Name: synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Økonomisk støtte fra MINECO/FEDER (tilskudd SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 og COV20/01100) er anerkjent. CGF anerkjente hennes IQS PhD Fellowship.

1. Syntese av pBAE polymer med ende oligopeptider (OM-pBAE)
<ol><li>Polymerisering av C6-pBAE<ol>
<li>Tilsett 5-amino-1-pentanol (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-heksylamin (38 mmol; MW = 101,19 Da) i en rundbunnsglassflaske (100 ml). Tilsett deretter 1,4-butandiol diakrylat (82 mmol; MW = 198,22 Da).</li>
		<li>Forvarm silikonoljebadet ved 90 °C, legg den runde bunnen av kolben inn i oljebadet og rør blandingen ved hjelp av en magnetisk rørestang over natten (~ 18 timer). Ta deretter produktet fra rundbunnsflasken og le...

<ol>
	<li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19.">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li><li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases.">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li><li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year.">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li><li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2:+a+preliminary+report+of+a+phase+1/2,+single-blind,+randomised+controlled+trial.">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li><li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA:+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines.">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li><li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+mRNA+vaccines.">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li><li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy.">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li><li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines:+impact+on+translational+nanomedicine.">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3 (2020).</li><li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery.">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li><li>Guerrero-C&#225;zares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo.">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li><li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells.">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li><li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligopeptide-terminated+poly(&#946;-amino+ester)s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization.">Oligopeptide-terminated poly(&#946;-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li><li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing,+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+(beta-amino+ester)s+(PBAEs).">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li><li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo.">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033 (2018).</li><li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., L&#225;zaro, M. &. #. 1. 9. 3. ;., Cascante, A., Borr&#243;s, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes.">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles.">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li><li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications:+size,+surface+charge+and+stability.">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li><li>Sahin, U., Karik&#243;, K., T&#252;reci, &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs.">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li><li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine.">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li><li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells.">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li><li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions:+Current+evidence+and+approach.">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li><li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics:+from+concept+to+clinical+reality.">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li><li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly(&#946;-amino+ester)+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide.">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(&#946;-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li><li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer.">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li></ol>

Etter utbruddet av Covid-19-pandemien i fjor, har betydningen av vaksiner når det gjelder smittsom sykdomskontroll manifestert seg som en kritisk komponent8. Innsats fra forskere over hele verden har gjort det mulig å frigjøre til markedet for mange vaksiner. For første gang i historien har mRNA-vaksiner vist sin tidligere hypoteiserte suksess, takket være deres raske design på grunn av deres evne til å tilpasse seg ethvert nytt antigen innen noen måneder5,</su...

Smittsomme sykdommer har representert en alvorlig trussel mot millioner av mennesker over hele verden og er fortsatt en av de ledende dødsårsakene i noen utviklingsland. Profylaktisk vaksinasjon har vært en av de mest effektive intervensjonene i det moderne samfunnet for å forebygge og kontrollere smittsomme sykdommer1,2. Disse kritiske milepælene i vitenskapen i1900-talletsrelevans har blitt bemerket av den nylige verdensomspennende Covid-19-pandemien forårsaket av SARS-CoV-2-viruset3. Ved å erkjenne viktigheten av å ha effektive vaksiner for å begrense spredningen av sykdommen, har samarbeidsinnsats fra alle biomedisinske samfunn med hell resultert i mange profylaktiske vaksiner i markedet på mindre enn et år4.
Tradisjonelt var vaksiner sammensatt av svekkede (levende, redusert virulens) eller inaktiverte (dødspartikler) virus. Men for noen sykdommer uten margin for sikkerhetsfeil er virale partikler ikke mulig, og proteinunderenheter brukes i stedet. Likevel aktiverer underenheter vanligvis ikke kombinasjonen av mer enn en epitop / antigen, og adjuvanser er pålagt å forbedre vaksinasjonsstyrken5,6. Derfor står behovet for nye vaksinetyper klart.
Som demonstrert under den nåværende pandemien, kan nye vaksinekandidater basert på nukleinsyrer være fordelaktige når det gjelder å unngå lange utviklingsprosesser og gi høy allsidighet samtidig som de produserer en viktig pasientimmunisering. Dette er tilfelle av mRNA-vaksiner, som opprinnelig ble designet som eksperimentelle kreftvaksiner. Takket være deres naturlige kapasitet til å produsere antigenspesifikke T-celleresponser3,5,6,7. Å være mRNA molekylet som koder det antigene proteinet, bare endre det samme, vaksinen kan raskt skreddersys for å immunisere andre varianter av samme mikroorganisme, forskjellige stammer, andre smittsomme mikroorganismer, eller til og med bli en kreftimmunoterapeutisk behandling. I tillegg er de fordelaktige når det gjelder store produksjonskostnader. Imidlertid har mRNA et betydelig hinder som hemmer deres nakne administrasjon: stabiliteten og integriteten er kompromittert i fysiologiske medier, fulle av nukleaser. Av denne grunn er bruk av en nanometrisk bærer som beskytter den og vektoriserer mRNA til de antigen-presenterende cellene nødvendig2,8.
I denne sammenhengen er poly (beta aminoestere) (pBAE) en klasse biokompatible og biologisk nedbrytbare polymerer som viste en bemerkelsesverdig evne til å komplekse mRNA i nanometriske partikler, takket være deres kationiske ladninger9,10,11. Disse polymerene består av esterbindinger, noe som gjør deres nedbrytning lett av esteraser i fysiologiske forhold. Blant pBAE-bibliotekkandidatene viste de som var funksjonalisert med end kationiske oligopeptider en høyere kapasitet til å danne små nanopartikler for effektivt å trenge inn i celler gjennom endokytose og transfektere det innkapslede genmaterialet. Videre, takket være deres bufferkapasitet, tillater forsuring av endosome rommet endosomal flukt12,13. Nemlig en bestemt type pBAE, inkludert hydrofobe moieties på ryggraden (den såkalte C6 pBAE) for å forbedre deres stabilitet og end-oligopeptid kombinasjon (60% av polymer modifisert med en tri-lysin og 40% av polymeren med en tri-histidin) som selektivt transfekter antigen-presenting celler etter parenteral administrasjon og produsere mRNA kodet antigen presentasjon etterfulgt av mus immunisering har nylig blitt publisert14 . I tillegg har det også blitt demonstrert at disse formuleringene kan omgå et av de viktigste flaskehalstrinnene i nanomedisinske formuleringer: muligheten til å fryse tørk dem uten å miste funksjonaliteten, noe som muliggjør langsiktig stabilitet i myke tørre miljøer15.
I denne sammenhengen er målet med den nåværende protokollen å gjøre prosedyren for dannelsen av mRNA nanopartikler tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet ved å gi en beskrivelse av de kritiske trinnene i protokollen og muliggjøre produksjon av effektive vaksiner for smittsomme sykdommer forebygging og tumorbehandlingsapplikasjoner.
Følgende protokoll beskriver den komplette treningsøkten for å syntetisere oligopeptid endmodifisert poly (beta aminoesters) - OM-pBAE polymerer som vil bli ytterligere brukt til nanopartikkelsyntese. I protokollen er nanopartikler formulering også inkludert. I tillegg er det også gitt kritiske trinn for å lykkes med prosedyren og representative resultater for å sikre at de resulterende formuleringene oppnår de nødvendige karakteriseringsfunksjonene for kvalitetskontroll for å definere et positivt eller negativt resultat. Denne protokollen er oppsummert i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-butanediol diacrylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>123048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-hexylamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>219703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-amino-1-pentanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>411744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>141007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>550993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86 antibody</td>
			<td>Bioligend</td>
			<td>105007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlor hydroxhyde</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>181023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform-d</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-His-His-His peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cys-Lys-Lys-Lys peptide</td>
			<td>Ontores</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC reagent for Rnase free water</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5758</td>
			<td>This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl eter</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>212770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA EGFP</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mRNA OVA</td>
			<td>TriLink Technologies</td>
			<td>L-7610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboGreen kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11570626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-mouse AlexaFluor488 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab450105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>400 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>Nano ZS</td>
			<td>For zeta potential and hydrodynamic size determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight NTA software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>MAN0515-02-EN-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovoExpress Software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Not specified</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer software</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>DTS Application</td>
			<td>To analyze surface charge and hydrodynamic sizes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and characterization of mrna-loaded poly(beta aminoesters) nanoparticles for vaccination purposes

Vaksinasjon har vært en av de største suksessene i det moderne samfunnet og er uunnværlig for å kontrollere og forebygge sykdom. Tradisjonelle vaksiner var sammensatt av hele eller brøkdeler av det smittsomme middelet. Utfordringene gjenstår imidlertid, og nye vaksineteknologier er obligatoriske. I denne sammenhengen har bruk av mRNA til immuniseringsformål vist en forbedret ytelse, som vist ved rask godkjenning av to mRNA-vaksiner som forhindrer SARS-CoV-2-infeksjon. Utover suksess med å forebygge virusinfeksjoner, kan mRNA-vaksiner også brukes til terapeutiske kreftapplikasjoner.
Likevel gjør ustabiliteten til mRNA og dens raske klaring fra kroppen på grunn av tilstedeværelsen av nukleaser sin nakne levering ikke mulig. I denne sammenhengen er nanomedisiner, og spesielt polymere nanopartikler, kritiske mRNA-leveringssystemer. Dermed er målet med denne artikkelen å beskrive protokollen for formulering og test av en mRNA-vaksinekandidat basert på de proprietære polymere nanopartiklene. Syntesen og kjemisk karakterisering av poly(beta aminoesters) polymerer som brukes, deres hudfarge med mRNA for å danne nanopartikler, og deres lyofiliseringsmetodikk vil bli diskutert her. Dette er et avgjørende skritt for å redusere lagrings- og distribusjonskostnader. Til slutt vil de nødvendige testene for å demonstrere deres evne til in vitro transfekt og modne modell dendrittiske celler bli indikert. Denne protokollen vil være til nytte for det vitenskapelige samfunnet som jobber med vaksinasjon på grunn av sin høye allsidighet som gjør det mulig for disse vaksinene å forebygge eller kurere et bredt spekter av sykdommer.

Polymersyntese og karakterisering OM-pBAE-synteseprosedyren er angitt i figur 2. Som figur 2A viser, er det første trinnet for å oppnå OM-pBAE å syntetisere C6-pBAE ved å legge til aminer (1-heksylamin og 5-amino-1-pentanol, forholdet 1:1) til diakrylat (1,4-butanediol diacrylat). Denne reaksjonen utføres ved 90 °C i 20 timer og med konstant omrøring. Etterpå tilsettes en løsning av oligopeptider til en løsning av C6-polymer oppnå...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes at JoVE.com

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded PolyBeta Aminoesters Nanoparticles for Vaccination Purposes

Her presenteres en enkel protokoll for å produsere mRNA nanopartikler basert på poly (beta aminoester) polymerer, lett å bli skreddersydd ved å endre den innkapslede mRNA. Arbeidsflyten for å syntetisere polymerene, nanopartiklene og deres in vitro essensielle karakterisering er også beskrevet. Det legges også til et konseptbevis om immunisering.

Syntese og karakterisering av mRNA-lastet poly (Beta Aminoesters) Nanopartikler for vaksinasjonsformål

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Denne protokollen er betydelig fordi den demonstrerer, hvordan å forberede polymere nanopartikler, innkapslede nukleinsyrer i ett enkelt trinn. De viktigste fordelene ved denne teknikken er allsidighet, da den kan brukes på forskjellige nukleinsyrer og celletyper. Bruk av enkle prosedyrer for partikkelforberedelse, for eksempel pipettering opp og ned, og muligheten til å utvide stabiliteten til nanopartiklene og trommelforholdene ved lyofilisering.Demonstrere prosedyren vil være Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto og Maria Navalon-Lopez, phd student av vårt laboratorium og Marta Diaz-Caballero, en post doc for vårt laboratorium. For polyplexerdannelse, tine de tidligere tilberedte polymerene, C6 peptid, poly beta amino estere og virvel løsningen. Etter pipettering polymerblandingen opp og ned, lag en 12,5 millimolaroppløsning i natriumacetat.Virvel løsningen og vent i 10 minutter. Deretter forbereder du mRNA på 0,5 milligram per milliliter og blandes ved pipettering. Virvel polymerløsningen igjen, bland deretter den genetiske materialløsningen i polymerløsningen i et en-til-en-forhold i et mikro sentrifugerør og inkuber røret ved 25 grader Celsius i 30 minutter i en Thermoblock.Etter inkubasjon utfelling utfeller blandingen med en til to RNase fritt vann ved å legge prøven til et mikro sentrifugerør som inneholder vannet, deretter å inkludere hjelpestoffene, tilsett en 20 millimolar hauger og 4% sukrose løsning i samme volum som blandingen av mRNA og poly beta amino estere, og blandet av pipettering. For Lyofilisering etter frysing av polyplexoppløsningen ved minus 80 grader Celsius i en time, utfør primærtørkingen, og lagre deretter polypleksene umiddelbart ved minus 20 grader Celsius for å unngå rehydrering. For polypleks resuspension, fjern de lyofiliserte nanopartiklene fra minus 20 grader Celsius fryser og legg raskt til den tilsvarende mengden dypt hydrogenert vann for å spre det faste og oppnådde ønsket konsentrasjon.Pipette forsiktig til total resuspension og når den er oppløst, pipette opp og ned kraftig unngå bobler. Etter 24 timer med transfeksjon for kvalitativ vurdering ved fluorescensmikroskopi, plasser 96 brønnplaten som inneholder de transfekterte Hela-cellene på mikroskopet og begynn å visualisere ved hjelp av 10 ganger målet. Først bruker du en hvitbalanse for å lage en bakgrunnsreferanse for programvaren, og deretter skaffer du et bilde for å legge det over med fluorescensbildet under analysen.Endre mikroskopmodus til refleksjonsmodus og flytt filterhjulet til den blå laseren for å visualisere EGFP. Hent deretter bilder for alle forholdene eller brønnene som bruker samme eksponeringstid. For kvantitativ vurdering ved strømningscytometri, vask Hela-cellene transfektert i en 96 brønnplate ved hjelp av 100 mikroliter PBS per brønn.Etter å ha aspirert PBS ved 25 mikroliter trypsin per brønn og inkuber ved 37 grader Celsius i fem minutter. Når cellene er løsnet, legg til det tidligere gjenopprettede mediet for å inaktivere trypsin, og fest deretter cellene ved å legge til 31,25 mikroliter 10% formalin per brønn og inkubere i 20 minutter. Slå deretter på strømningscytometeret og programvaren, og sett deretter opp de riktige forholdene for eksperimentet, inkludert typen plateprøvevolum og andre parametere som risting og skylling mellom prøver.Definer de aktuelle parameterne for å kvantifisere prosentandelen av positivt transfekterte celler ved først å vise strømningsdataene fremover spredt lys kontra sidespredningslys for å skille cellene fra ruskene. Og deretter plotte en annen scatterplot, sammenligne amplitude versus høyde til gate og diskriminere individuelle celler. En dag før transfeksjon, plate 10,000 JAWS II celler per brønn i en 96 brønnplate for overnatting inkubasjon.Neste dag transfekter cellene med 0,6 mikrogram mRNA per brønn og inkuberer platen i 24 timer i en tørrluftinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Neste dag vasker du cellene som er igjen i brønnen med 25 mikroliter PBS. Etter å ha aspirert PBS ved 25 mikroliter trypsin og inkuber platen i fem minutter ved 37 grader Celsius for å løsne cellene.Stopp trypsinreaksjonen ved å legge til de tidligere gjenopprettede mediene på korrespondentbrønnen. Deretter sentrifugerer platen, aspirerer mediet og fikser cellene ved å legge til 50 mikroliter PBS og 2,5% formalin per brønn etterfulgt av inkubering av platen ved fire grader Celsius i 20 minutter, sentrifuger platen. Tilsett deretter 50 mikroliter PBS og 3% BSA per brønn og inkubator i 30 minutter ved fire grader Celsius.Etter inkubasjon sentrifuger platen igjen, legg deretter til 50 mikroliter av musen ovalbumin antistoff i PBS og 3% BSA og inkubator i 30 minutter ved fire grader Celsius. Gjenta sentrifugeringstrinnet, og vask deretter cellene med 50 mikroliter PBS. Etter å ha aspirert PBS, legg til sekundære antistoffer og inkuber i en time ved fire grader Celsius.Etter inkubasjon gjentar du sentrifugerings- og vasketrinnene. Deretter resuspend cellene og 100 mikroliter av PBS og 2,5% formalin for strømning cytometri analyse. Fysiokjemisk karakterisering av fersk og lyofilisert GFP mRNA innkapsling nanopartikler viser ingen signifikante forskjeller i størrelse og poly dispergeringsindeks.Transmisjonselektronmikroskopi av polyplexene bekrefter dannelsen av sfæriske og monodispererte nanopartikler på ca. 50 nanometer i diameter. Innkapslingseffektivitetsdata for et Lego peptid og modifisert poly beta amino ester polyplexer som innkapsler GFP, eller ovalbumin viser ingen signifikante forskjeller avhengig av typen mRNA. En kvalitativ analyse av EGFP-uttrykk, 24 timer etter transaksjonen i JAWS II-cellelinjen, vises her.Kvantitativt sammenlignet med den negative kontrollen. Prosenten GFP positive celler er betydelig høyere og sammenlignbar med en positiv kontroll utført med en klassisk transfeksjon reagens. Den ovalbumin mRNA lastet oligopeptid og modifisert poly beta amino ester nanopartikler kan aktivere dendrittiske celler sett av det betydelig høyere uttrykket av CD11b og CD86 membranmarkører i transfekterte celler sammenlignet med ikke-transfekterte celler.Vår vaksinasjonsplattform basert på bruk av mRNA som aktivt prinsipp, samt våre proprietære polymerer kan tilpasses for bruk i profylakse så vel som for kreftterapeutikk. Vi kan bruke teknologien vår til å fremheve dette bidraget innen kreftimmunoteutikk. siden vi kan innkapsle tumorrelaterte antigener i nanopartiklene våre og gjøre et skifte i kreftbehandlinger.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

High-throughput syntese av karbohydrater og funksjonalisering av Polyanhydride Nanopartikler

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Millifluidics for kjemisk syntese og Time-løst mekanistiske studier

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Harmonic Nanopartikler for regenerativ Forskning

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cell Merking og målretting med superparamagnetiske Iron Oxide Nanopartikler

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanopartikler (SLNs) for Intracellulær målretting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

Mikrobølgeovn-drevet Syntese av Iron Oxide Nanopartikler for Fast Påvisning av åreforkalkning

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

Produksjon av metall nanopartikler ved pulserende laserablation i væsker: Et verktøy for å studere de antibakterielle egenskapene til nanopartikler

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...