Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
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Viene riconosciuto il sostegno finanziario di MINECO/FEDER (sovvenzioni SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 e COV20/01100). CGF ha riconosciuto la sua IQS PhD Fellowship.

1. Sintesi del polimero pBAE con oligopeptidi terminali (OM-pBAE)
<ol><li>Polimerizzazione di C6-pBAE<ol>
<li>Aggiungere 5-ammino-1-pentanolo (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-esilamine (38 mmol; MW = 101,19 Da) in un pallone di vetro a fondo tondo (100 ml). Quindi, aggiungere 1,4-butandiolo diacrilato (82 mmol; MW = 198,22 Da).</li>
		<li>Preriscaldare il bagno di olio siliconico a 90 °C, posizionare il matraccio a fondo tondo nel bagno d'olio e mescolare la miscela con l'aiuto di una barra magnetica per una notte (~18 h)....

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year.">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li><li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2:+a+preliminary+report+of+a+phase+1/2,+single-blind,+randomised+controlled+trial.">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li><li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA:+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines.">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li><li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+mRNA+vaccines.">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li><li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy.">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li><li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines:+impact+on+translational+nanomedicine.">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li><li>Guerrero-C&#225;zares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li><li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells.">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li><li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopeptide-terminated+poly(&#946;-amino+ester)s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization.">Oligopeptide-terminated poly(&#946;-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li><li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing,+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+(beta-amino+ester)s+(PBAEs).">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li><li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo.">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).</li><li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., L&#225;zaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes.">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles.">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications:+size,+surface+charge+and+stability.">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li><li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

Dopo lo scoppio della pandemia di Covid-19 lo scorso anno, l'importanza dei vaccini in termini di controllo delle malattie infettive si è manifestata come componente critica8. Gli sforzi degli scienziati di tutto il mondo hanno permesso il rilascio sul mercato di molti vaccini. Per la prima volta nella storia, i vaccini a mRNA hanno dimostrato il loro successo precedentemente ipotizzato, grazie alla loro rapida progettazione a causa della loro capacità di adattarsi a qualsiasi nuovo antigene ent...

Le malattie infettive hanno rappresentato una grave minaccia per milioni di esseri umani in tutto il mondo e sono ancora una delle principali cause di morte in alcuni paesi in via di sviluppo. La vaccinazione profilattica è stata uno degli interventi più efficaci della società moderna per prevenire e controllare le malattie infettive1,2. Queste pietre miliari critiche della scienza nella rilevanza del20 °secolo sono state osservate dalla recente pandemia mondiale di Covid-19 causata dal virus SARS-CoV-23. Riconoscendo l'importanza di avere vaccini efficienti per limitare la diffusione della malattia, gli sforzi di cooperazione di tutte le comunità biomediche hanno portato con successo a molti vaccini profilattici sul mercato in meno di un anno4.
Tradizionalmente, i vaccini erano composti da virus attenuati (vivi, a ridotta virulenza) o inattivati (particelle di morte). Tuttavia, per alcune malattie senza margine di errori di sicurezza, le particelle virali non sono possibili e vengono invece utilizzate subunità proteiche. Tuttavia, le subunità di solito non consentono la combinazione di più di un epitopo / antigene e gli adiuvanti sono necessari per migliorare la potenza della vaccinazione5,6. Pertanto, la necessità di nuovi tipi di vaccini è chiara.
Come dimostrato durante l'attuale pandemia, nuovi candidati vaccini a base di acidi nucleici possono essere vantaggiosi in termini di evitare lunghi processi di sviluppo e fornire un'elevata versatilità producendo, allo stesso tempo, un'immunizzazione vitale del paziente. Questo è il caso dei vaccini a mRNA, che sono stati inizialmente progettati come vaccini sperimentali contro il cancro. Grazie alla loro naturale capacità di produrre risposte antigene-specifiche delle cellule T3,5,6,7. Essendo l'mRNA la molecola che codifica la proteina antigenica, cambiando solo la stessa, il vaccino può essere rapidamente adattato per immunizzare altre varianti dello stesso microrganismo, ceppi diversi, altri microrganismi infettivi o addirittura diventare un trattamento immunoterapeutico del cancro. Inoltre, sono vantaggiosi in termini di costi di produzione su larga scala. Tuttavia, l'mRNA ha un ostacolo significativo che ostacola la loro somministrazione nuda: la sua stabilità e integrità sono compromesse in mezzi fisiologici, pieni di nucleasi. Per questo motivo, è richiesto l'uso di un vettore nanometrico che lo protegga e vettorizzi l'mRNA alle cellule che presentano l'antigene2,8.
In questo contesto, i poli(beta aminoesteri) (pBAE) sono una classe di polimeri biocompatibili e biodegradabili che hanno dimostrato una notevole capacità di complessare mRNA in particelle nanometriche, grazie alle loro cariche cationiche9,10,11. Questi polimeri sono composti da legami estere, che rendono facile la loro degradazione da parte delle esterasi in condizioni fisiologiche. Tra i candidati della libreria pBAE, quelli funzionalizzati con oligopeptidi cationici finali hanno mostrato una maggiore capacità di formare piccole nanoparticelle per penetrare in modo efficiente nelle cellule attraverso l'endocitosi e trasfettare il materiale genico incapsulato. Inoltre, grazie alla loro capacità tampone, l'acidificazione del compartimento endosomico permette la fuga endosomiale12,13. Vale a dire, un tipo specifico di pBAE, comprese le parti idrofobiche sulla loro spina dorsale (il cosiddetto PBAE C6) per migliorare la loro stabilità e la combinazione end-oligopeptide (60% del polimero modificato con una tri-lisina e il 40% del polimero con una tri-istidina) che trasfetta selettivamente le cellule che presentano l'antigene dopo somministrazione parenterale e producono la presentazione dell'antigene codificato mRNA seguita dall'immunizzazione dei topi è stato recentemente pubblicato14 . Inoltre, è stato anche dimostrato che queste formulazioni potrebbero aggirare uno dei principali passaggi di collo di bottiglia delle formulazioni di nanomedicina: la possibilità di liofilizzarle senza perdere la loro funzionalità, che consente una stabilità a lungo termine in ambienti morbidi e asciutti15.
In questo contesto, l'obiettivo dell'attuale protocollo è quello di mettere a disposizione della comunità scientifica la procedura per la formazione delle nanoparticelle di mRNA fornendo una descrizione delle fasi critiche del protocollo e consentendo la produzione di vaccini efficienti per la prevenzione delle malattie infettive e le applicazioni di trattamento dei tumori.
Il seguente protocollo descrive l'allenamento completo per sintetizzare poli(beta aminoesters) aerotessuti oligopeptidi modificati - polimeri OM-pBAE che saranno ulteriormente utilizzati per la sintesi di nanoparticelle. Nel protocollo è inclusa anche la formulazione di nanoparticelle. Inoltre, vengono forniti anche passaggi critici per il successo della procedura e risultati rappresentativi per garantire che le formulazioni risultanti soddisfino le caratteristiche di caratterizzazione del controllo di qualità richieste per definire un risultato positivo o negativo. Questo protocollo è riassunto nella Figura 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

La vaccinazione è stata uno dei maggiori successi della società moderna ed è indispensabile per controllare e prevenire le malattie. I vaccini tradizionali erano composti da interi o frazioni dell'agente infettivo. Tuttavia, le sfide rimangono e le nuove tecnologie vaccinali sono obbligatorie. In questo contesto, l'uso dell'mRNA a scopo immunizzante ha mostrato prestazioni migliorative, come dimostrato dalla rapida approvazione di due vaccini a mRNA che prevengono l'infezione da SARS-CoV-2. Oltre al successo nella prevenzione delle infezioni virali, i vaccini a mRNA possono anche essere utilizzati per applicazioni terapeutiche sul cancro.
Tuttavia, l'instabilità dell'mRNA e la sua rapida eliminazione dal corpo a causa della presenza di nucleasi rende impossibile la sua consegna nuda. In questo contesto, i nanofarmaci, e in particolare le nanoparticelle polimeriche, sono sistemi critici di rilascio di mRNA. Pertanto, lo scopo di questo articolo è quello di descrivere il protocollo per la formulazione e il test di un candidato vaccino a mRNA basato sulle nanoparticelle polimeriche proprietarie. La sintesi e la caratterizzazione chimica dei polimeri poli(beta aminoesteri) utilizzati, la loro complessazione con mRNA per formare nanoparticelle e la loro metodologia di liofilizzazione saranno discusse qui. Questo è un passo cruciale per ridurre i costi di stoccaggio e distribuzione. Infine, saranno indicati i test necessari per dimostrare la loro capacità di trasfettare in vitro e maturare cellule dendritiche modello. Questo protocollo andrà a beneficio della comunità scientifica che lavora sulla vaccinazione a causa della sua elevata versatilità che consente a questi vaccini di prevenire o curare un'ampia varietà di malattie.

Sintesi e caratterizzazione dei polimeri La procedura di sintesi OM-pBAE è riportata nella Figura 2. Come mostra la Figura 2A, il primo passo per ottenere l'OM-pBAE è sintetizzare il C6-pBAE aggiungendo le ammine (1-esilamine e 5-ammino-1-pentanolo, rapporto 1:1) al diacrilato (1,4-butandiolo diacrilato). Questa reazione viene effettuata a 90 °C per 20 ore e con agitazione costante. Successivamente, una soluzione di oligopeptidi viene aggi...

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Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

Qui viene presentato un semplice protocollo per la produzione di nanoparticelle di mRNA basate su polimeri poli(beta aminoestere), facili da personalizzare cambiando l'mRNA incapsulato. Viene inoltre descritto il flusso di lavoro per la sintesi dei polimeri, le nanoparticelle e la loro caratterizzazione essenziale in vitro. Viene aggiunta anche una prova di concetto per quanto riguarda l'immunizzazione.

Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle poli(beta aminoesters) caricate con mRNA a fini vaccinali

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Questo protocollo è significativo perché dimostra, come preparare nanoparticelle polimeriche, acidi nucleici incapsulati in un semplice passaggio. I principali vantaggi di questa tecnica sono la versatilità, in quanto può essere applicata a diversi acidi nucleici e tipi di cellule. L'uso di semplici procedure per la preparazione delle particelle, come il pipettaggio su e giù, e la possibilità di estendere la stabilità delle nanoparticelle e delle condizioni del tamburo mediante liofilizzazione.A dimostrare la procedura saranno Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto e Maria Navalon-Lopez, dottoranda del nostro laboratorio e Marta Diaz-Caballero, post doc per il nostro laboratorio. Per la formazione di poliplexi, scongelare i polimeri precedentemente preparati, il peptide C6, gli amminosteri poli beta e vorticare la soluzione. Dopo aver pipettato la miscela polimerica su e giù, preparare una soluzione da 12,5 millimolari in acetato di sodio.Vortice la soluzione e attendere 10 minuti. Quindi, preparare l'mRNA a 0,5 milligrammi per millilitro e miscelato mediante pipettaggio. Ruotare nuovamente la soluzione polimerica, quindi mescolare la soluzione di materiale genetico nella soluzione polimerica in un rapporto uno a uno in un tubo di micro centrifuga e incubare il tubo a 25 gradi Celsius per 30 minuti in un thermoblock.Dopo l'incubazione precipitare la miscela con uno o due acqua priva di RNasi aggiungendo il campione a una micro provetta di centrifuga contenente l'acqua, quindi per includere gli eccipienti, aggiungere un cumulo di 20 millimolari e una soluzione di saccarosio al 4% nello stesso volume della miscela di mRNA e amminoesteri poli beta e miscelati mediante pipettaggio. Per la liofilizzazione dopo aver congelato la soluzione di poliplex a meno 80 gradi Celsius per un'ora, eseguire l'essiccazione primaria, quindi conservare immediatamente i poliplexi a meno 20 gradi Celsius per evitare la reidratazione. Per la risospensione poliplex, rimuovere le nanoparticelle liofilizzate dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e aggiungere rapidamente la quantità corrispondente di acqua idrogenata profonda per disperdere nuovamente il solido e raggiungere la concentrazione desiderata.Pipettare delicatamente fino alla totale risospensione e una volta sciolto, pipettare su e giù vigorosamente evitando bolle. Dopo 24 ore di trasfezione per la valutazione qualitativa mediante microscopia a fluorescenza, posizionare la piastra a 96 pozzetti contenente le cellule Hela trasfettate al microscopio e iniziare a visualizzare utilizzando l'obiettivo 10 volte. Innanzitutto, applica un bilanciamento del bianco per creare un riferimento di sfondo per il software, quindi acquisisci un'immagine per sovrapporla all'immagine a fluorescenza durante l'analisi.Cambiare la modalità microscopio in modalità di riflessione e spostare la ruota del filtro sul laser blu per visualizzare EGFP. Quindi acquisire immagini per tutte le condizioni o pozzi che impiegano lo stesso tempo di esposizione. Per la valutazione quantitativa mediante citometria a flusso, lavare le cellule Hela trasfettate in una piastra a 96 pozzetti utilizzando 100 microlitri di PBS per pozzetto.Dopo aver aspirato il PBS a 25 microlitri di tripsina per pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Una volta staccate le cellule, aggiungere il supporto precedentemente recuperato per inattivare la tripsina, quindi fissare le cellule aggiungendo 31,25 microlitri del 10% di formalina per pozzetto e incubando per 20 minuti. Quindi accendere il citometro a flusso e il software, quindi impostare le condizioni corrette per l'esperimento, incluso il tipo di volume del campione di piastra e altri parametri come l'agitazione e il risciacquo tra i campioni.Impostare i parametri appropriati per quantificare la percentuale di cellule trasfettate positivamente visualizzando prima i dati di flusso sulla luce diffusa in avanti rispetto alla luce diffusa laterale per distinguere le celle dai detriti. E poi tracciare un altro grafico a dispersione, confrontando l'ampiezza rispetto all'altezza per gate e discriminare le singole celle. Un giorno prima della trasfezione, piastra 10.000 cellule JAWS II per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti per l'incubazione notturna.Il giorno seguente trasfettate le cellule con 0,6 microgrammi di mRNA per pozzetto e incubare la piastra per 24 ore in un incubatore ad aria secca a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo, lavare le cellule rimaste nel pozzo con 25 microlitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS a 25 microlitri di tripsina e incubare la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare le cellule.Fermare la reazione della tripsina aggiungendo il supporto precedentemente recuperato sul corrispondente bene. Quindi centrifugare la piastra, aspirare il mezzo e fissare le celle aggiungendo 50 microlitri di PBS e il 2,5% di formalina per pozzetto, quindi incubare la piastra a quattro gradi Celsius per 20 minuti, centrifugare la piastra. Quindi aggiungere 50 microlitri di PBS e 3% BSA per pozzetto e incubatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione centrifugare nuovamente la piastra, quindi aggiungere 50 microlitri dell'anticorpo ovalbumina del topo in PBS e 3% BSA e incubatore per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Ripetere la fase di centrifugazione, quindi lavare le celle con 50 microlitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere gli anticorpi secondari e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius.Dopo l'incubazione, ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio. Quindi risospese le cellule e 100 microlitri di PBS e 2,5% formalina per l'analisi della citometria a flusso. La caratterizzazione fisiochimica di nanoparticelle di mRNA GFP freschi e liofilizzati che incapsulano nanoparticelle non mostra differenze significative nelle dimensioni e nell'indice di polidisperibilità.La microscopia elettronica a trasmissione dei poliplex conferma la formazione di nanoparticelle sferiche e mono disperse di circa 50 nanometri di diametro. I dati sull'efficienza di incapsulamento di un peptide Lego e di poliplexi di poli beta-estere modificato che incapsulano GFP o ovalbumina non mostrano differenze significative a seconda del tipo di mRNA. Un'analisi qualitativa dell'espressione EGFP, 24 ore dopo la transazione nella linea cellulare JAWS II è mostrata qui.Quantitativamente rispetto al controllo negativo. La percentuale di cellule GFP positive è significativamente più alta e paragonabile a un controllo positivo eseguito con un reagente di trasfezione classico. L'oligopeptide caricato con mRNA ovalbumina e le nanoparticelle di estere poli-beta modificato possono attivare le cellule dendritiche come si vede dall'espressione significativamente più elevata dei marcatori di membrana CD11b e CD86 nelle cellule trasfettate rispetto alle cellule non trasfettate.La nostra piattaforma di vaccinazione basata sull'uso dell'mRNA come principio attivo, così come i nostri polimeri proprietari, possono essere adattati per essere utilizzati nella profilassi e per le terapie contro il cancro. Possiamo usare la nostra tecnologia per evidenziare quel contributo nell'immunoterapia del cancro. dal momento che possiamo incapsulare antigeni associati al tumore nelle nostre nanoparticelle e fare un cambiamento nei trattamenti contro il cancro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Ricerca

Bioingegneria

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