Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af den selvstyrende provins Trento gennem kernefinansiering af Ecogenomics-gruppen fondazione E. Mach.

1. Reagenser og medieforberedelse
<ol><li>Klargør 70% ethanolopløsning: Tilsæt 737 mL 95% teknisk ethanol til 263 mL destilleret vand. Bland grundigt. BEMÆRK: Tilbered 70% ethanolopløsning på en ikke-steril arbejdsbænk. FORSIGTIG: Ethanol er meget brandfarlig og kan forårsage alvorlig irritation af øjnene. Holdes væk fra flammer og varmekilder. I tilfælde af kontakt med øjnene skylles med rigeligt vand.</li>
	<li>Forbered 5% blegemiddelopløsning: Tilsæt 5 mL husholdningsblegemiddel (indeholdende ~ 3...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

Sterilisering af frø er det grundlæggende skridt for funktionelle undersøgelser i Arabidopsis. Selv om det ofte udføres til mange forskellige formål, begrænsede undersøgelser af high-throughput frø overflade sterilisering i Arabidopsis er tilgængelige.
Hidtil er en af de metoder med den højeste gennemløb ved hjælp af klor gas genereret ved at blande blegemiddel med koncentreret HCl. Selv om denne metode kræver begrænset hands-on tid, det bruger en gas meget giftig for mennesker<s...

Arabidopsis er en diploid planteart, der tilhører Brassicaceae familien. Dens relativt korte livscyklus (to måneder pr. generation under lange vækstbetingelser), lille plantestørrelse og selvbestøvning med produktion af hundredvis af frø pr. plante har gjort det til den første grundlæggende plantemodelart1,2. Derudover var genomet fuldt sekventeret3,omfattende omvendt genetik værktøjer (mættet T-DNA, transposon, og kemisk mutagenized populationer) er tilgængelige4,5,6, og effektiv Agrobacterium-medierettransformation er veletableret til at opnå tilstrækkelige transgene linjer til yderligere downstream arbejde7 . Således er der i løbet af de sidste to årtier opnået store fremskridt ved hjælp af Arabidopsis som en modelart til at dissekere forskellige aspekter af plantebiologi på molekylært niveau, herunder naturlig, genetisk og fænotypisk variation8,9.
For funktionelt at karakterisere gener af interesse i Arabidopsis er frøoverfladesterilisering for at eliminere svampe- og bakterieforurenende stoffer det forudsætningstrin for mange downstream-protokoller, der kræver axeniske kulturer. Genetisk transformation for overekspression10, knock-down (RNA-I11)eller knock-out (genomredigering12,13) af genfunktion, subcellulær lokalisering14, promotor aktivitet15,16, protein-protein17 og protein-DNA interaktion18, for kun at nævne de mest almindelige anvendelser, alle nødvendiggør et frø overflade sterilisering trin. På trods af sin relative enkelhed spiller frøoverfladesterilisering således en grundlæggende rolle i mange funktionelle analyser.
Hidtil er to hovedkategorier af frøoverfladesteriliseringsmetoder blevet udviklet baseret på enten gas- eller væskefasesterilisering19. Mens gennemløbet af gasfase frø overflade sterilisering er medium til høj, ved hjælp af den farlige reagens klor gas som en overflade sterilisering agent har hindret sin brede anvendelse. Metoder baseret på væskefase sterilisering, tværtimod, stole på mildere kemikalier som ethanol og blegemiddel løsninger til overflade sterilisering, og de er mere udbredt på trods af at de har en i sagens natur lavere gennemløb end klor fumigation. Generelt er to forskellige metoder, der anvender flydende reagenser, almindeligt anvendt. En stort set anvendt metode er baseret på vask med ethanol og blegemiddel i forskellige koncentrationer i forskelligetidsperioder 20,21. En anden metode er baseret på anvendelsen af blegemiddel kun21,22. Begge metoder anvendes hovedsageligt til mindre frøoverfladesterilisering. Men i mange eksperimenter er det nødvendigt at screene mange Arabidopsis transgene linjer afledt af en transformation15,23 eller skærm parallelt mange transgene linjer genereret fra forskellige transformationer24,25. Så vidt vi ved, er der ikke offentliggjort nogen væskebaseret metode til sterilisering af frøoverflader med høj gennemløb, hvilket, om end lidt anerkendt, udgør en vigtig flaskehals for funktionelle genomiske tilgange. Derfor er udvikling af sikre, robuste og high-throughput metoder til frø overflade sterilisering et nødvendigt og kritisk skridt i retning af succesen af den funktionelle karakterisering af mange gener på én gang.
Til dette formål præsenteres en forbedret metode til overfladesterilisering af Arabidopsis frø i den nuværende undersøgelse. Denne metode er sikker, billig, meget robust og høj-throughput, så håndtering 96 uafhængige linjer inden for en time fra begyndelsen af frø overflade sterilisering indtil slutningen af frø såning i Petri retter. Den viste metode bygger på bredt tilgængelige, grundlæggende laboratorieinstrumentering som en vakuumpumpe, forbrugsglas og plastvarer. Denne forbedrede metode giver det videnskabelige samfund en sikker, enkel og overkommelig tilgang til at strømline frø overflade sterilisering med en gennemløb tilstrækkelig til moderne funktionelle genomforskning tilgange i Arabidopsis og andre ikke-model plantearter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis er langt den plantemodelart, der anvendes mest til funktionelle undersøgelser. Overfladen sterilisering af Arabidopsis frø er et grundlæggende skridt, der kræves i denne retning. Således er det altafgørende at etablere high-throughput Arabidopsis frø overflade sterilisering metoder til at håndtere snesevis til hundredvis af prøver (f.eks transgene linjer, økotyper, eller mutanter) på én gang. En frø overflade sterilisering metode baseret på effektiv eliminering af væske i rør med en hjemmelavet sugeanordning konstrueret af en fælles vakuumpumpe præsenteres i denne undersøgelse. Ved dramatisk at reducere arbejdskrævende hands-on tid med denne metode håndtering flere hundrede prøver på en dag er muligt med lidt indsats. Serietidskurser viste yderligere en meget fleksibel tids interval af overfladesterilisering ved at opretholde høje spiringshastigheder. Denne metode kunne let tilpasses til overfladesterilisering af andre slags små frø med simpel tilpasning af sugeenheden i henhold til frøstørrelsen og den ønskede hastighed for at eliminere væsken.

For at vurdere den tid, der kræves til hele frøsteriliseringsproceduren, blev tidsforskellene for væskehåndtering 96 prøver i den nuværende protokol beregnet og sammenlignet med traditionelle pipetteringsmetoder. Resultatet angiver, at den nuværende protokol sparer tid, hvilket reducerer den flydende håndteringstid til en fjerdedel af den med de traditionelle protokoller (tabel 1). Tabellen fremhæver endvidere, at den flydende fjernelsestid i den nuværende protokol sparer mere tid end de tradit...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

En højgennemsigtsprotokol til overfladesterilisering af Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) frø leveres, hvilket optimerer væskehåndteringstrinnene med en simpel sugeenhed konstrueret med en vakuumpumpe. Hundredvis af frøprøver kan overfladesteriliseres på en dag.

Høj-gennemløb, robust og meget tidsfleksibel metode til overfladesterilisering af Arabidopsis Frø

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Denne protokol forbedrer frø overflade sterilisering, et grundlæggende skridt i funktionel genomforskning af modelarten Arabidopsisthaliana. De vigtigste fordele ved denne teknik er lethed og høj gennemløb, så behandlingen af hundredvis af prøver om dagen. Med nogle enkle ændringer kan denne metode anvendes på mange andre model- og ikke-modelplantearter.For førstegangsbrugere skal du være opmærksom på mediets temperatur og centrifugeringshastigheden, da de begge er afgørende for frøoverlevelsen. Til at begynde med forberede 70% ethanol ved at tilføje 95% teknisk ethanol til destilleret vand og blande grundigt. Derefter forberede 5% blegemiddel opløsning ved at tilføje fem milliliter af husholdnings blegemiddel til 95 milliliter sterilt destilleret vand.Tilsæt derefter et par dråber ikkeionisk vaskemiddel til blegemiddelopløsningen og bland grundigt. Derefter forberede halv styrke Murashige og Skoog medium ved at tilføje 2,2 gram MS medium pulver, herunder vitaminer og 10 gram saccharose i 800 milliliter destilleret vand. Juster pH af mediet til 5,7 ved hjælp af en molar kaliumhydroxid, og bring derefter volumen op til en liter ved hjælp af destilleret vand.Aliquot 500 milliliter af mediet i en en-liters flaske, og tilsæt fire gram agar for at forberede et solidt medium. Efter autoklavering, lad mediet til at køle ned til 50 til 53 grader Celsius i et vandbad. Hæld det derefter i Petri retter under laminar flow hætte.For at forberede selektiv medium, tilsæt kanamycin til mediet, og hæld det i Petri retter som påvist tidligere. For at sætte aspiratoren op skal vakuumpumpeindtaget tilsluttes den ene ende af et polyethylenrør af en passende størrelse. Tilslut derefter den anden ende af røret til udløbet af dekanteringsflaskens tovejslåg.Pak slangens knudepunkt tæt sammen med en tætningsfilm for at sikre lufttæt forbindelse. Tilslut derefter et andet polyethylenrør til skruehættens indløb på dekanteringsflasken. Tilslut derefter den anden side af røret til udløbet af en akvarieventil udstyret med et tyndt polyethylenrør.Om nødvendigt skal du pakke krydset med tætningsfilmen for at eliminere luftlækage. Efter mærkning to partier af 48 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør med progressive tal, tilføje 100 til 200 Arabidopsis frø til hver af de 96 sterile mikrocentrifuge rør, omkring en til to millimeter over bunden af den koniske ende af røret. Dernæst ved hjælp af en 10-milliliter steril serologisk pipette, tilsæt omkring en milliliter 70% ethanol i hvert rør, og luk forsigtigt lågene.Ryst rørene med en svingfrekvens på otte hertz i tre minutter i en shaker. Fjern derefter adapterne fra shakeren og overfør dem i kurven på en mikrocentrifuge på bænken til at dreje frøene ned ved hjælp af pulsfunktionen. Efter overførsel af rørene til et rack skal du åbne alle rør under laminar flowhætten.Rør ikke ved den del af lågene, der passer ind i rørene, for at undgå forurening. Derefter, under laminar flow hætte, passer en steril 200-mikroliter gul spids på akvariet ventilindtag af den hjemmelavede aspirator, og tænde pumpen. Indsæt spidsen lige over frøenes niveau for at undgå at røre frøene, når du suger væsken.Dernæst ved hjælp af en 10-milliliter steril serologisk pipette, aliquot en milliliter af 5% blegemiddelopløsning i hvert rør. Luk lågene, før du placerer rørene tilbage i shakeradapterne, og ryst derefter rørene som tidligere demonstreret. Efter spinning ned frøene ved hjælp af pulsfunktionen af en benchtop centrifuge, passer en ny steril 200-mikroliter gul spids på akvarieventilen, og tænd pumpen.Indsæt spidsen over frøenes niveau for at undgå at røre frøene, når blegemiddelopløsningen suges. Dernæst ved hjælp af en 10-milliliter steril serologisk pipette, aliquot en milliliter steriliseret vand i hvert rør. Efter montering af en ny steril 200-mikroliter gul spids på akvarieventilen skal du tænde pumpen.Indsæt spidsen lige over frøenes niveau for at undgå at røre frøene, når du suger vandet. Endelig aliquot 500 mikroliter af steriliseret vand i hvert rør, og lukke alle låg i laminar flow hætte. Frøene er nu klar til at blive sået.Hvis det er nødvendigt, skal du holde rørene ved stuetemperatur i op til et par timer eller ved fire grader Celsius natten over. Ved hjælp af en en milliliter pipette overføres frøene med 300 til 400 mikroliter sterilt vand til en petriskål. Efter overførsel af 10 rør, hæld 1,5 til to milliliter smeltet halv styrke Murashige og Skoog medium uden antibiotika i hver plade.Hvirvl hurtigt pladen for at fordele frøene, og tape pladerne på modsatte sider. Pak pladerne ind i plast eller aluminiumsfolie, og læg dem i køleskab i tre dage i mørke for at opnå ensartet spiring. Spiringsanalyser udført på dag to, tre, fire og syv indikerede ingen signifikante forskelle mellem 10 til 40 minutters steriliseringstid med 70% ethanol.Men da steriliseringstiden oversteg 40 minutter, faldt spiringsraterne. Tilsvarende faldt antallet af grønne cotyledon emergence også. Baseret på undersøgelsen blev tre minutter for 70% ethanol og tre minutter for 5% blegemiddel valgt som den mindste tid til at sterilisere frøene.For at vise, at de frø, der oprindeligt blev brugt, var forurenet med mikroorganismer, blev ikke-sterile frø sået direkte på pladerne. Sammenlignet med sterile frø viste ikke-sterile frø et svampeudseende efter to dage, som spredte sig over pladerne efter en syv-dages spiring. En krydskontaminering assay udført ved hjælp af en enkelt steril pipette tip til at behandle forskellige frø prøver viste, at ingen grønne cotyledons blev observeret i Columbia-0 genotype frø sået i plader med kanamycin.Parallelt, i Columbia-0 frø sået i plader uden kanamycin, alle cotyledons syntes grøn efter spiring. Disse resultater indikerer ingen overførsel af forurening mellem prøverne på trods af at der anvendes en enkelt pipettespids til at fjerne den sterile opløsning. Denne procedure er grundlaget for mange andre funktionelle genomforskningsmetoder som genoverekspression, genomredigering, subcellulær lokalisering, promotoraktivitet og proteinprotein- og protein-DNA-interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: En metode til Voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønds plader for High-Throughput genotypebestemmes

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering af membranproteiner Brug af Lipidic Bicelle Metode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En High-throughput Metode til måling af glomerulær filtrationshastighed i bevidst Mus

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og hurtig Isolering af Debuterende embryoner fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Stærkt Effektiv Ligering af Small RNA-molekyler til microRNA kvantificering af High-gennemløb sekventering

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Inddrivelse af voksne zebrafisk Hearts for high-throughput applikationer

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...