Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
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Cette recherche a été financée par la province autonome de Trente grâce au financement de base du groupe Ecogenomics de la Fondazione E. Mach.

1. Réactifs et préparation des milieux
<ol><li>Préparer une solution d’éthanol à 70 % : Ajouter 737 mL d’éthanol technique à 95 % à 263 mL d’eau distillée. Mélanger. REMARQUE: Préparer une solution d’éthanol à 70% sur un banc de travail non stérile. ATTENTION : L’éthanol est très inflammable et peut causer une irritation grave des yeux. Tenir à l’écart des flammes et des sources de chaleur. En cas de contact avec les yeux, rincer abondamment à l’eau.</li>
	<li>Préparer une soluti...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

La stérilisation des graines est l’étape fondamentale des études fonctionnelles chez Arabidopsis. Bien qu’elle soit fréquemment réalisée à de nombreuses fins différentes, des études limitées sur la stérilisation de surface des semences à haut débit chez Arabidopsis sont disponibles.
Jusqu’à présent, l’une des méthodes avec le débit le plus élevé consiste à utiliser du chlore gazeux généré par le mélange d’eau de Javel avec du HCl concentré. Bien que cette mé...

Arabidopsis est une espèce de plante diploïde appartenant à la famille des Brassicaceae. Son cycle de vie relativement court (deux mois par génération dans des conditions de croissance de longue durée), sa petite taille de plante et son autopollinisation avec la production de centaines de graines par plante en ont fait la première espèce modèle végétale fondamentale1,2. De plus, son génome a été entièrement séquencé3,de vastes outils de génétique inverse (ADN-T saturé, transposon et populations chimiquement mutagénisées) sont disponibles4,5,6, et une transformation efficace médiée par Agrobacteriumest bien établie pour obtenir suffisamment de lignées transgéniques pour d’autres travaux en aval7 . Ainsi, au cours des deux dernières décennies, de grands progrès ont été réalisés en utilisant Arabidopsis comme espèce modèle pour disséquer divers aspects de la biologie végétale au niveau moléculaire, y compris la variation naturelle, génétique et phénotypique8,9.
Pour caractériser fonctionnellement les gènes d’intérêt pour Arabidopsis, la stérilisation de la surface des graines pour éliminer les contaminants fongiques et bactériens est l’étape préalable à de nombreux protocoles en aval nécessitant des cultures axeniques. La transformation génétique pour la surexpression10,le knock-down (ARN-I11)ou le knock-out (édition du génome12,13)de la fonction génique, la localisation subcellulaire14,l’activité promotrice15,16,l’interaction protéine-protéine17 et l’interaction protéine-ADN18,pour ne citer que les applications les plus courantes, nécessitent toutes une étape de stérilisation à la surface de la graine. Ainsi, malgré sa relative simplicité, la stérilisation de surface des semences joue un rôle fondamental dans de nombreuses analyses fonctionnelles.
Jusqu’à présent, deux grandes catégories de méthodes de stérilisation de surface des semences ont été développées sur la base de la stérilisation en phase gazeuse ou liquide19. Bien que le débit de stérilisation de surface des semences en phase gazeuse soit moyen à élevé, l’utilisation du réactif dangereux chlore gazeux comme agent de stérilisation de surface a entravé son application à grande échelle. Les méthodes basées sur la stérilisation en phase liquide, au contraire, reposent sur des produits chimiques plus doux comme l’éthanol et les solutions d’eau de Javel pour la stérilisation de surface, et elles sont plus largement utilisées malgré leur débit intrinsèquement inférieur à celui de la fumigation au chlore. En général, deux méthodes différentes qui utilisent des réactifs liquides sont couramment utilisées. Une méthode largement utilisée est basée sur le lavage à l’éthanol et à l’eau de Javel à différentes concentrations pour différentes durées de temps20,21. Une autre méthode est basée sur l’application d’eau de Javel seulement21,22. Les deux méthodes sont principalement appliquées pour la stérilisation de surface des semences à petite échelle. Cependant, dans de nombreuses expériences, il est nécessaire de dépister de nombreuses lignées transgéniques d’Arabidopsis dérivées d’une transformation15,23 ou de filtrer en parallèle de nombreuses lignées transgéniques générées à partir de différentes transformations24,25. À notre connaissance, aucune méthode à base de liquide pour la stérilisation de surface des semences à haut débit n’a été publiée, ce qui constitue, bien que peu reconnu, un goulot d’étranglement important pour les approches de génomique fonctionnelle. Par conséquent, le développement de méthodes sûres, robustes et à haut débit pour la stérilisation de la surface des semences est une étape nécessaire et critique vers le succès de la caractérisation fonctionnelle de nombreux gènes à la fois.
À cette fin, dans la présente étude, une méthode améliorée de stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis est présentée. Cette méthode est sûre, peu coûteuse, très robuste et à haut débit, permettant de traiter 96 lignes indépendantes en une heure à partir du début de la stérilisation de la surface des graines jusqu’à la fin du semis dans des boîtes de Pétri. La méthode démontrée repose sur des instruments de laboratoire de base largement disponibles, tels qu’une pompe à vide, de la verrerie consommable et des articles en plastique. Cette méthode améliorée fournit à la communauté scientifique une approche sûre, simple et abordable pour rationaliser la stérilisation de la surface des semences avec un débit adéquat aux approches génomiques fonctionnelles modernes chez Arabidopsis et d’autres espèces végétales non modèles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis est de loin l’espèce modèle végétale la plus largement utilisée pour les études fonctionnelles. La stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis est une étape fondamentale nécessaire à cette fin. Ainsi, il est primordial d’établir des méthodes de stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis à haut débit pour traiter des dizaines à des centaines d’échantillons (par exemple, des lignées transgéniques, des écotypes ou des mutants) à la fois. Une méthode de stérilisation de la surface des graines basée sur l’élimination efficace du liquide dans les tubes avec un dispositif d’aspiration fait maison construit à partir d’une pompe à vide commune est présentée dans cette étude. En réduisant considérablement le temps de travail intensif avec cette méthode, il est possible de traiter plusieurs centaines d’échantillons en une journée avec peu d’effort. Les analyses chronologiques en série ont en outre indiqué une plage de temps très flexible de stérilisation de surface en maintenant des taux de germination élevés. Cette méthode pourrait être facilement adaptée à la stérilisation de surface d’autres types de petites graines avec une simple personnalisation du dispositif d’aspiration en fonction de la taille de la graine et de la vitesse souhaitée pour éliminer le liquide.

Afin d’évaluer le temps requis pour l’ensemble de la procédure de stérilisation des semences, les différences de temps pour la manipulation de liquides de 96 échantillons dans le protocole actuel ont été calculées et comparées aux méthodes de pipetage traditionnelles. Le résultat indique que le protocole actuel permet de gagner du temps, en réduisant le temps de manipulation du liquide à un quart de celui des protocoles traditionnels(tableau 1). Le tableau souligne en outre que le temps ...

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High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Ce protocole améliore la stérilisation de la surface des semences, une étape fondamentale de la génomique fonctionnelle de l’espèce modèle Arabidopsisthaliana. Les principaux avantages de cette technique sont la facilité et le débit élevé, permettant le traitement de centaines d’échantillons par jour. Avec quelques modifications simples, cette méthode peut être appliquée à de nombreuses autres espèces végétales modèles et non modèles.Pour les nouveaux utilisateurs, veuillez faire attention à la température du milieu et à la vitesse de centrifugation, car elles sont toutes deux essentielles à la survie des graines. Pour commencer, préparez de l’éthanol à 70 % en ajoutant de l’éthanol technique à 95 % à l’eau distillée et en mélangeant soigneusement. Ensuite, préparez une solution d’eau de Javel à 5% en ajoutant cinq millilitres d’eau de Javel domestique à 95 millilitres d’eau distillée stérile.Ensuite, ajoutez quelques gouttes de détergent non ionique à la solution d’eau de Javel et mélangez bien. Ensuite, préparez le milieu Murashige et Skoog demi-fort en ajoutant 2,2 grammes de poudre moyenne MS, y compris des vitamines et 10 grammes de saccharose dans 800 millilitres d’eau distillée. Ajustez le pH du milieu à 5,7 à l’aide d’un hydroxyde de potassium molaire, puis portez le volume à un litre en utilisant de l’eau distillée.Aliquote 500 millilitres du milieu dans une bouteille d’un litre et ajouter quatre grammes de gélose pour préparer un milieu solide. Après l’autoclavage, laissez le milieu refroidir à 50 à 53 degrés Celsius au bain-marie. Ensuite, versez-le dans des boîtes de Petri sous la hotte à flux laminaire.Pour préparer un milieu sélectif, ajoutez de la kanamycine au milieu et versez-le dans des boîtes de Pétri comme démontré précédemment. Pour installer l’aspirateur, connectez l’entrée de la pompe à vide à une extrémité d’un tube en polyéthylène d’une taille appropriée. Ensuite, connectez l’autre extrémité du tube à la sortie du couvercle bidirectionnel de la bouteille de décantation.Enveloppez hermétiquement la jonction du tube avec un film d’étanchéité pour assurer une connexion étanche à l’air. Ensuite, connectez un deuxième tube en polyéthylène à l’entrée du bouchon à vis de la bouteille de décantation. Ensuite, connectez l’autre côté du tube à la sortie d’une vanne d’aquarium équipée d’un mince tube en polyéthylène.Si nécessaire, enveloppez la jonction avec le film d’étanchéité pour éliminer les fuites d’air. Après avoir étiqueté deux lots de 48 tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec des nombres progressifs, ajoutez 100 à 200 graines d’Arabidopsis à chacun des 96 tubes de microcentrifugation stériles, à environ un à deux millimètres au-dessus du fond de l’extrémité conique du tube. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres, ajoutez environ un millilitre d’éthanol à 70% dans chaque tube et fermez soigneusement les couvercles.Agiter les tubes à une fréquence d’oscillation de huit hertz pendant trois minutes dans un agitateur. Retirez ensuite les adaptateurs du shaker et transférez-les dans le panier d’une microcentrifugeuse de paillasse pour faire tourner les graines à l’aide de la fonction d’impulsion. Après avoir transféré les tubes dans un rack, ouvrez tous les tubes sous la hotte à écoulement laminaire.Ne touchez pas la partie des couvercles qui s’insère dans les tubes pour éviter toute contamination. Ensuite, sous la hotte à flux laminaire, installez une pointe jaune stérile de 200 microlitres sur l’entrée de la vanne d’aquarium de l’aspirateur fait maison et allumez la pompe. Insérez la pointe juste au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de la succion du liquide.Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres, aliquotez un millilitre de solution d’eau de Javel à 5% dans chaque tube. Fermez les couvercles avant de replacer les tubes dans les adaptateurs de secoueur, puis secouez les tubes comme démontré précédemment. Après avoir fait tourner les graines à l’aide de la fonction d’impulsion d’une centrifugeuse de paillasse, installez une nouvelle pointe jaune stérile de 200 microlitres sur la valve de l’aquarium et allumez la pompe.Insérez la pointe au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de l’aspiration de la solution d’eau de Javel. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres, aliquotez un millilitre d’eau stérilisée dans chaque tube. Après avoir installé une nouvelle pointe jaune stérile de 200 microlitres sur la vanne de l’aquarium, allumez la pompe.Insérez la pointe juste au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de l’aspiration de l’eau. Enfin, aliquotez 500 microlitres d’eau stérilisée dans chaque tube et fermez tous les couvercles de la hotte à écoulement laminaire. Les graines sont maintenant prêtes à être semées.Si nécessaire, maintenez les tubes à température ambiante jusqu’à quelques heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer les graines avec 300 à 400 microlitres d’eau stérile dans une boîte de Pétri. Après avoir transféré 10 tubes, versez 1,5 à deux millilitres de milieu Murashige et Skoog à demi-force fondu sans antibiotiques dans chaque plaque.Faites tourbillonner rapidement la plaque pour répartir les graines et collez les plaques sur les côtés opposés. Enveloppez les assiettes dans du plastique ou du papier d’aluminium et placez-les au réfrigérateur pendant trois jours dans l’obscurité pour obtenir une germination uniforme. Les analyses de germination effectuées aux jours deux, trois, quatre et sept n’ont indiqué aucune différence significative entre 10 à 40 minutes de temps de stérilisation avec de l’éthanol à 70%.Cependant, lorsque le temps de stérilisation dépassait 40 minutes, les taux de germination diminuaient. En conséquence, les taux d’émergence du cotylédon vert ont également diminué. Sur la base de l’étude, trois minutes pour l’éthanol à 70% et trois minutes pour l’eau de Javel à 5% ont été sélectionnées comme temps minimum pour stériliser les graines.Pour démontrer que les graines utilisées à l’origine étaient contaminées par des micro-organismes, des graines non stériles ont été semées directement sur les plaques. Par rapport aux graines stériles, les graines non stériles ont montré un aspect fongique après deux jours, qui se sont répandus dans toutes les plaques après une germination de sept jours. Un test de contamination croisée effectué à l’aide d’une seule pointe de pipette stérile pour traiter différents échantillons de graines a montré qu’aucun cotylédon vert n’a été observé dans les graines de génotype Columbia-0 semées dans des plaques avec de la kanamycine.En parallèle, dans les graines de Columbia-0 semées dans des assiettes sans kanamycine, tous les cotylédons sont apparus verts après la germination. Ces résultats indiquent qu’il n’y a pas de transfert de contamination entre les échantillons malgré l’utilisation d’une seule pointe de pipette pour éliminer la solution stérile. Cette procédure est à la base de nombreuses autres méthodes de génomique fonctionnelle telles que la surexpression de gènes, l’édition du génome, la localisation subcellulaire, l’activité du promoteur et les interactions protéine-protéine et protéine-ADN.

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