Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
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Diese Forschung wurde von der Autonomen Provinz Trient durch eine Kernfinanzierung der Ecogenomics-Gruppe der Fondazione E. Mach finanziert.

1. Reagenzien und Medienvorbereitung
<ol><li>70% ige Ethanollösung zubereiten: Fügen Sie 737 ml 95% technisches Ethanol zu 263 ml destilliertem Wasser hinzu. Gründlich mischen. HINWEIS: Bereiten Sie 70% ige Ethanollösung auf einem nicht sterilen Arbeitstisch vor. VORSICHT: Ethanol ist leicht entzündlich und kann die Augen ernsthaft reizen. Von Flammen und Wärmequellen fernhalten. Bei Kontakt mit den Augen mit reichlich Wasser abspülen.</li>
	<li>5% ige Bleichlösung zubereiten: Fügen Sie 5 ml Haushaltsble...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

Die Sterilisation von Samen ist der grundlegende Schritt für funktionelle Studien bei Arabidopsis. Obwohl es häufig für viele verschiedene Zwecke durchgeführt wird, sind begrenzte Studien zur Hochdurchsatz-Samenoberflächensterilisation bei Arabidopsis verfügbar.
Bisher ist eine der Methoden mit dem höchsten Durchsatz die Verwendung von Chlorgas, das durch Mischen von Bleichmittel mit konzentriertem HCl erzeugt wird. Obwohl diese Methode nur eine begrenzte praktische Zeit erfordert, verw...

Arabidopsis ist eine diploide Pflanzenart aus der Familie der Brassicaceae. Sein relativ kurzer Lebenszyklus (zwei Monate pro Generation unter langen Wachstumsbedingungen), die geringe Pflanzengröße und die Selbstbestäubung mit der Produktion von Hunderten von Samen pro Pflanze haben es zur ersten grundlegenden Pflanzenmodellartgemacht 1,2. Darüber hinaus wurde sein Genom vollständig sequenziert3,umfangreiche reverse genetische Werkzeuge (gesättigte T-DNA, Transposon und chemisch mutagene Populationen) sind verfügbar4,5,6, und eine effektive Agrobacterium-vermittelteTransformation ist gut etabliert, um genügend transgene Linien für weitere nachgelagerte Arbeiten zu erhalten7 . So wurden in den letzten zwei Jahrzehnten große Fortschritte erzielt, indem Arabidopsis als Modellart verwendet wurde, um verschiedene Aspekte der Pflanzenbiologie auf molekularer Ebene zu sezieren, einschließlich natürlicher, genetischer und phänotypischer Variationen8,9.
Um Gene von Interesse an Arabidopsis funktionell zu charakterisieren, ist die Sterilisation der Samenoberfläche zur Beseitigung von Pilz- und Bakterienverunreinigungen die Voraussetzung für viele nachgeschaltete Protokolle, die axenische Kulturen erfordern. Genetische Transformation für die Überexpression10, Knock-Down (RNA-I11) oder Knock-Out (Genome Editing12,13) der Genfunktion, subzelluläre Lokalisation14, Promotoraktivität15,16, Protein-Protein17 und Protein-DNA-Interaktion18, um nur die häufigsten Anwendungen zu nennen, erfordern alle einen Samenoberflächen-Sterilisationsschritt. So spielt die Samenoberflächensterilisation trotz ihrer relativen Einfachheit in vielen Funktionsanalysen eine grundlegende Rolle.
Bisher wurden zwei Hauptkategorien von Saatgutoberflächensterilisationsverfahren entwickelt, die entweder auf der Gas- oder auf der Flüssigphasensterilisationbasieren 19. Während der Durchsatz der Gasphasen-Seed-Oberflächensterilisation mittel bis hoch ist, hat die Verwendung des gefährlichen ReagenzChlorgases als Oberflächensterilisationsmittel seine breite Anwendung behindert. Methoden, die auf der Flüssigphasensterilisation basieren, beruhen im Gegenteil auf milderen Chemikalien wie Ethanol und Bleichlösungen für die Oberflächensterilisation und werden häufiger verwendet, obwohl sie von Natur aus einen geringeren Durchsatz haben als die Chlorbegasung. Im Allgemeinen werden zwei verschiedene Methoden verwendet, die flüssige Reagenzien verwenden. Eine weitgehend verwendete Methode basiert auf dem Waschen mit Ethanol und Bleichmittel in unterschiedlichen Konzentrationen für unterschiedliche Zeitdauer20,21. Eine andere Methode basiert auf der Anwendung von Bleichmittel nur21,22. Beide Methoden werden hauptsächlich für die kleinräumige Sterilisation von Saatgutoberflächen angewendet. In vielen Experimenten ist es jedoch notwendig, viele transgene Arabidopsis-Linien, die von einer Transformation15,23 abgeleitetsind,zu screenen oder parallel viele transgene Linien zu screenen, die aus verschiedenen Transformationen erzeugt wurden24,25. Nach unserem besten Wissen wurde keine flüssigkeitsbasierte Methode zur Hochdurchsatz-Samenoberflächensterilisation veröffentlicht, die, wenn auch wenig erkannt, einen wichtigen Engpass für funktionelle Genomik-Ansätze darstellt. Daher ist die Entwicklung sicherer, robuster und Hochdurchsatzmethoden für die Sterilisation von Saatgutoberflächen ein notwendiger und kritischer Schritt für den Erfolg der funktionellen Charakterisierung vieler Gene auf einmal.
Zu diesem Zweck wird in der aktuellen Studie eine verbesserte Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen vorgestellt. Diese Methode ist sicher, kostengünstig, äußerst robust und mit hohem Durchsatz ausgestattet und ermöglicht die Handhabung von 96 unabhängigen Linien innerhalb einer Stunde vom Beginn der Samenoberflächensterilisation bis zum Ende der Saatgutaussaat in Petrischalen. Die demonstrierte Methode stützt sich auf weit verbreitete, grundlegende Laborinstrumente wie eine Vakuumpumpe, Verbrauchsglaswaren und Kunststoffwaren. Diese verbesserte Methode bietet der wissenschaftlichen Gemeinschaft einen sicheren, einfachen und erschwinglichen Ansatz zur Rationalisierung der Samenoberflächensterilisation mit einem Durchsatz, der für moderne funktionelle Genomikansätze bei Arabidopsis und anderen Nicht-Modellpflanzenarten geeignet ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis ist bei weitem die Pflanzenmodellart, die am häufigsten für funktionelle Studien verwendet wird. Die Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen ist ein grundlegender Schritt, der zu diesem Zweck erforderlich ist. Daher ist es von größter Bedeutung, Arabidopsis-Samenoberflächensterilisationsmethoden mit hohem Durchsatz zu etablieren, um Dutzende bis Hunderte von Proben (z. B. transgene Linien, Ökotypen oder Mutanten) gleichzeitig zu verarbeiten. In dieser Studie wird eine Saatgutoberflächensterilisationsmethode vorgestellt, die auf der effizienten Eliminierung von Flüssigkeit in Röhrchen mit einer selbstgebauten Absaugvorrichtung basiert, die aus einer herkömmlichen Vakuumpumpe besteht. Durch die drastische Reduzierung der arbeitsintensiven Hands-on-Zeit mit dieser Methode ist die Handhabung von mehreren hundert Proben an einem Tag mit wenig Aufwand möglich. Reihen-Zeitverlaufsanalysen zeigten ferner einen hochflexiblen Zeitbereich der Oberflächensterilisation durch Aufrechterhaltung hoher Keimraten. Diese Methode könnte leicht für die Oberflächensterilisation anderer Arten von kleinen Samen mit einfacher Anpassung der Saugvorrichtung an die Samengröße und die gewünschte Geschwindigkeit zur Beseitigung der Flüssigkeit angepasst werden.

Um den Zeitaufwand für das gesamte Saatgutsterilisationsverfahren zu beurteilen, wurden die Zeitunterschiede für liquid handling 96 Proben im aktuellen Protokoll berechnet und mit herkömmlichen Pipettiermethoden verglichen. Das Ergebnis zeigt, dass das aktuelle Protokoll Zeit spart und die Zeit für die Handhabung von Flüssigkeiten auf ein Viertel der Zeit mit den herkömmlichen Protokollen reduziert (Tabelle 1). Die Tabelle hebt weiter hervor, dass die Flüssigkeitsentfernungszeit im aktuellen Proto...

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High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Ein Hochdurchsatzprotokoll für die Oberflächensterilisation von Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) -Samen wird bereitgestellt, das die Liquid-Handling-Schritte mit einer einfachen Absaugvorrichtung, die mit einer Vakuumpumpe konstruiert ist, optimiert. Hunderte von Samenproben können an einem Tag oberflächensterilisiert werden.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Dieses Protokoll verbessert die Samenoberflächensterilisation, ein grundlegender Schritt in der funktionellen Genomik der Modellart Arabidopsisthaliana. Die Hauptvorteile dieser Technik sind Leichtigkeit und hoher Durchsatz, was die Verarbeitung von Hunderten von Proben pro Tag ermöglicht. Mit einigen einfachen Modifikationen kann diese Methode auf viele andere Modell- und Nicht-Modellpflanzenarten angewendet werden.Für Erstanwender achten Sie bitte auf die Temperatur des Mediums und die Zentrifugationsgeschwindigkeit, da beide für das Überleben des Saatguts entscheidend sind. Bereiten Sie zunächst 70% Ethanol vor, indem Sie 95% technisches Ethanol zu destilliertem Wasser hinzufügen und gründlich mischen. Als nächstes bereiten Sie 5% Bleichlösung vor, indem Sie fünf Milliliter Haushaltsbleiche zu 95 Millilitern sterilem destilliertem Wasser hinzufügen.Fügen Sie dann ein paar Tropfen nichtionisches Reinigungsmittel in die Bleichlösung hinzu und mischen Sie gründlich. Als nächstes bereiten Sie Murashige und Skoog Medium in halber Stärke zu, indem Sie 2,2 Gramm MS-Mediumpulver einschließlich Vitaminen und 10 Gramm Saccharose in 800 Milliliter destilliertem Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit einem molaren Kaliumhydroxid auf 5,7 ein und bringen Sie das Volumen dann mit destilliertem Wasser auf einen Liter.Aliquotieren Sie 500 Milliliter des Mediums in eine Ein-Liter-Flasche und fügen Sie vier Gramm Agar hinzu, um ein festes Medium herzustellen. Nach dem Autoklavieren das Medium in einem Wasserbad auf 50 bis 53 Grad Celsius abkühlen lassen. Dann gießen Sie es in Petrischalen unter der Laminar-Flow-Haube.Um ein selektives Medium zuzubereiten, fügen Sie dem Medium Kanamycin hinzu und gießen Sie es wie zuvor gezeigt in Petrischalen. Um den Sauger einzurichten, schließen Sie den Einlass der Vakuumpumpe an ein Ende eines Polyethylenrohrs einer geeigneten Größe an. Verbinden Sie dann das andere Ende des Rohres mit dem Auslass des Zwei-Wege-Deckels der Dekantierflasche.Wickeln Sie die Verbindung des Schlauches dicht mit einer Dichtungsfolie ein, um eine luftdichte Verbindung zu gewährleisten. Als nächstes verbinden Sie ein zweites Polyethylenrohr mit dem Einlass des Schraubverschlusses an der Dekantierflasche. Verbinden Sie dann die andere Seite des Rohres mit dem Auslass eines Aquarienventils, das mit einem dünnen Polyethylenrohr ausgestattet ist.Wickeln Sie die Verbindung bei Bedarf mit der Dichtungsfolie ein, um Luftleckagen zu vermeiden. Nachdem Sie zwei Chargen von 48 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit progressiven Zahlen markiert haben, fügen Sie 100 bis 200 Arabidopsis-Samen zu jedem der 96 sterilen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, etwa ein bis zwei Millimeter über dem Boden des konischen Endes des Röhrchens. Als nächstes geben Sie mit einer sterilen serologischen Pipette von 10 Milliliter etwa einen Milliliter 70% Ethanol in jedes Röhrchen und schließen Sie die Deckel vorsichtig.Schütteln Sie die Röhren mit einer Schwingungsfrequenz von acht Hertz drei Minuten lang in einem Shaker. Nehmen Sie dann die Adapter aus dem Shaker und geben Sie sie in den Korb einer Tischmikrozentrifuge, um die Samen mit der Pulsfunktion herunterzufahren. Öffnen Sie nach dem Umfüllen der Rohre in ein Gestell alle Rohre unter der Laminar-Flow-Haube.Berühren Sie nicht den Teil der Deckel, der in die Röhrchen passt, um eine Kontamination zu vermeiden. Setzen Sie dann unter der Laminar-Flow-Haube eine sterile 200-Mikroliter-Gelbe Spitze auf den Aquarienventileinlass des hausgemachten Aspirators und schalten Sie die Pumpe ein. Führen Sie die Spitze knapp über dem Niveau der Samen ein, um zu vermeiden, dass die Samen beim Saugen der Flüssigkeit berührt werden.Als nächstes wird mit einer sterilen serologischen Pipette von 10 Milliliter aliquot ein Milliliter 5%iger Bleichlösung in jedes Röhrchen gegeben. Schließen Sie die Deckel, bevor Sie die Röhrchen wieder in die Shaker-Adapter einsetzen, und schütteln Sie dann die Röhrchen wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie die Samen mit der Pulsfunktion einer Tischzentrifuge heruntergedreht haben, montieren Sie eine neue sterile 200-Mikroliter-Gelbspitze auf das Aquarienventil und schalten Sie die Pumpe ein.Führen Sie die Spitze über das Niveau der Samen ein, um zu vermeiden, dass die Samen beim Saugen der Bleichlösung berührt werden. Als nächstes wird mit einer sterilen serologischen Pipette von 10 Milliliter ein Milliliter sterilisiertes Wasser in jedes Röhrchen eingeteilt. Nachdem Sie eine neue sterile 200-Mikroliter-Gelbspitze auf das Aquarienventil montiert haben, schalten Sie die Pumpe ein.Führen Sie die Spitze knapp über dem Niveau der Samen ein, um zu vermeiden, dass die Samen beim Saugen des Wassers berührt werden. Schließlich aliquot 500 Mikroliter sterilisiertes Wasser in jedes Röhrchen und schließen Sie alle Deckel in der Laminar-Flow-Haube. Die Samen sind nun bereit für die Aussaat.Bei Bedarf halten Sie die Röhren bis zu einigen Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette die Samen mit 300 bis 400 Mikroliter sterilem Wasser in eine Petrischale geben. Nach dem Umfüllen von 10 Tuben gießen Sie 1,5 bis zwei Milliliter geschmolzenes halbfestes Murashige- und Skoog-Medium ohne Antibiotika in jede Platte.Schwenken Sie die Platte schnell, um die Samen zu verteilen, und kleben Sie die Platten auf gegenüberliegenden Seiten. Wickeln Sie die Platten in Plastik- oder Aluminiumfolie und stellen Sie sie für drei Tage im Dunkeln in einen Kühlschrank, um eine gleichmäßige Keimung zu erhalten. Keimungsanalysen, die an den Tagen zwei, drei, vier und sieben durchgeführt wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen 10 bis 40 Minuten Sterilisationszeit mit 70% Ethanol.Wenn die Sterilisationszeit jedoch 40 Minuten überschritt, nahmen die Keimraten ab. Entsprechend sanken auch die Grünen Keimblatt-Emergenzraten. Basierend auf der Studie wurden drei Minuten für 70% Ethanol und drei Minuten für 5% Bleichmittel als Mindestzeit für die Sterilisation der Samen ausgewählt.Um nachzuweisen, dass die ursprünglich verwendeten Samen mit Mikroorganismen kontaminiert waren, wurden unsterile Samen direkt auf den Platten ausgesät. Im Vergleich zu sterilen Samen zeigten unsterile Samen nach zwei Tagen ein pilzliches Aussehen, das sich nach einer siebentägigen Keimung über die Platten ausbreitete. Ein Kreuzkontaminationstest, der mit einer einzigen sterilen Pipettenspitze zur Verarbeitung verschiedener Samenproben durchgeführt wurde, zeigte, dass in den Columbia-0-Genotyp-Samen, die in Platten mit Kanamycin ausgesät waren, keine grünen Keimblätter beobachtet wurden.Parallel dazu erschienen in Columbia-0-Samen, die in Platten ohne Kanamycin gesät wurden, alle Keimblätter nach der Keimung grün. Diese Ergebnisse deuten auf keine Übertragung der Kontamination zwischen den Proben hin, obwohl eine einzige Pipettenspitze verwendet wurde, um die sterile Lösung zu entfernen. Dieses Verfahren ist die Grundlage für viele andere funktionelle Genomik-Methoden wie Genüberexpression, Genom-Editing, subzelluläre Lokalisierung, Promotoraktivität und Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen.

Research

JoVE Journal

Biology

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