עבור מחלות מסוימות ללא מרווח לשגיאות בטיחות, חלקיקים ויראליים אינם אפשריים, ו- subunits חלבון משמשים במקום. עם זאת, subunits בדרך כלל לא מאפשר שילוב של יותר אפיטופ אחד / אנטיגן, ואדג'ובנטים נדרשים כדי לשפר את עוצמת החיסון5,6. לכן, הצורך בסוגי חיסונים חדשניים ברור.
כפי שהוכח במהלך המגפה הנוכחית, מועמדים חדשים לחיסון המבוססים על חומצות גרעין יכולים להיות יתרון מבחינת הימנעות מתהליכי פיתוח ארוכים ומתן רב-תכליתיות גבוהה תוך ייצור, במקביל, חיסון חיוני למטופל. זהו המקרה של חיסוני mRNA, שתוכננו בתחילה כחיסונים ניסיוניים לסרטן. הודות ליכולת הטבעית שלהם לייצר תגובות תאי T ספציפיות אנטיגן3,5,6,7. בהיותה mRNA המולקולה המקודדת את החלבון האנטיגני, רק משתנה זהה, ניתן להתאים את החיסון במהירות כדי לחסן וריאנטים אחרים של אותו מיקרואורגניזם, זנים שונים, מיקרואורגניזמים זיהומיים אחרים, או אפילו להפוך לטיפול אימונותרפי לסרטן. בנוסף, הם יתרון במונחים של עלויות ייצור בקנה מידה גדול. עם זאת, ל-mRNA יש משוכה משמעותית המעכבת את הממשל העירום שלהם: יציבותו ויושרו נפגעות בתקשורת הפיזיולוגית, מלאות גרעין. מסיבה זו, השימוש במנשא ננומטרי שמגן עליו וקטורינג mRNA לתאים המציגים אנטיגן נדרש2,8.
בהקשר זה, פולי (אמינו בטא) (pBAE) הם סוג של פולימרים ביו-תואמים ומתכלים שהפגינו יכולת יוצאת דופן ל-mRNA מורכב בחלקיקים ננומטריים, הודות למטענים הקטיים שלהם9,10,11. פולימרים אלה מורכבים קשרים אסתר, מה שהופך את השפלתם קלה על ידי אסטראזות בתנאים פיזיולוגיים. בין המועמדים לספריית pBAE, אלה שתפקדו עם אוליגופפטידים קטיקטיים בסופו הראו יכולת גבוהה יותר ליצור חלקיקים קטנים לחדור ביעילות לתאים באמצעות אנדוציטוזיס ולהדביק את חומר הגן encapsulated. יתר על כן, הודות ליכולת האגירה שלהם, החמצת התא אנדוזום מאפשרת בריחה אנדוזומית12,13. כלומר, סוג מסוים של pBAE, כולל עגבת הידרופובית על עמוד השדרה שלהם (מה שנקרא C6 pBAE) כדי לשפר את היציבות שלהם ואת השילוב הסופי-אוליגופפטידים (60% של פולימר שונה עם תלת ליצין ו 40% של הפולימר עם tri-histidine) כי באופן סלקטיבי טרנסקלציה אנטיגן מציג תאים לאחר ניהול parenteral לייצר את מצגת אנטיגן מקודד mRNA ואחריו חיסון עכברים פורסם לאחרונה14 . בנוסף, הוכח גם כי ניסוחים אלה יכולים לעקוף את אחד השלבים צוואר הבקבוק העיקרי של ניסוחים nanomedicine: האפשרות להקפיא לייבש אותם מבלי לאבד את הפונקציונליות שלהם, המאפשר יציבות לטווח ארוך בסביבות יבשותרכות 15.
בהקשר זה, מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להפוך את ההליך להיווצרות חלקיקי mRNA לזמינים לקהילה המדעית על ידי מתן תיאור הצעדים הקריטיים בפרוטוקול ומאפשר ייצור חיסונים יעילים ליישומים למניעת מחלות זיהומיות וטיפול בגידולים.
הפרוטוקול הבא מתאר את האימון המלא לסנתז אוליגופפטיד שינוי קצה פולי (אמינו בטא) - פולימרים OM-pBAE שישמשו עוד יותר עבור סינתזה ננו-חלקיקים. בפרוטוקול, ניסוח ננו-חלקיקים כלול גם. בנוסף, ניתנים גם צעדים קריטיים להצלחת ההליך והתוצאות הייצוגיות כדי להבטיח שהניסוחים המתקבלים ישיגו את תכונות אפיון בקרת האיכות הנדרשות כדי להגדיר תוצאה חיובית או שלילית. פרוטוקול זה מסוכם באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

חיסון היה אחת ההצלחות הגדולות של החברה המודרנית והוא הכרחי בשליטה ומניעת מחלות. חיסונים מסורתיים היו מורכבים מכל או שברים של חומר זיהומיות. עם זאת, האתגרים נותרו, וטכנולוגיות חיסונים חדשות הן חובה. בהקשר זה, השימוש ב- mRNA למטרות חיסון הראה ביצועים משופרים, כפי שהוכח באישור מהיר של שני חיסוני mRNA המונעים זיהום SARS-CoV-2. מעבר להצלחה במניעת זיהומים ויראליים, חיסוני mRNA יכולים לשמש גם ליישומי סרטן טיפוליים.
עם זאת, חוסר היציבות של mRNA ואת הסיווג המהיר שלה מהגוף בשל נוכחות של גרעינים עושה את המסירה העירומה שלה לא אפשרי. בהקשר זה, ננו-רפואה, ובמיוחד חלקיקים פולימריים, הן מערכות מסירה קריטיות של mRNA. לכן, מטרת מאמר זה היא לתאר את הפרוטוקול לגיבוש ובדיקה של מועמד לחיסון mRNA המבוסס על חלקיקים פולימריים קנייניים. הסינתזה והאפיון הכימי של פולי (בטא אמינואסטרים) פולימרים המשמשים, המורכבות שלהם עם mRNA כדי ליצור חלקיקים, ומתודולוגיית lyophilization שלהם יידונו כאן. זהו צעד מכריע להפחתת עלויות האחסון וההפצה. לבסוף, הבדיקות הנדרשות כדי להפגין את יכולתם במבחנה transfect ומודל בוגר תאים דנדריטיים יצוינו. פרוטוקול זה יועיל לקהילה המדעית העובדת על חיסון בשל הרבגוניות הגבוהה שלו המאפשרת לחיסונים אלה למנוע או לרפא מגוון רחב של מחלות.

סינתזה ואפיון פולימרים הליך הסינתזה של OM-pBAE ניתן באיור 2. כפי שמראה איור 2A, הצעד הראשון להשגת ה-OM-pBAE הוא לסנתז את ה-C6-pBAE על ידי הוספת האמינים (1-הקסילאמין ו-5-אמינו-1-פנטנול, יחס 1:1) ל-diacrylate (1,4-בוטנדיול ניאקרילט). תגובה זו מתבצעת ב 90 °C (50 °F) במשך 20 שעות עם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

כאן, פרוטוקול פשוט מוצג לייצור חלקיקי mRNA המבוססים על פולי (בטא אמינואסטר) פולימרים, קל להתאמה על ידי שינוי mRNA אנקפסולציה. זרימת העבודה לסינתזה של הפולימרים, הננו-חלקיקים והאפיון החיוני שלהם מתוארים גם הם. כמו כן מתווספת הוכחת תפיסה בנוגע לחיסון.

סינתזה ואפיון של חלקיקי פולי (בטא אמינואסטרים) טעונים mRNA למטרות חיסון

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא מדגים, כיצד להכין חלקיקים פולימריים, חומצות גרעין אנקפסולציה בצעד אחד פשוט. היתרונות העיקריים של טכניקה זו, הם צדדיות, כפי שהוא יכול להיות מיושם על חומצות גרעין וסוגי תאים שונים. השימוש בהליכים פשוטים להכנת חלקיקים, כגון צנרת למעלה ולמטה, ואת האפשרות להרחיב את היציבות של חלקיקים ותנאי תוף על ידי ליופיליזציה.מי שידגימו את ההליך יהיו לורה אולמו, קורל גרסיה-פרננדז, מריה סטמפה לופז-פינטו ומריה נבאלון-לופז, דוקטורנטית במעבדה שלנו ומרתה דיאז-קבלרו, פוסט-דוקטורט במעבדה שלנו. להיווצרות פוליפלקסים, הפשירו את הפולימרים שהוכנו בעבר, פפטיד C6, אסטרים פולי בטא אמינו, ומערבולת הפתרון. לאחר צנרת תערובת הפולימר למעלה ולמטה, להכין פתרון 12.5 מילימולר נתרן אצטט.מערבולת הפתרון ולחכות 10 דקות. לאחר מכן, להכין mRNA ב 0.5 מיליגרם למיליליטר מעורבב על ידי pipetting. מערבולת את הפתרון הפולימרי שוב, ואז לערבב את הפתרון החומרי הגנטי בתמיסת הפולימר ביחס של אחד לאחד בצינור צנטריפוגה מיקרו ודגורת הצינור ב 25 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתרמובלוק.לאחר הדגירה לזרז את התערובת עם אחד עד שני מים חינם RNase על ידי הוספת המדגם צינור צנטריפוגה מיקרו המכיל את המים, ולאחר מכן לכלול את excipients, להוסיף ערימות 20 מילימולר 4% תמיסת סוכרוז באותו נפח כמו תערובת של אסטרים אמינו mRNA ופולי בטא, מעורבב על ידי pipetting. עבור Lyophilization לאחר הקפאת פתרון polyplex במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, לבצע את הייבוש העיקרי, ולאחר מכן מיד לאחסן את polyplexes במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי למנוע התייבשות. עבור resuspension polyplex, להסיר את ננו-חלקיקים ליופילי ממקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס ולהוסיף במהירות את הכמות המתאימה של מים מוקשים עמוקים כדי לפזר מחדש את המוצק והשיג את הריכוז הרצוי.פיפטה בעדינות עד לחידוש מוחלט ופעם מומסת, פיפטה למעלה ולמטה במרץ הימנעות בועות. לאחר 24 שעות של טרנספקטציה להערכה איכותית על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הנח את צלחת 96 הבאר המכילה את תאי הלה שהודבקו על המיקרוסקופ והתחל לדמיין באמצעות המטרה 10 פעמים. ראשית, להחיל איזון לבן כדי ליצור הפניית רקע עבור התוכנה, ולאחר מכן לרכוש תמונה כדי לכסות אותו עם תמונת פלואורסצנטיות במהלך הניתוח.שנה את מצב המיקרוסקופ למצב השתקפות והזז את גלגל המסנן ללייזר הכחול כדי לדמיין EGFP. לאחר מכן לרכוש תמונות עבור כל התנאים או בארות המעסיקים את אותו זמן חשיפה. להערכה כמותית על ידי ציטומטריית זרימה, לשטוף את תאי Hela transfected בצלחת 96 היטב באמצעות 100 microliters של PBS לבאר.לאחר שאיפה PBS ב 25 microliters של טריפסין לבאר ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר שהתאים מנותקים, הוסף את המדיה ששוחזרה בעבר כדי לנטרל את טריפסין, ולאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 31.25 microliters של 10% פורמלין לבאר ודגרה במשך 20 דקות. הבא להפעיל את cytometer הזרימה ואת התוכנה, ולאחר מכן להגדיר את התנאים המתאימים עבור הניסוי, כולל סוג של נפח דגימת צלחת ופרמטרים אחרים כגון רועד ושטיפה בין דגימות.הגדר את הפרמטרים המתאימים כדי לכמת את אחוז התאים שהועברו באופן חיובי על-ידי הצגת נתוני הזרימה באור מפוזר קדימה לעומת אור מפוזר בצד כדי להבחין בין התאים לבין הפסולת. ואז מתווים עוד פיזור, משווים את המשרעת לעומת הגובה לשער ומפלים תאים בודדים. יום אחד לפני ההדבקה, צלחת 10, 000 תאי JAWS II לבאר בצלחת 96 באר לדגירה בין לילה.למחרת להדביק את התאים עם 0.6 מיקרוגרם mRNA לבאר ולדגירה את הצלחת במשך 24 שעות בחממה אוויר יבש ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, לשטוף את התאים שנותרו בבאר עם 25 microliters של PBS. לאחר שאיפה PBS ב 25 microliters של טריפסין ודגורת הצלחת במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס לנתק את התאים.הפסק את תגובת טריפסין על-ידי הוספת המדיה שנמצאה בעבר לבאר הכתב. לאחר מכן צנטריפוגה הצלחת, לשאוף את התקשורת, ולתקן את התאים על ידי הוספת 50 microliters של PBS ו 2.5% פורמלין לבאר ואחריו דגירה הלוח בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, צנטריפוגה הצלחת. לאחר מכן להוסיף 50 microliters של PBS ו 3%BSA לבאר אינקובטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר דגירה צנטריפוגה הצלחת שוב, ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של נוגדן אליבבומין העכבר PBS ו 3%BSA אינקובטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב צנטריפוגה, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 50 microliters של PBS. לאחר שאיפה PBS, להוסיף את הנוגדנים המשניים ודגרה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, חזור על צנטריפוגה וצעדי כביסה. לאחר מכן respend התאים ו 100 microliters של PBS ו 2.5% פורמלין לניתוח ציטומטריית זרימה. אפיון פיזיוכימי של חלקיקי GFP mRNA טריים וליופיליים אינו מראה הבדלים משמעותיים בגודל ובמדד פיזור פולי.מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור של polyplexes מאשר היווצרות של חלקיקים כדוריים ומונו מפוזרים בקוטר של כ -50 ננומטר. נתוני יעילות אנקפסולציה של פפטיד לגו ופוליפלקסים פולי בטא אמינו שונה תמצית GFP, או אליבאמין להראות הבדלים משמעותיים בהתאם לסוג של mRNA. ניתוח איכותי של ביטוי EGFP, 24 שעות לאחר העסקה בקו התא JAWS II מוצג כאן.כמותית בהשוואה לפקד השלילי. אחוז התאים החיוביים של GFP גבוה משמעותית ודומה לשליטה חיובית המבוצעת עם ריאגנט טרנס-זיהום קלאסי. אליקופפטיד טעון ovalbumin mRNA ו poly beta אמינו אסטר חלקיקים שונה יכול להפעיל תאים דנדריטי כפי שניתן לראות על ידי הביטוי גבוה משמעותית של CD11b וסמני ממברנה CD86 בתאים שעברו טרנספקט בהשוואה לתאים שאינם שעברו טרנס-זיהום.פלטפורמת החיסונים שלנו המבוססת על השימוש ב- mRNA כעיקרון הפעיל, כמו גם ניתן להתאים את הפולימרים הקנייניים שלנו לשימוש במניעה כמו גם לטיפול בסרטן. אנו יכולים להשתמש בטכנולוגיה שלנו כדי להדגיש את התרומה הזו באימונותרפיה של סרטן. מאז אנחנו יכולים לתמצת אנטיגנים הקשורים לגידול בננו-חלקיקים שלנו ולעשות שינוי בטיפולים בסרטן.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

גיבוש חלקיקים פולימריים Diblock באמצעות טכניקה Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

סינתזה, הרכבה, אפיון monolayer מוגן סרטים Nanoparticle זהב עבור אלקטרוכימיה monolayer חלבון

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics לסינתזה כימית וזמן נפתר מכניסטית לימודים

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

סינתזה מיקרוגל מונחה של תחמוצת ברזל חלקיקים עבור איתור מהיר של טרשת עורקים

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...