Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
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마인코/FEDER의 재정 지원(SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22, COV20/01100)의 재정 지원이 인정됩니다. CGF는 그녀의 IQS 박사 학위 펠로우십을 인정했다.

1. 끝 올리고펩타이드를 함유한 pBAE 폴리머합성(OM-pBAE)
<ol><li>C6-pBAE의 중합<ol>
<li>5-아미노-1-펜타놀을 추가 (38 mmol; MW = 103.16 다) 1-헥실라민 (38 mmol; MW = 101.19 Da)를 둥근 바닥 유리 플라스크(100 mL)로 넣습니다. 그런 다음 1,4-부탄디올 디아크릴레이트(82mmol)를 추가합니다. MW = 198.22 Da).</li>
		<li>실리콘 오일 목욕을 90°C에서 예열하고, 둥근 바닥 플라스크를 오일 목욕에 넣고 하룻밤 동안 자기 교반 바(~18...

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year.">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li><li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2:+a+preliminary+report+of+a+phase+1/2,+single-blind,+randomised+controlled+trial.">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li><li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA:+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines.">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li><li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+mRNA+vaccines.">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li><li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy.">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li><li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines:+impact+on+translational+nanomedicine.">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li><li>Guerrero-C&#225;zares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li><li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells.">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li><li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopeptide-terminated+poly(&#946;-amino+ester)s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization.">Oligopeptide-terminated poly(&#946;-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li><li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing,+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+(beta-amino+ester)s+(PBAEs).">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li><li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo.">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).</li><li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., L&#225;zaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes.">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles.">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications:+size,+surface+charge+and+stability.">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li><li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

작년에 Covid-19 전염병이 발병한 후, 전염병 통제 측면에서 백신의 중요성은 중요한 구성 요소8로나타났다. 전 세계 과학자들의 노력으로 많은 백신 시장이 출시되었습니다. 역사상 처음으로 mRNA 백신은 몇달내에 새로운 항원5,6,21에적응할 수 있는 능력 때문에 빠른 설계 덕분에 이전에 가설적인 성공을 입증했...

전염병은 전 세계 수백만 명의 인간에게 심각한 위협을 나타내고 있으며 여전히 일부 개발 도상국에서 주요 사망 원인 중 하나입니다. 예방 접종은 전염병을 예방하고 통제하기 위해 현대 사회의 가장 효과적인 개입 중 하나였습니다1,2. 20세기관련성에 있는 과학의 이 중요한 이정표는 SARS-CoV-2 바이러스3에기인한 최근 세계적인 Covid-19 전염병에 의해 언급되었습니다. 질병의 보급을 줄이기 위해 효율적인 백신을 갖는 것의 중요성을 인식, 모든 생물 의학 지역 사회에서 협력 노력은 성공적으로 1 년 이내에 시장에서 많은 예방 백신을 초래했다4.
전통적으로, 백신은 감쇠 (살아있는, 감소된 독성) 또는 불활성화 (죽음 입자) 바이러스로 구성되었다. 그러나, 안전 오류에 대한 여백이없는 일부 질병의 경우, 바이러스 성 입자는 불가능하고, 단백질 하위 단위는 대신 사용된다. 그럼에도 불구하고, 서브유닛은 일반적으로 하나 이상의 에피토프/항원의 조합을 활성화하지 않으며, 유족은 백신 접종 효능5,6을향상시켜야 한다. 따라서 새로운 백신 유형에 대한 필요성은 분명합니다.
현재 전염병 동안 입증된 바와 같이, 핵산을 기반으로 한 새로운 백신 후보는 긴 발달 과정을 피하고 동시에 중요한 환자 예방 접종을 생산하는 동안 높은 다기능성을 제공하는 측면에서 유리할 수 있다. 이것은 처음에 실험적인 암 백신으로 디자인된 mRNA 백신의 케이스입니다. 항원 특이적 T세포 반응3,5,6,7을생성하는 자연적인 능력 덕분. mRNA는 항원 단백질을 인코딩하는 분자로서, 단지 동일하게 변화하는, 백신은 동일한 미생물, 다른 균주, 다른 전염성 미생물의 다른 변이체를 예방 접종하기 위해 신속하게 조정될 수 있거나, 심지어 암 면역 치료 치료법이 될 수 있다. 또한 대규모 생산 비용 면에서 유리합니다. 그러나, mRNA는 그들의 벌거 벗은 행정을 방해하는 중요한 장애물이 있습니다: 그것의 안정성 및 무결성은 생리적인 매체에서 손상됩니다, 핵의 가득 차있는. 이러한 이유로, 이를 보호하고 mRNA를 항원 제시 세포로 벡터화하는 나노메트릭 담체의 사용은2,8이필요하다.
이러한 맥락에서, 폴리(베타 아미노에스)(pBAE)는 생체적합성 및 생분해성 폴리머의 일종으로, 양이온화9,10,11덕분에나노메트릭 입자에서 mRNA를 복합화하는 놀라운 능력을 입증하였다. 이 중합체는 생리적인 조건에서 에스테라아에 의해 그들의 분해를 쉽게 만드는 에스테르 결합으로 이루어집니다. pBAE 라이브러리 후보 중, 종말 양이온 올리고펩타이드로 기능화된 사람들은 내분비증을 통해 세포를 효율적으로 침투시키고 캡슐화된 유전자 물질을 이식하기 위해 작은 나노입자를 형성하는 더 높은 용량을 보였다. 또한, 버퍼링 용량 덕분에 내성 구획의 산성화는 내도 탈출12,13을허용한다. 즉, pBAE의 특정 종류, 그들의 백본에 소수성 모니티를 포함 (소위 C6 pBAE) 그들의 안정성을 향상 시키고 말 올리고펩티드 조합 (3-lysine로 변형 된 폴리머의 60%와 삼부스티딘을 가진 폴리머의 40%)는 비경구 투여 후 항원 제시 세포를 선택적으로 트랜스펙트 및 mRNA 코드 내포 항원 발표1 . 또한, 이러한 제형은 나노의학 제제의 주요 병목 현상 단계 중 하나를 우회할 수 있다는 것을 입증하였다: 그들의 기능을 잃지 않고 동결 건조할 수 있는 가능성, 이는 연약한 건조한 환경에서 장기적인 안정성을 가능하게한다(15).
이러한 맥락에서, 현재 프로토콜의 목적은 프로토콜의 중요한 단계에 대한 설명을 제공하고 전염병 예방 및 종양 치료 응용을 위한 효율적인 백신의 생산을 가능하게 함으로써 과학 계에 사용할 수 있는 mRNA 나노입자의 형성을 위한 절차를 만드는 것이다.
다음 프로토콜은 올리고펩티드 최종 변형 폴리(베타 아미노에스)를 합성하기 위한 완전한 운동을 설명합니다- 나노입자 합성에 더 사용될 OM-pBAE 폴리머. 프로토콜에서, 나노입자 제형도 포함되어 있다. 또한, 절차 및 대표 결과의 성공을 위한 중요한 단계는 또한 결과 제형이 양수 또는 음수 결과를 정의하는 데 필요한 품질 관리 특성화 기능을 달성할 수 있도록 제공된다. 이 프로토콜은 그림 1로요약되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

예방 접종은 현대 사회의 주요 성공 중 하나이며 질병을 통제하고 예방하는 데 필수적입니다. 전통적인 백신은 전염하는 에이전트의 전체 또는 분수로 구성되었다. 그러나 과제는 남아 있으며 새로운 백신 기술은 필수입니다. 이러한 맥락에서, 예방 접종 목적을 위한 mRNA의 사용은 SARS-CoV-2 감염을 방지하는 2개의 mRNA 백신의 신속한 승인에 의해 입증된 바와 같이 향상된 성능을 보여주었습니다. 바이러스 감염 예방에 성공 하는 것 외에도 mRNA 백신 치료 암 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
그럼에도 불구 하 고, mRNA의 불안정과 핵의 존재로 인해 신체에서 그것의 빠른 간격은 그것의 알몸 배달 불가능. 이러한 맥락에서, 나노 의약품 및 특히 중합체 나노 입자는 중요한 mRNA 전달 시스템입니다. 따라서, 본 문서의 목적은 독점적 중합체 나노입자에 기초하여 mRNA 백신 후보의 제형 및 시험을 위한 프로토콜을 기술하는 것이다. 폴리(베타 아미노에스) 폴리머의 합성 및 화학적 특성화, 나노입자를 형성하기 위한 mRNA와의 복합성, 및 이들의 구종화 방법론이 여기에서 논의될 것이다. 이는 스토리지 및 유통 비용을 줄이는 중요한 단계입니다. 마지막으로, 시험관 내 및 성숙한 모델 수지상 세포에 대한 능력을 입증하는 데 필요한 검사가 표시됩니다. 이 프로토콜은 이러한 백신이 다양한 질병을 예방하거나 치료할 수 있도록 하는 높은 다기능성 때문에 예방 접종에 종사하는 과학 계에 도움이 될 것입니다.

중합체 합성 및 특성화 OM-pBAE 합성 절차는 도 2에서주어진다. 도 2A에서 알 수 있듯이 OM-pBAE를 획득하는 첫 번째 단계는 아민(1-헥실라민 및 5-아미노-1-펜타놀, 비율 1:1)을 디아크릴레이트(1,4부티디올 디아크릴레이트)에 추가하여 C6-pBAE를 합성하는 것이다. 이 반응은 20 시간 동안 90 °C에서 수행되며 일정한 교반으로 수행됩니다. 그 후, 올?...

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Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

여기서, 폴리(베타 아미노에스) 폴리머를 기반으로 mRNA 나노입자를 제조하기 위한 간단한 프로토콜이 제시되고, 캡슐화된 mRNA를 변경하여 맞춤화되기 쉽다. 중합체, 나노입자 및 체외 필수 특성화를 합성하기 위한 워크플로우도 설명되어 있습니다. 예방 접종에 관한 개념 증명도 추가됩니다.

mRNA로 로드된 폴리(베타 아미노에스) 나노입자의 합성 및 특성화

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

이 프로토콜은 중합체 나노 입자를 제조하는 방법을 보여주기 때문에 중요하며, 하나의 간단한 단계에서 핵산을 캡슐화합니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 핵산 및 세포 유형에 적용 될 수 있기 때문에 다재 다능합니다. 입자 제제를 위한 간단한 절차의 사용, 예를 들어 위아래로 파이펫팅, 그리고 lyophilization에 의한 나노입자 및 드럼 조건의 안정성을 확장할 수 있는 가능성.절차를 시연하는 것은 로라 올모, 산호 가르시아-페르난데스, 마리아 스탬파 로페즈-핀토, 마리아 나발론 로페즈, 우리 연구소의 박사 과정 학생, 마르타 디아즈 카바예로, 우리의 실험실에 대한 포스트 문서입니다. 폴리플렉스 형성을 위해, 이전에 준비된 폴리머, C6 펩티드, 폴리 베타 아미노 에스테르 및 용액을 해동한다. 폴리머 혼합물을 위아래로 배관한 후 아세테이트 나트륨으로 12.5 밀리머 용액을 준비합니다.용액을 소용돌이쳐 10 분 동안 기다립니다. 다음으로, 밀리리터 당 0.5 밀리그램에서 mRNA를 준비하고 파이펫팅에 의해 혼합한다. 폴리머 용액을 다시 소용돌이시키고, 마이크로 원심분리기 튜브에서 일대일 비율로 폴리머 용액의 유전 물질 용액을 혼합하고 Thermoblock에서 30분 동안 25도에서 튜브를 배양한다.배양 후 물을 포함하는 마이크로 원심분리기 튜브에 샘플을 추가하여 1-2 RNase 자유수분으로 혼합물을 침전한 다음, 부형제를 포함시키고, mRNA 및 폴리 베타 아미노 에스테르의 혼합물과 동일한 부피로 20 밀리머 힙과 4% 자당 용액을 첨가하고 파이프를 혼합하여 혼합한다. 1시간 동안 폴리플렉스 용액을 영하 80도에서 동결한 후, 1차 건조를 수행한 다음, 다시 수분을 피하기 위해 즉시 폴리플렉스를 영하 20도에 보관합니다. 폴리플렉스 리서스펜션의 경우, 영하 20도의 냉동고에서 리오필화된 나노 입자를 제거하고 고체를 재분산시키기 위해 상응하는 양의 깊은 수소화수를 빠르게 첨가하여 원하는 농도를 달성하였다.파이펫은 총 재서스펜션이 용해되고 일단 용해될 때까지 부드럽게 피펫을 위아래로 피피하여 거품을 피합니다. 형광 현미경에 의한 질적 평가를 위한 24시간의 전환 후, 전감염된 헬라 세포를 함유한 96개의 웰 플레이트를 현미경에 배치하고 10배 의 목표를 사용하여 시각화를 시작합니다. 먼저 화이트 밸런스를 적용하여 소프트웨어에 대한 배경 참조를 만든 다음 분석 중에 형광 이미지로 오버레이하는 이미지를 얻습니다.현미경 모드를 반사 모드로 변경하고 필터 휠을 파란색 레이저로 이동하여 EGFP를 시각화합니다. 그런 다음 동일한 노출 시간을 사용하는 모든 조건 이나 우물에 대 한 이미지를 수집 합니다. 유동 세포측정에 의한 정량적 평가를 위해, 웰당 100마이크로리터를 사용하여 96웰 플레이트에 감염된 헬라 세포를 세척한다.PBS를 잘 당 25 마이크로리터의 트립신을 흡입한 후 5분간 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포가 분리되면 이전에 회수된 미디어를 추가하여 트립신을 비활성화한 다음, 31.25 마이크로리터를 우물당 10%의 포르말린을 추가하고 20분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 다음으로 흐름 사이토미터와 소프트웨어를 켜고 플레이트 샘플 볼륨 의 유형 및 샘플 간 흔들림 및 헹구기와 같은 기타 매개 변수를 포함하여 실험에 적합한 조건을 설정합니다.분산된 광에 대한 유동 데이터를 먼저 보고, 세포와 파편을 구별하기 위해 양형세포의 백분율을 정량화하기 위한 적절한 파라미터를 설정한다. 그런 다음 진폭과 높이를 게이트와 비교하여 개별 세포를 차별하는 다른 산란플롯을 플로팅합니다. 1일 전, 10, 000 턱스 II 세포는 하룻밤 잠복식을 위한 96웰 플레이트에서 잘 한다.다음 날 세포는 우물당 0.6 마이크로그램의 mRNA를 사용하여 37°C와 이산화탄소 5%의 건조한 공기 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 다음 날, PBS의 25 마이크로 리터와 우물에 남아있는 세포를 씻어. 트립신의 25 마이크로 리터에서 PBS를 흡입하고 세포를 분리하기 위해 섭씨 37도에서 5 분 동안 접시를 배양한 후.이전에 회수된 미디어를 특파원에게 잘 추가하여 트립신 반응을 중지하십시오. 그런 다음 플레이트를 원심분리하고, 미디어를 흡인시키고, PBS50 마이크로리터와 우물당 2.5%의 포르말린을 추가하여 세포를 고치고, 플레이트를 원심분리하는 4도에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 PBS 50 마이크로리터와 우물 당 3%BSA를 추가하고 섭씨 4도에서 30분 동안 인큐베이터를 넣습니다.배양 원심분리 후 플레이트를 다시 한 번 넣은 다음, PBS에 마우스 ovalbumin 항체 50 마이크로리터와 섭씨 4도에서 30분 동안 30분 동안 인큐베이터를 추가합니다. 원심분리 단계를 반복한 다음 PBS 의 50 마이크로리터로 세포를 씻으세요. PBS를 흡입한 후, 이차 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양한다.인큐베이션 후 원심분리 및 세척 단계를 반복하십시오. 그런 다음 혈류 세포 분석용 세포 및 100마이크로리터와 2.5%의 포식틴을 다시 중단한다. 나노 입자를 캡슐화 하는 신선 하 고 lyophilized GFP mRNA 캡슐화의 생리학적 특성 크기 및 poly 분산 지수에 유의 한 차이 표시.폴리플렉스의 투과 전자 현미경 검사는 직경 약 50 나노미터의 구형 및 모노 분산 나노 입자의 형성을 확인합니다. 레고 펩티드 및 수정된 폴리 베타 아미노 에스테르 폴리플렉스의 캡슐화 효율 데이터는 GFP또는 ovalbumininmRNA의 종류에 따라 유의한 차이를 나타내지 않습니다. EGFP 발현의 질적 분석, 턱II 세포주에서 24시간 후 거래가 여기에 도시된다.양적으로 부정적인 제어에 비해. 백분율 GFP 양성 세포는 고전적인 형질 시약으로 수행 된 긍정적 인 제어에 상당히 높고 비교됩니다. 상기 ovalbumin mRNA는 올리고펩티드 및 변형된 폴리 베타 아미노 에스테르 나노입자가 비감염된 세포에 비해 감염된 세포에서 CD11b 및 CD86 멤브레인 마커의 현저히 높은 발현에 의해 보인 바와 같이 수지상 세포를 활성화할 수 있다.활성 원리로 mRNA의 사용에 기초한 우리의 예방 접종 플랫폼은, 우리의 독점적인 폴리머는 암 치료뿐만 아니라 예방에 사용될 수 있습니다. 우리는 우리의 기술을 사용하여 암 면역 요법에 그 기여를 강조 할 수 있습니다. 우리는 우리의 나노 입자에 종양 관련 항원을 캡슐화하고 암 처리에 있는 변화를 만들 수 있기 때문에.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanoprecipitation 기법을 통해 디블록 고분자 Nanoparticles의 제형

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

연구

생체공학

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

화학 합성 및 시간 - 해결 기계론의 연구 Millifluidics

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

재생 연구를위한 고조파 나노 입자

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

고체 지질 나노 입자 (SLNs) 세포 내 타겟팅을위한 응용 프로그램

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

동맥 경화의 빠른 검색을위한 산화철 나노 입자의 전자 레인지 중심의 합성

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...